148选题思路与科研计划书的撰写准备 （研究生讲座）

148选题思路与科研计划书的撰写准备 （研究生讲座） ()南京医科大学吴观陵glwunjmu.?研究生的学习是在研究中学习?在学习中研究?研究生学习的主要方式是在教师指导下开展科学研究?是研究式的学习?关键词:(科学)研究确定题目?选题过程?1?提出问题(Problem)2?文献查阅(Critical reviewof literatures)3?假说形成(Formulation ofhypothesis)4?陈述问题(Statement ofthe problem)安排实验5?实验设计(Experimental design)6?实验观察(Experimental investigation)7?数据资料积累(Aumulation ofraw data)总结工作完成论文8?数据资料处理(Treatment ofraw data)9?统计分析(Statistical analysis)10?提出结论(Conclusions)调查研究实验观察/研究资料分析基础研究应用基础研究或应用研究的基础性工作应用研究种类性质国家自然科学基金基础研究与应用基础研究国家科技攻关项目应用研究(十一五国家科技支撑计划)973项目重大基础研究.“1.凝炼科学问题和选题?希尔伯?只要一门科学分支能提出大量问题?它就充满着生命?而问题缺乏则预示着独立发展的衰亡或中止。 ?贝尔纳?课题的形成和选择?无论作为外部的经济要求?抑或作为科学本身的要求?都是研究工作中最复杂的一个阶段。 一般来说?提出课题比解决课题更困难。 ?爱因斯坦:提出一个问题往往比解决一个问题更重要。 ?提出一个有待解决的问题?并且有一套借助文献资料和个人工作经验?经过分析、归纳、类比和推理等科学思维程序而形成的科学假说及掌握证实这一假说的有效方法和实验手段。 一个有待解决的问题问题一个对问题的理论解释假说一个证实理论的切实手段技术路线和方法申请人可以既根据个人的专长?又根据当前国内外自己所熟悉的科学前沿进展确立科研选题?选题所研究的内容和提出的总是前人没有研究和涉及的填补某一科学领域中的一些空白。 ?前人对此问题虽有研究?但本人在选题中提出新的实验结果和事实资料?对既往的理论认识有所发展和补充。 ?国外对此问题早以有过一些资料?但尚需结合我国医学实际进行研究?从而填补国内空白?引进新的医学科学技术。 ?选题所研究的内容和提出的总是前人没有研究和涉及的填补某一科学领域中的一些空白。 ?前人对此问题虽有研究?但本人在选题中提出新的实验结果和事实资料?对既往的理论认识有所发展和补充。 ?国外对此问题早以有过一些资料?但尚需结合我国医学实际进行研究?从而填补国内空白?引进新的医学科学技术。 ?例:RNA干扰治疗价值的开发研究,首次在整体动物模型中证实小分子RNA(SiRNA)治疗小鼠肝炎的效果(FasL/SiRNA).Nature Medicinexx被Science评为”xx年度世界十大科技突破”?选题所研究的内容和提出的总是前人没有研究和涉及的填补某一科学领域中的一些空白。 ?前人对此问题虽有研究?但本人在选题中提出新的实验结果和事实资料?对既往的理论认识有所发展和补充。 ?国外对此问题早以有过一些资料?但尚需结合我国医学实际进行研究?从而填补国内空白?引进新的医学科学技术。 ?例:日本血吸虫感染能够通过下调干扰素刺激基因的表达?抑制Th1型应答Interferon-regulated GTPasefamily showeda similartrend ofincreased expression in the mice3wk PIand decreasedexpressioninthemice13wk PIrelative touninfected mice.Validation offour interferon-inducible genesexpression.RT-PCR wasused toamplify fragmentsof TGTP,IRG-47,ICSBP andIGTP fromRNAs ofthe uninfectedand differenttime-points post-infection(PI)samples.GAPDH amplifiedfrom thesame samplesshowed similarloading ineach laneCell.Immunol.,xx,224 (1):55-62.Acta Biochimicaet BiophysicaSinica,xx,38:327-334?选题所研究的内容和提出的总是前人没有研究和涉及的填补某一科学领域中的一些空白。 ?前人对此问题虽有研究?但本人在选题中提出新的实验结果和事实资料?对既往的理论认识有所发展和补充。 ?国外对此问题早以有过一些资料?但尚需结合我国医学实际进行研究?从而填补国内空白?引进新的医学科学技术。 指导制定计划大人群监控和预防诊断筛查预防:地中海贫血的研究遗传流行病学调查建立一系列诊断标准和诊断技术设计、建立了一套针对中国人地贫突变的分子诊断新法?用作遗传流行病学调查的工具?解决临床诊断和产前诊断问题方法靶点年份PCR-RFLP?地贫5种常见点突变1993?地贫HbCS突变1994RDB技术?地贫20种点突变1994?地贫6种点突变xxgap-PCR?地贫5种缺失1998HPFH SEA型缺失2000DHPLC技术?地贫5种常见点突变xx?