快速检测H5亚型鸭流感病毒

序号： 编码： 第十届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书作品名称：用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）新技术 快速检测H5亚型鸭流感病毒 学校全称： 华南农业大学 申报者姓名 （集体名称）： 谢义涵 吴永锋 周穗婷 甘燕贞 李宝红 冀君 类别：自然科学类学术论文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作A类 科技发明制作B类 说 明1申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。3表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4序号、编码由第十届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会填写。5学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上（文章版面尺寸14.522cm），附于申报书后，论文不超8000字，调查报告不超15000字。6作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。7其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。A2申报者情况（集体项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写；2申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列；3本表中的学籍管理部门签章视为申报者情况的确认。申报者代表情况姓名谢义涵性别男出生年月1986年12月学校华南农业大学系别、专业、年级05级动物科学(生物工程方向)学历本科学制4年入学时间2005年9月作品名称用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）新技术快速检测H5亚型鸭流感病毒毕业论文题目鸡的传染性法氏囊GB基因的克隆和序列分析通讯地址华南农业大学动物科学学院邮政编码510640办公电话常住地通讯地址华南农业大学华山宿舍24栋206邮政编码510640住宅电他作者情况姓 名性别年龄学历所在单位吴永锋男24本科华南农业大学动物科学学院周穗婷女23本科华南农业大学动物科学学院甘燕贞女22本科华南农业大学动物科学学院李宝红女21本科华南农业大学动物科学学院冀君男24本科华南农业大学动物科学学院资格认定学校学籍管理部门意见以上作者是否为2009年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。是否 （部门签章）2009年4 月13 日院、系负责人或导师意见本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果是否负责人签名：2009年4 月13 日B1申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）新技术快速检测H5亚型压流感病毒作品分类（ D）A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路目的是建立一种快速、简便、特异、灵敏的适合于基层实验室使用的H5N1亚型鸭流感病毒的检测方法。基本思路:根据Genbank中注册的H5N1亚型流感病毒HA基因保守区的序列，设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增，建立RT-LAMP反应体系，优化LAMP反应条件, 扩增产物加入核酸染色剂SYBR green，根据颜色反应判断结果（检测结果：橙黄色为阴性，偏绿色为阳性）；还可以加入焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀，根据反应管中浊度的变化判断结果，从而建立一种新型的结果肉眼可视的鉴别鸭流感病毒的方法。作品的科学性、先进性及独特之处近两年来，LAMP方法已广泛使用与各种病毒的快速检测。本项目的指导老师谢青梅已建立了鸭瘟的LAMP检测方法，研究论文发表在“Research in Veterinary Science”上，该研究具有科学性和先进性。该研究建立的LAMP 方法的优点:(1)只需一恒定温度就能扩增反应。不需要特殊试剂,不需要预先进行双链DNA 的变性；(2)特异性高；(3)快速、高效扩增； (4)步骤简单 （5）设备要求简单，不需要昂贵的PCR仪和凝胶成像系统；(6)鉴定结果可用肉眼观察，适用于基层简单实验室使用。