液质联用ppt课件

液质联用 HPLC MS MS 液质联用 HPLC MS MS 仪器构造HPLC MS MS分析测试原理及功能仪器适用范围测试条件的选择谱图分析 HPLC MS MS示意图 自动进样器 色谱柱 PDA 阵列二极管检测器 离子化室 质量分析器 检测器 计算机 液质联用仪器结构 质谱 离子化室 液质联用仪器结构 四元泵 包括真空脱气机 柱温箱 PDA检测器 溶剂瓶箱 自动进样器 高效液相系统 高效液相系统 储液罐过滤与脱气装置高压输液泵梯度洗脱装置进样系统 1 过滤与脱气装置 洗脱液进入高压泵前应充分脱气 不脱气的影响 气泡留在泵中影响泵的正常工作 使洗脱液压力不稳定 增加基线的噪声 洗脱液中溶解的氧能破坏样品 同时氧在190 230nm有弱的吸收 从而减小检测器的灵敏度 当洗脱液流出色谱柱进入检测器样品池时由于洗脱压力下降生成气泡影响检测器的正常工作 常用的脱气方式 低压脱气法 吹氦脱气法 超声波脱气法 在线脱气 在线脱气 流动相流经小真空包中的半透膜管路 其中的气体透过半透膜 由真空泵抽走 从而达到脱去流动相中溶解空气的目的 2 梯度洗脱装置当一个样品的混和物的容量因子k范围很宽 等度冲洗时 一则时间太长 二则后面的峰较宽或扁平不便检测 此时选用梯度洗脱冲洗可改善样品的分离度 缩短分析时间 改善峰形和提高样品的最小检测量 a高压梯度洗脱将溶剂经高压泵加压后再混合的梯度装置 洗脱流量精度高 重复性好 不易产生气泡 混合器 B泵 A泵 梯度程序控制 b低压梯度洗脱装置在常压下 按预先设定的比例混合 再由高压泵输入色谱柱 重现性好 精度高 仪器组合简单 但混和前必须高度脱气 混合器 高压输液 四通 分离方法 液 固色谱法 liquid solidchromatography 反相和正相色谱法离子对色谱法离子交换色谱离子色谱法空间排斥色谱亲和色谱法胶束色谱法手性色谱法等 HPLC分离原理 最广的色谱法是反相色谱主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物 因为键合相表面的官能团不流失 溶剂的极性可以在很大范围内调整 因此应用范围很宽 十八烷基 C18 化学键合相是最常用的非极性键合相 反相键合相表面具有非极性烷基官能团 及未被取代的硅醇基 硅醇基具有吸附性能 剩余硅醇基的多寡 视覆盖率而定 因此 分离机制比较复杂 反相色谱分离原理 疏溶剂理论 当一个非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂相接触时 相互产生斥力 自由能 G 增加 熵减小 不稳定性增加 根据热力学第二定律 系统不稳定到稳定是自发的 因此 为了弥补熵的损失 溶质分子中的非极性基的取向 将导致在溶剂中形成一个 空腔 这种效应称为疏溶剂或疏水效应 该理论认为 在键合相反相色谱法中溶质的保留主要不是由于溶质分子与键合相间的色散力 而是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力 促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合 反相色谱的流动相 反相色谱法的流动相的极性大于固定相 通常是用甲醇 乙腈或四氢呋喃等极性溶剂与底剂水组成二元或多元流动相 在反相色谱中 由于固定相是非极性的 所以溶剂的极性增加 分离结构相近的组分时 极性大的组分先出柱 液相色谱的检测方法 紫外 可见光检测器光电二极管阵列检测器荧光检测器电化学检测器化学发光检测器红外光谱检测器等 离子化的方法 IonisationMethods 电子轰击电离EI化学离子化CI场电离 场解吸FD快原子轰击FAB基质辅助激光解析电离MALDI电喷雾电离ESI大气压化学电离APCI 电喷雾电离源ElectrosprayIonization ESI 在强电场下溶液带电形成带电液滴带电液滴体积不断缩小 溶剂蒸发 不断发生库仑爆炸 离子逸出表面 蒸发进入空间 电喷雾电离的实质 电荷浓缩效应 电喷雾电离的实质 电荷浓缩效应 电喷雾电离 电喷雾电离 ESI 蒸发 带电液滴 小液滴 ESI离子蒸发机理 大气压化学电离源AtmosphericPressureChemicalIonization APCI APCI离子化过程1 高电压放电针与载气和溶剂反应产生初级的离子O2 e O2 2eN2 e N2 2e2 