这也是本项目的独特之处。作品的实际应用价值和现实意义为广大基层养殖户、畜禽场实验室建立一种快速、准确、简便的鸭流感病毒的鉴别诊断新方法，快速、及时地完成该疫病的检测工作。学术论文文摘鸭流感的暴发和流行给畜牧业造成了巨大的经济损失，对人类健康造成了严重威胁。快速诊断和及时监测是控制流感的首要步骤。本研究建立一种新型、简便、灵敏且特异的环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification Method，RT-LAMP）用于H5亚型鸭流感病毒的检测。根据Genbank中注册的H5N1亚型鸭流感病毒HA基因保守区的序列，设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增，建立RT-LAMP反应体系，优化LAMP反应条件，等温扩增反应条件为65 保温60min。反应结果肉眼可见。在扩增产物加入焦磷酸离子和溶液中镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀，可见反应管中浊度的变化；或者在扩增后产物加入核酸染色剂SYBR green，检测结果阳性呈绿色，阴性为橙黄色；同时用特异性内切酶Kpn进行酶切鉴定。用已建立的RTLAMP技术检测临床样品，检测结果与RTPCR方法符合率均达到100。RT-LAMP技术整个检测过程只需12h，不需要贵重的PCR仪和成像系统，仅需要一恒温水浴锅即可完成试验。通过特异性、敏感性试验，验证了建立RT-LAMP技术可以作为一种操作简单，灵敏性、特异性高的检测H5亚型鸭流感病毒的技术，适合于检验设备简陋的生产厂场、基层检验检疫单位和防疫部门使用。 作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励2009年“挑战杯”华南农业大学大学生课外学术科技作品竞赛“特等奖”鉴定结果请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录Dukes JP, King DP, Alexandersen S.Novel reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. Arch Virol,2006,(151):1093-1106曾冰冰，肖凯军，石 磊等. LAMP方法在食品微生物检测中的应用. 现代食品与药品杂志，2007，17（1）：2225申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）新技术快速检测H5亚型鸭流感病毒科研管理部门签章 年 月 日 C.当前国内外同类课题研究水平概述说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写；2.填写此栏有助于评审。鸭流感是由禽流感病毒引起的一种烈性传染病, 鸭流感不仅严重影响养鸭业的发展, 而且会影响人类健康。建立快速，敏感，特异的检测鸭流感病毒的方法对于防控鸭流感有着重要意义。Notomi T等(2000)开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(LAMP)。其特点是针对靶基因的6个区域, 设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温(65左右)中反应1h，即可完成核酸扩增反应，反应结果直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断，日本已利用这种特性研制出专门用于LAMP检测的实时监控浊度仪,可以实现对LAMP扩增过程的全程实时监控(Manmohan et al，2004；Yasuyoshi et al，2004； Dukes et al，2006)。也有研究者通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果（Dukes et al，2006)。而不需模板热变性(Nagamine et al，2001)、长时间温度循环、凝胶电泳、紫外观察等过程。目前，国外已有较多的此类报道，并建立了专门的官方网站。而国内起步较晚，2002年和2003年北京奶牛中心2次引进LAMP法检测胚胎的性别(王海浪等，2003)。国内外有许多文献报道该技术在不同细菌（Hung et al，2005）及病毒检测中成功应用的实例，如对西尼罗病毒、SARS病毒、麻疹病毒、口蹄疫病毒、山药嵌纹病毒的检测以及登革病毒的分型等（Hong et al，2004；Manmohan et al，2004；Shiro et al，2004； Manmohan et al，2005； Motoko et al, 2005；J.P.Dukes et al，2006；Ji jun et al,2008）。