通过一系列复杂的反应初级离子与溶剂分子反应生成溶剂离子H3O andCH3OH2 3 溶剂离子与待分析物分子形成 M H 或者 M H H3O M M H H2OOH M M H H2O 比较ESIEIAPCI电离源 大气压化学电离源 ESI和APCI的异同 离子产生的方式1 APCI利用电晕放电离子化 气相离子化 2 ESI利用液相离子化 带电液滴溶剂蒸发形成离子 能被分析的化合物类型不同1 APCI弱极性 小分子化合物 且具有一定的挥发性2 ESI极性化合物和生物大分子 ESI和APCI的异同 流速1 ESI0 001到0 25ml min 2 APCI0 2到2ml min 多电荷1 APCI不能生成一系列多电荷离子 所以不适合分析大分子 2 ESI能生成一系列多电荷离子 特别适用于蛋白 多肽类等生物分子 都属于软电离方式 能够提供分子量的信息 EI离子源质谱图 ESI离子源质谱图 M Na M K M H MW 582 离子源的选择 质量分析器 将离子源产生的离子按其质量和电荷比 m z 的不同进行分离 得到按质荷比 m z 排列而成的质谱图质量分析器的种类很多 有磁质量分析器 四级质量分析器 四级杆滤质器 飞行时间质量分析器 离子阱质量分析器等三重四极杆 串联质谱 TSQ质谱组件 QOO QO Q1Hyperquad Q3Hyperquad Q2CollisionCell DetectionSystem IonSourceInterface HeatedCapillary MassAnalyzer 仪器主要功能 定性分析 混合物 样品中的物质 分子量 分子结构 相对含量定量分析样品中的物质含量精密质量数的测定 高分辨质谱进行元素组成分析 任何一种同位素的质量并不是正好的整数 为了区分这四个离子 测量的质量的准确度需达到130ppm 即小数点后第四位是准确的 元素组成信息随着质量的增加而呈指数地上升 对质谱质量的测定准确度要求更高 12C 12 00000000 1H 1 007782506 14N 14 00307407 16O 15 99491475 m 43 0184Da的离子必定是C2H3O 不可能是C3H7 m 43 0058 或C2H5N m 42 9984 或CH3N2 m 43 0296 仪器适用范围 仪器配备决定其适用范围液相色谱的条件 色谱柱 离子源的类型 仪器测试条件的选择 液相色谱条件质谱条件 HPLC条件的选择 流动相 根据化合物类型选择流动相组成 甲醇 水 乙腈 水或甲醇 乙腈 水 DMF DMSO DCSO THF 某些化合物只有某种流动相体系才出峰一般正离子方式用甲醇 负离子方式用乙腈好些梯度的设定 梯度变化太快对离子化效率影响很大 相应源参数也应该改变 所以恒定比例流动相能满足分离分析要求时 尽量不用梯度 尤其定量分析时 流动相的选择 流动相中加入甲酸 乙酸等可提高正离子化效率 液质联用中 流动相有时需要加入缓冲盐ACH3COONH4BHCOONH4CKH2PO3是否加酸不是绝对的 具体应根据LC的分离情况 样品在酸性条件下的稳定性等决定 通常pH值低时 M H 比率高 pH值高时 M Na M K 或 M NH4 比率高 色谱柱的选择 FlowRateColumnI D 1 0mL min4 6mm0 5mL min3 0mm0 2mL min2 1mm50mL min1 0mm 10mL minCapillary LC流速一般根据色谱柱规格和电离方式来确定 APCI0 2 2ml minESI5 300 l minroutinely 1ml minpossible 离子化方法选择 根据样品性质确定离子化方式适合ESI的样品类型 高极性化合物 蛋白质 肽类 低聚核苷酸等生物分子 胺类 季铵盐等 含杂原子化合物如氨基甲酸酯等适合APCI的样品类型 弱极性 中等极性的小分子 如脂肪酸 邻苯二甲酸等 含杂原子化合物如氨基甲酸酯 脲等ESI不适合的化合物 极端非极性化合物如苯等 APCI不适合的化合物 非挥发性或热稳定性差的样品 ESI离子源的检测条件 ESI一般用于极性物质的检测碱性化合物 NH2 M H 酸性化合物 CO2H OH M H 正离子方式 分析碱性化合物用有机酸调整pH值如 甲酸或乙酸负离子方式 分析酸性化合物用碱调整pH值如 氨水 扫描类型选择 Full ScanMassSpectrometrySingleIonMonitoring SIM SelectedReactionMonitoring SRM Full ScanMassSpectrometry AdvantageProvidesMWInformation DisadvantageLowdutycycle Scanning PassAll PassAll Full ScanMSofBuspirone Buspirone 丁螺环酮 C21H31N5O2MW 385 M H M Na SingleIonMonitoring SIM AdvantagesTargetedAnalyteMonitoringHighDutyCycleSimple DisadvantagesCansufferfrominterferencesNotassensitiveorselectiveasSRM seebelow Fixedm z PassAll PassAll SelectedReactionMonitoring SRM AdvantagesTargetedAnalyteMonitoringHighDutyCycle Simultaneous MonitoringofMultipleTransitions DisadvantageNo advanced structuralinformation Q1 Q2 Q3 操作程序 清洗仪器及管路 配样 稀释 质谱条件优化 保存方法 液质联用方法设置 平衡色谱柱 分析结果 进样品 结果无效 液质联用与气质联用的区别 气质联用仪 GC MS 适宜分析小分子 易挥发 热稳定 能气化的化合物 用电子轰击方式 EI 得到的谱图 可与标准谱库对比 液质联用 LC MS 高沸点 热不稳定及大分子量化合物 包括蛋白 多肽 多聚物等 的分析测定没有商品化的谱库可对比查询 只能自己建库或自己解析谱图离子源主要有 ESI APCI等 液质联用与气质联用的区别 液质联用与气质联用的区别 主要性能指标 能精确测量分子量至小数点后3位 与仪器配置的液相色谱联用进行化合物的液质联用分析 可以采用注射泵和进样环自动进样分析采用了新型高性能API源 离子传输光学系统 低噪声检测系统和功能强大的数据处理软件Xcalibur 三级四极杆质量分析器 所有扫描方式可选择可变峰宽 质量范围30 1500Da 扫描速度2000Da 秒 可进行Q1或Q3的全扫描 以ESI或APCI方式通常只能得到样品的分子离子峰 因此单极液质联用仪 LC MS 提供的信息很少 为获得更多的能反映分子结构的离子碎片 需将分子离子进一步打碎后再检测 这便是多级质谱 MS MS 的概念 二级质谱 液质联用谱图 准分子离子 总离子流图 液相色谱图 全扫描 单波长扫描 一级质谱图 二级质谱图 总离子强度 质量范围 母离子质量 检测离子模式 碰撞能量 母离子 碎片离子 二级质谱 质谱图分析 质谱中的离子分子离子 M M e M z 1时 其m z等于天然丰度最大的同位素的原子量之和 碎片离子 广义上指除分子离子以外的所有离子 重排离子 经过重排 断裂一个以上化学键所生成的离子 质谱中的离子 母离子与子离子 任何一个离子进一步裂解为质荷比较小的离子 前者是后者的母离子或前体离子 后者是前者的子离子 多电荷离子 如z 2的离子准分子离子 M H M H M Na M K M H CH3OH 等同位素离子 非单一同位素的元素在电离过程中产生同位素离子 同位素离子构成同位素峰簇 解析质谱时常根据某些离子的丰度比确定化合物的分子式 同位素峰 化学上 氖的原子量为20 2 质谱上 氖不在m z20 2处出峰 而是在m z20和m z22处各出一个峰 该峰的相对强度为10 1 为什么 质谱测定的是微观离子 不是宏观上的平均的概念 常见元素的天然同位素丰度 同位素峰的识别 同位素分布的二项式规则 对A 1和A 2元素 推导出原子数目 b A 1或A 2同位素的天然丰度n 质谱峰中A 1或A 2元素的个数 同位素峰的识别 例 79Br100 81Br98 100 MM 2M 4M 6Br n 1 11Br2 n 2 121Br3 n 3 1331 同位素峰的识别 例 35Cl100 37Cl32 5 MM 2M 4M 6Cl n 1 10 325Cl2 n 2 10 6500 106Cl3 n 3 10 9750 3170 034 ESI质谱图实例 正离子模式1 M H 2 M Na M K M H 3 M H CH3OH 4 2M H 负离子模式1 M H 2 2M H