同时，人们还在不断对LAMP技术进行改良，使其能在疾病基因诊断、食品分析(曾冰冰等，2007)和环境监测等领域更好地发挥作用。国外有报道用RTLAMP技术检测人流感H1、H2和H3亚型流感病毒（Leo et al，2005），还用于鉴定流感A、B型的诊断（Masahiro et al，2006）。国内还未见用于该方法用于鸭流感病毒的检测。D.推荐者情况及对作品的说明说明：1由推荐者本人填写；2推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组集体推荐亦可）；3推荐者填写此部分，即视为同意推荐；4推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓 名毕英佐性别男年龄62职称教授、博导工作单位华南农业大学动物科学学院通讯地址广州天河五山483号华南农业大学动物科学学院邮政编码510642单位电宅电荐者所在单位签章毕英佐老师是我校教授、博士生导师。 （签章）2009 年4月13 日请对申报者申报情况的真实性作出阐述该作品是由谢义涵同学为主的六位同学共同完成，作品内容真实，数据可靠，结论正确。请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价该作品建立的鸭流感病毒RT-LAMP技术操作简单、灵敏性好、特异性高，该方法的检测灵敏度与荧光定量PCR方法相当，适合于检验设备简陋的生产厂场、基层检验检疫单位和防疫部门使用，技术水平高，具有很好的使用价值和推广应用前景。其它说明推荐者情况姓 名张永亮性别男年龄42职称教授、博导工作单位华南农业大学动物科学学院通讯地址广州天河五山483号华南农业大学动物科学学院邮政编码510642单位电宅电话推荐者所在单位签章张永亮老师是华南农业大学动物科学学院院长，动物营养系教授、博士生导师。全国动物生理生化分会副理事长、农业生化与分子生物学分会理事、吉林省生化与分子生物学理事、全军专业生化委员会委员，中国兽医学报编委。 （签章）2009年4月13 日请对申报者申报情况的真实性作出阐述本作品是华南农业大学本科课外科技创新论文，在动物科学学院基因工程实验室完成，利用了本实验室成熟的实验技术和已有研究材料，选题具有实践指导意义。谢义涵等六位同学利用课余时间积极参与本研究室的科研工作，熟悉和掌握了各项基因工程实验技术。内容真实，数据可靠，结论正确。请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价本作品选题具有实践指导意义，特别对现有鸭流感的快速诊断防治提供了新思路，为基层实验室提供了一种简便可靠的检测鸭流感病毒的新方法。该项目的完成体现了六位同学具有一定的基因工程实验技能，对RT-LAMP方法的原理和方法的建立也能较好的掌握。本研究成果对生产实践具有很好的理论和实践指导作用，有推广应用前景。其它说明学校组织协调机构确认并盖章 （团委代章） 年 月 日 校主管领导或校主管部门确认盖章 年 月 日E大赛组织委员会秘书处资格和形式审查意见组委会秘书处资格审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处形式审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处审查结果合格 不合格 负责人（签名） 年 月 日42用逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）新技术快速检测H5亚型鸭流感病毒作者：谢义涵 吴永锋 周穗婷 甘燕贞 李宝红 冀 君指导老师：谢青梅副教授作者单位：华南农业大学动物科学学院，广州，510640【摘要】：鸭流感的暴发和流行给畜牧业造成了巨大的经济损失，对人类健康造成了严重威胁。快速诊断和及时监测是控制流感的首要步骤。本研究建立一种新型、简便、灵敏且特异的环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification Method，RT-LAMP）用于H5亚型鸭流感病毒的检测。根据Genbank中注册的H5N1亚型鸭流感病毒HA基因保守区的序列，设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增，建立RT-LAMP反应体系，优化LAMP反应条件，等温扩增反应条件为65 保温60min。反应结果肉眼可见。在扩增产物加入焦磷酸离子和溶液中镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀，可见反应管中浊度的变化；或者在扩增后产物加入核酸染色剂SYBR green，检测结果阳性呈绿色，阴性为橙黄色；同时用特异性内切酶Kpn进行酶切鉴定。用已建立的RTLAMP技术检测临床样品，检测结果与RTPCR方法符合率均达到100。RT-LAMP技术整个检测过程只需12h，不需要贵重的PCR仪和成像系统，仅需要一恒温水浴锅即可完成试验。通过特异性、敏感性试验，验证了建立RT-LAMP技术可以作为一种操作简单，灵敏性、特异性高的检测H5亚型鸭流感病毒的技术，适合于检验设备简陋的生产厂场、基层检验检疫单位和防疫部门使用。【关键词】：H5亚型鸭流感病毒 HA RT-LAMP【正文】鸭流感是由禽流感病毒引起的一种烈性传染病, 鸭流感不仅严重影响养鸭业的发展, 而且会影响人类健康。建立快速，敏感，特异的检测鸭流感病毒的方法对于防控鸭流感有着重要意义。Notomi T等(2000)开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(LAMP)。其特点是针对靶基因的6个区域, 设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温(65左右)中反应1h，即可完成核酸扩增反应，反应结果直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断，日本已利用这种特性研制出专门用于LAMP检测的实时监控浊度仪,可以实现对LAMP扩增过程的全程实时监控(Manmohan et al，2004；Yasuyoshi et al，2004； Dukes et al，2006)。也有研究者通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果（Dukes et al，2006)。而不需模板热变性(Nagamine et al，2001)、长时间温度循环、凝胶电泳、紫外观察等过程。目前，国外已有较多的此类报道，并建立了专门的官方网站。而国内起步较晚，2002年和2003年北京奶牛中心2次引进LAMP法检测胚胎的性别(王海浪等，2003)。国内外有许多文献报道该技术在不同细菌（Hung et al，2005）及病毒检测中成功应用的实例，如对西尼罗病毒、SARS病毒、麻疹病毒、口蹄疫病毒、山药嵌纹病毒的检测以及登革病毒的分型等（Hong et al，2004；Manmohan et al，2004；Shiro et al，2004； Manmohan et al，2005； Motoko et al, 2005；J.P.Dukes et al，2006）。同时，人们还在不断对LAMP技术进行改良，使其能在疾病基因诊断、食品分析(曾冰冰等，2007)和环境监测等领域更好地发挥作用。国内还未见用于流感病毒的检测。国外有报道用RTLAMP技术检测人流感H1、H2和H3亚型流感病毒（Leo et al，2005），还用于鉴定流感A、B型的诊断（Masahiro et al，2006）。LAMP法具有许多迄今为止的扩增方法无法比拟的优点：（1）只需一恒定温度就能扩增反应。不需要预先进行双链DNA的变性。（2）高特异性:应用六个区段，四条引物，并且这六个区段的顺序也有规定。原理上LAMP法扩增的特异性很高，因此可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否,即能够进行细菌或病毒的定性检测。（3）快速、高效扩增:整个扩增在不到1h即可完成，且产率可达到0.15mg/ml。为提高LAMP反应的速度，Nagamine等（2002）通过2条环状引物加快LAMP的反应，使反应时间比原来缩短近一半，提高了检测效率。（4）灵敏度高：扩增模板可达10拷贝。（5）步骤简单：扩增RNA只要在DNA基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶，就能够完全像DNA基因扩增那样，一步实现RNA扩增（Hiroko et al，2006；H. Soliman et al，2006；Kazuya et al，2007），反应不需PCR仪和特殊试剂。（6）鉴定简便：在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物焦磷酸镁沉淀它有极高的特异性,只要用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能够判断扩增与否。本文优化了RT-LAMP技术检测鸭流感病毒的反应条件，并验证了准确性获得一种检测H5亚型鸭流感病毒的有效快速的可靠方法。1、材料和方法1.1 环介导等温扩增反应(LAMP)的实验原理环介导等温扩增反应(LAMP) 是对靶基因的6 个特异部位设定4 种引物，利用具有链置换活性的Bst DNA 聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效扩增。LAMP反应所用到的引物，设计起来比较复杂，而且是实现扩增的关键所在。引物总共有四条，内外引物各两条。如图1所示，上游的内引物FIP (Forward Inner Primer )由F1c（F1的互补序列） 、F2和TTTT连接子组成；下游的内引物BIP（Backward Inner Primer）由B1c（B1的互补序列）、B2和TTTT连接子组成；上游的外引物F3（Forward Outer Primer）和下游的外引物B3（Backward Outer Prime）分别为F3c和B3c的互补序列。图1 靶序列上的6段区域及四种特异性引物各区段的引物设计规则与PCR相同。设计时应注意碱基的构成、GC含量、二聚体结构、引物序列的长度、引物与引物间的距离、Tm值（用毗邻法求得）、3末端不可出现富AT结构等，此外扩增的区段最好控制在300bp以内。每条引物的长度控制在1726nt之间；GC含量最好控制在4050之间；F1c和B1c的Tm值大约为6466，F2、B2、F3、B3的Tm值大约为5961；F2与B2的5端相距120180bp，F2与F3、B2与B3相距020bp。LAMP反应原理:（1）内引物 FIP首先和 F2c结合，具有链置换活性的Bst DNA聚合酶将一条单链的DNA置换下来。（2）结合到DNA链上的FIP引物启动互补链的合成，形成双链结构。（3）F3再和 F3c结合，启动链置换反应，释放出 1条FIP连接的互补链，在其一端能够形成环状结构。（4）F3引物结合到靶DNA上形成双链DNA。（5）释放出的1条FIP连接的互补链，在其一端能够形成环状结构。（6）在步骤（5）中形成的具有环状结构的单链可作为模板，在另一端结合 BIP和 B3合成 1条双链。（7）B3引物结合到步骤（5）形成的具有环状结构的单链中，形成双链DNA，并置换出1条FIP和BIP连接的互补链。（8）在步骤（6）中置换出的互补链，在其两端均形成环状结构，形成哑铃状的DNA。不过哑铃结构很快与其一端F1c和F1互补，而由自我引物延伸机制合成1种双链的茎环结构DNA，这种茎环结构的双链DNA是循环反应的原料。循环反应中(9-11)，首先 FIP和双链茎环结构DNA中的环状结构结合成1种有缺口的过渡性茎环结构DNA，该结构在茎上含有靶序列的1个额外反向复制序列，在对面的末端，通过 BIP形成 1个环状结构。在随后的自我引物置换延伸合成过程中，在内引物作用下，开始循环反应，茎的长度和环的个数都逐渐增加，最后的产物为茎环DNA组成的混合物，即含有若干倍茎长度茎环结构和类似花椰菜的结构(含有在同一链上由退火形成的，在靶序列的交替反向重复序列之间的多重环状结构)。其结果可以利用加SYBR Green荧光染料后颜色变化或焦磷酸镁浊度变化来判断，可以直接通过肉眼观察来判断扩增与否。1.2 病毒鸭流感病毒株（A/duck/PT/2008(H5N1)；所有与病毒有关的试验均在广东温氏食品集团P3实验室完成。1.3 常用试剂AMV 反转录酶（5U/ul）、HRP RNA 酶抑制剂（40U/ul）及相应缓冲液，dNTPs（2.5mM each）、DNA Marker DL2000为TaKaRa产品。Bst DNA聚合酶为NEB公司产品。RNA提取试剂TRIzol Reagent为Invitrogen公司产品。DEPC和饱和酚购自上海生工生物工程公司；氨苄青霉素、链霉素、溴化乙锭（EB）购自宝泰克生物科技有限公司；琼脂糖购自基因有限公司。1.4 主要仪器及设备PCR Express Gradient PCR仪，法国HYBAID公司水浴锅，上海一恒科技有限公司。1.5 引物的设计和合成 根据GenBank上公布的H5亚型鸭AIV HA基因序列，比对后选取保守区域，用 Primer Premier 5.0设计两条外引物（F3、B3）和两条内引物（FIP、BIP，引物FIP由F1c、F2和TTTT连接子组成，引物BIP由B1c、B2和TTTT连接子组成）。引物序列：F3：5-GCCATTCCACAACATACACCC-3FIP：5-CTGAGTCCAGTCGCAAGGACTAATCTG-TTTT-TCTCACCATCGGGGAATGCC-3BIP：5-GGATGGCAGGGAATGGTAGATGG-TTTT-GTATCCACTCCCCTGCTCATTGC-3B3：5-TGGTGACTCCATCTATTGCCT-3引物在靶序列H5亚型鸭AIV HA基因保守区序列中的对应位置：（下划线加粗部分为各引物序列，加粗边框部分为Kpn酶切位点）： F3F2 5-GCCATTCCACAACATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGA-33-CGGTAAGGTGTTGTATGTGGGAGAGTGGTAGCCCCTTACGGGGTTTATACACTTTAGTTTGTCT-55-TTAGTCCTTGCGACTGGACTCAGAAATACCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGAC-33-AATCAGGAACGCTGACCTGAGTCTTTATGGGGAGTTTCTCTCTCTTCTTCTTTTTTCTCTCCTG-5F1c B1c 5-TATTTGGAGCTATAGCAGGGTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGG-33-ATAAACCTCGATATCGTCCCAAATATCTCCCTCCTACCGTCCCTTACCATCTACCAACCATACC-55-GTACCACCATAGCAATGAGCAGGGGAGTGGATACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGC-33-CATGGTGGTATCGTTACTCGTCCCCTCACCTATGCGACGTCTGTTTCTTAGGTGAGTTTTCCGT-5B25-ATAGATGGAGTCACCA-33- TATCTACCTCAGTGGT-5B31.6 RT-LAMP方法的建立1.6.1 病毒的繁殖将H5N1 亚型鸭流感病毒用灭菌的生理盐水分别以500倍稀释后，以尿囊腔途径接种11日龄SPF鸡胚，0.2 ml/胚，在37恒温箱继续孵育，弃去24h内死亡鸡胚，无菌收获24-72h内感染胚尿囊液，用鸡红细胞测定其血凝效价，-80保存备用。1.6.2 病毒RNA的提取按Invitrogen公司TRIzol LS Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书进行。在1.5 mL微量离心管中加入250 L病毒尿囊液和750 L TRIzol，充分混匀，室温放置10 min；加入200 L氯仿，激烈摇动15 sec，室温静置5 min后，412 000 r/m离心15 min；取上清液于一新的灭菌1.5 mL微量离心管，加500 L异丙醇，充分混匀，室温放置10 min，412 000 r/m离心10 min；弃去上清液，沉淀用70%乙醇750 L，轻轻混匀，洗涤1次，412 000 r/m离心10 min；弃去上清，风干；用10 L经DEPC处理的无RNA酶的三蒸水溶解沉淀，直接用于RT-LAMP或-80保存备用。1.6.3 H5N1亚型鸭流感病毒HA基因保守区的LAMP扩增分别用Lamp引物以抽提的RNA为模板，扩增H5N1亚型病毒的HA基因片段，25L LAMP反应体系的组成为（设阴性对照）： 10buffer2.5 LdNTPs（2.5mM）4 LRNA1 LFIP（10M）2 LBIP（10M）2 LF3（10M）0.5LB3（10M）0.5LBst DNA聚合酶1 LddH2O12.5 L环介导等温反应在水浴中进行。反应条件为：65 1h，80 10min终止反应。扩增产物用2%琼脂糖凝胶（含0.5 g/mL的溴化乙锭）电泳检测，电泳条件为80V、30 min。用VL凝胶成像系统观察并记录结果。1.6.4 LAMP扩增产物的酶切鉴定在25L反应体系中加入以下组分：10buffer2 LKpn酶1 LH5的扩增产物 5 LddH2O12 L总体积25L将上述反应物混匀离心后，37反应2h。反应后取5L反应液，用2%琼脂糖凝胶（含0.5 g/mL EB）电泳对酶切反应产物进行检测。1.7 LAMP反应条件的优化（1） 不同反应时间在25L反应体系中加入同1.6.3步骤的混合物，设阴性对照，混匀离心后，将反应物放在65水浴锅中，分别在反应后10min、30min、40min、60min后取出。待反应产物全部取出后，取5L反应液，用2%琼脂糖凝胶（含0.5 g/mL EB）电泳对反应产物进行检测。（2）不同反应温度同样，在25L反应体系中加入反应混合物，设阴性对照，混匀离心后，将反应物分别放在55、60、65水浴锅中反应1h，80 10min。反应后取5L反应液，用2%琼脂糖凝胶（含0.5 g/mL EB）电泳对反应产物进行检测。1.8 特异性试验 分别提取NDV（鸡新城疫病毒）、IBV（鸡传染性支气管炎病毒）、H5亚型AIV的核酸，用H5 lamp引物进行RTLAMP检测。1.9 灵敏度试验将抽提出的病毒RNA进行10倍递进稀释后作为RTLAMP反应的模板，反应后产物进行凝胶电泳检测。1.10 阳性样品的RTLAMP检测对3份H5亚型鸭AIV阳性样品进行了RTLAMP检测。1.11 酶切鉴定和可视化结果 在20L反应体系中加入以下组分：10buffer 2 L, Kpn酶 1 L, H5 AIV的扩增产物 5 L, ddH2O 12 L,上述反应物混匀离心后，37反应4h。反应后取5 L反应液，用Kpn对H5亚型病毒LAMP产物进行消化，用2%琼脂糖凝胶（含0.5 g/mL EB）电泳对酶切反应产物进行检测。选择一阳性管在反应前另加入SYBR Green I 染料或 4mM Mg2+，反应结束后观察阳性管与对照管的差异。1.12 H5亚型鸭AIV待测样品的RT-LAMP与RTPCR检测方法比较用本研究建立的RTLAMP技术检测临床样品6份，RTPCR方法按传统步骤进行。2 结果与分析 2.1最佳反应温度和反应时间的优化 本试验设定了55、60、65三个反应温度；结果发现，在这三种温度条件下均能进行LAMP反应，但是，不同温度条件下，扩增产物的含量有差异；这表明，Bst DNA聚合酶在不同温度下活性大小不同，在65下，活性最大，而在55时，反应活性较小。因此，反应在5065范围内均可发生反应，而反应最佳温度为65。以65为反应温度，分别在30min60min时间内不同时间段进行LAMP反应终产物的电泳检测。图中所见，在反应20min后，可见明显的梯状条带，反应30min60min后梯状条带逐渐变亮，在反应60min后，梯状条带表现最明显。因此，RT-LAMP扩增反应的最佳时间为60mim。图1 不同反应温度条件下H5亚型鸭AIV RT-LAMP扩增结果M：DNA分子量标准DL2000；13分别为在65、60、55条件下H5亚型基因的RT-LAMP扩增产物， 4为阴性对照；图2 不同反应时间下H5亚型鸭AIV RT-LAMP扩增结果M：DNA分子量标准DL2000；，14分别为反应60min、40min、30min、20min后的LAMP扩增结果，5为阴性对照22 RT-LAMP的灵敏性、特异性测定 用H5 lamp引物分别对H5 鸭AIV、NDV、IBDV、IBV和H9 AIV进行 RTLAMP检测，结果显示：本试验设计的H5 lamp引物具有高度的特异性，只有针对H5亚型鸭AIV才出现目的条带，其它病毒均不扩增，如图3。将抽提出来的RNA产物进行10倍递进稀释至10-7，进行RTLAMP反应，即使在很低拷贝的模板RNA存在时（10-7）， 仍有微弱的产物带，并且可以在紫外灯下进行对比（图4），可检测到的浓度最低为1ng/ml。图 3 H5亚型RT-LAMP检测的特异性试验M为DNA分子量标准DL2000；4为H5亚型AIV的阳性结果，1，2、3，5分别为H9亚型AIV，NDV，IBDV及IBV的阴性结果；6为阴性对照图4 H5亚型RT-LAMP检测的灵敏度试验上图M为DNA分子量标准DL2000；下图为加入核酸染料SYBR green后在紫外灯照射下的可视结果。1为阴性对照，27为产物稀释至10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2倍的结果；23 RT-LAMP反应产物的酶切鉴定和可视鉴别 理论计算中， H5亚型扩增终产物经内切酶Kpn消化后，应成为两条大小分别为76bp和140bp的主带以及少量其它大小不同的条带，图5结果与理论值完全相符。图6显示了在自然光下LAMP的扩增结果，可见阳性管的反应液已明显混浊，这是因为扩增后形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀所致。图7显示RT-LAMP阳性扩增产物加入SYBR Green I 染料可见绿色荧光（管2）。图5 RT-LAMP反应产物的酶切鉴定M：DNA分子量标准DL2000；1为LAMP扩增后产物经内切酶Kpn消化后的结果；2为LAMP扩增后产物；图6为H5亚型AIV RT-LAMP产物形成焦磷酸镁沉淀的可视结果1为阴性对照管，2为RT-LAMP阳性扩增管，有白色沉淀出现。1 2 B 图7为H5亚型AIV RT-LAMP产物加入SYBR Green I 染料可视结果：1为阴性结果，2为阳性结果。2.4 H5亚型AIV待测样品的RT-LAMP与RTPCR检测方法比较用已建立的RTLAMP技术检测临床样品，检测临床样品结果与RTPCR方法结果一致，如图8。阴性 对照1 2 3 4 5 6 M图8 待测样品的RT-LAMP和RT-PCR检测M：DNA分子量标准DL2000； 2、3、5样品经RT-LAMP和RT-PCR检测均为阳性；1、4、6为阴性。3 讨论世界上最早于1952年由Walker等从加拿大商品鸭中分离到鸭流感（AIV），但未鉴定其亚型。水禽不仅是鸭流感病毒的巨大贮存库，且其本身已成为对鸭流感病毒高度易感的自然感染发病、死亡的禽类。检测水禽群体中是否存在流感病毒存在，采取相应预防与干预措施，对整体控制鸭流感病毒有着重要的意义。根据上述结果，本研究建立的H5亚型鸭流感病毒RT-LAMP快速检测技术具有灵敏、简便、特异性高及结果可视鉴别的优点，有利于诊断与控制此病。由于RNA酶在环境中的广泛存在，RNA很容易降解。这在核酸检测中，使得RNA比DNA在灵敏性上有所限制，传统RT-PCR中，反转录过程需要将近一小时时间，有文献证明LAMP比PCR更灵敏(Gunimaladevi et al.,2005; Kono et al., 2005; Savan et al.,2004)，只需要很低的拷贝数就可进行扩增，所以在RT-LAMP反应过程中，反转录的时间只设定为10min就已经足够，这又缩短了检测时间，在保证高灵敏度的同时，能够快速获得诊断结果。RT-LAMP反应过程中有副产物焦磷酸镁沉淀的产生，使阳性反应管有明显的变浑浊现象，同时大量的扩增产物在结合核酸染色剂SYBR 的情况下，有肉眼可见的颜色变化(Soliman, et al.,2005)（阴性为橙黄色，阳性偏绿色），虽然仅靠这些判断并不准确，不能排除非特异性扩增，但结果的可视观察，可以脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制，加上扩增是等温进行，不用依赖PCR仪复杂的循环温度变化，在水浴锅中就能进行，这些都使该技术在小型研究所、卫生站有更广阔的应用前景。LAMP的高灵敏性同时会增大反应假阳性的几率，在检测过程中要进行物理分区，核酸抽提、核酸扩增以及产物电泳都应分别在独立的环境中进行，因为产物电泳图为梯状拖带图样，一旦出现非特异应扩增不易察觉，所以用限制性内切酶进行鉴定就十分必要。今年来，有学者发现LAMP扩增反应所需要的BST聚合酶对血液、细胞培养液等各种物质表现出比Taq聚合酶更高的耐受性（Kaneko,et al.,2007），对于DNA的检测来说，核酸抽提或许能省略就能达到检测的目的，这是一个很闪光的优点。总之，RT-LAMP作为一种便捷、高特异性、高灵敏度的新型核酸扩增方法，随着方法的不断发展与改进，必将会在分子生物学特别是传染病的病原诊断方面发挥重要作用 【参考文献】：1甘孟侯, 郑世军. 近年来鸭流感发生和流行特点、动态及防控对策J.中国农业科技导报, 2006，8(5)：19-26.2曾冰冰，肖凯军，石 磊等. LAMP方法在食品微生物检测中的应用. 现代食品与药品杂志，2007，17（1）：22253Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K.,Amino, N., Hase, T., 2000.Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 12, E63-e63.4Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry.2001，47, 17421743.5Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T., 2001. Detection of Loop-Mediated Isothermal Amplification Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation. Biochemical and Biophysical Research Communications 289, 150-154.6Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M., 2004, Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases 10, 583-593.7Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S.E., Sakai, M., 2005, A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology 150, 899-909.8Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T., 2004. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods 115, 5965.9Savan, R., Kono, .T, Itami, T. Sakai ,M., 2005. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases 28, 573581.10Soliman, H., El-Matbouli, M., 2005. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virology 2, 83-90.11Kaneko, H., Takashi Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T., 2007. Tolerance of loop-mediated