地贫-?4.2基因xx突变类型年份?1CD118(+TCA)小插入xx-11.1缺失大片段缺失xx-THAI缺失大片段缺失xx?2CD31AGG?AAG(Arg-Lys)剪接突变?1999?90(C?T)转录突变xx?CD37(TGG?TAG)无义突变1995?CD27-28(+C)移码突变1994?CD14-15(+G)移码突变1993阐明了中国南方一些主要发病地区人群中的?和?地贫基因频率及突变类型中国人特有的?和地中海贫血新突变缺失基因年份?-thalassemia-1gene(-11.1)xx?-thalassemia-2gene(-?4.2)2000?-thalassemia-2gene(-?3.7)2000SEA HPFHdeletion1999HPFH应用所建立的技术实施了国内最早的?和?地贫人群监控预防计划年份总例数?1地贫携带者(n/%)?地贫携带者(n/%)双方?-地贫携带者(n/%)双方?-地贫携带者(n/%)?/?重型地贫胎儿Barts水肿胎重型?地贫儿1993*1,85192/4.9755/2.972/0.221/0.1131019948,767508/5.79316/3.6018/0.418/0.1895219957,454432/5.80268/3.6017/0.457/0.19124219969,814560/5.71358/3.6519/0.388/0.16125319978,601495/5.76310/3.6021/0.487/0.16105119988,835494/5.59336/3.8017/0.388/0861562/5.70365/3.7024/0.488/0.16147320008,871496/5.59337/3.8021/0.477/0.161662xx8,978502/5.59323/3.6017/0.388/0.18932xx*4,334234/5.40156/3.608/0.374/0.18421合计77,3664,375/5.652,824/3.65164/0.4266/0.171014218(1993-xx)10对选题过程的特别提醒!?充分利用丰富的疾病资源,从临床实践和总结中,充分发挥想象力?结合当代医学科学前沿,凝炼科学问题,发掘可供研究的选题!在日常工作中注意积累科技资源?转换医学Translational Medicine?Weija Kong,Jing Wei,Parveen Abidiet al:Berberine isa novelcholesterol-lowering drugworking througha uniquemechanism distinctfrom statins.Nature Medicinexx,10:1344-1351Increase hepaticLDLR expressionUpregulatory effectsof BBRon LDLRexpression NatureReviewxx年1月在”Research Highlight”专栏介绍该成果,指出”BBR是他汀类药物的理想补充”?寻求选题依据?判定选题的价值、合理性和科学性?避免重复研究?构思和完善科研假说的基础?科学性和假定性评价?在科研工作总结阶段是论点形成的基础之一the newer,the better?现有的专业分工十分强调每个专业的个性和独特点?很少互通各专业之间的共性和相互联系?就创造思维来说?这种知识的分割与疏离是极有害的?不但会导致人们机械、片面地认识各种知识结构?还会使人们对自已专业以外的知识持有消极的冷漠的态度?对跨专业的理论设想嗤之以鼻。 强化隐喻联想可突破知识专业化对个人知识结构的束缚?使人们学会在不同领域的知识中寻找专业发展的灵感和突破点。 运用多学科或学科间配合的途径?在更高的层次上研究既往提出的问题或开辟新的研究!?组成医学实验的三个基本要素?处理(施加)因素、受试对象和实验效应研究题目定得越具体、明确?说明研究者的科学思维越清楚。 题目的假说越集中?实验观察的对象?使用的方法和所采取的指标之间的联系和因果关系越明确?预期的结果就越可及?回答的问题就越深刻。 例如?吸入二氧化碳对心脏活动的影响吸入30%二氧化碳过程中人体心电图的变化题目文字表达明确、简练。 ?!?!基本原则?平等受益尊重个人保证措施?伦理审查委员会知情同意2.关于假说(hypothesis)和假说构建?从实践中总结和发现规律研究规律(设定假说)Understand aproblem?提出假说验证假说Solve aproblem假说(hypothesis)假说构思是训练科学逻辑思维方法和能力的最佳途径?假说?对某一个问题的认识?虽然尚未进行实验?但根据现有的理论进行推理?得出科学的理论解释?这叫假说?又叫设想.A goodapplication shouldbe basedon astrong hypothesis!?科学假说的两个显著特点?科学性和假定性假说以一定科学实验做基础?有一定事实作依据?所以它具有科学性。 假说有一定的推测性质。 它的基本思想的主要部分是根据已知事实推测出来的?所以它又具有假定性。 离开这两个特点?就不成为科学假说?假说的提出是推理的结果?假说的验证?科学研究?是推理指导下安排的实验和调查假说的形成是一个严谨的科学思维过程?包括?分析和归纳类比推理假说形成演绎推理研究内容?实验设计技术路线和方法确定?归纳思维?inductive thinking?特殊一般聚合思维演绎思维?deductive thinking?一般特殊聚合思维是一种有条理、有范围的收敛性思维?具有方向性、判断性、稳定性、服从性和绝对性等特点。 聚合思维本质上是按照形式逻辑?逐步进行分析推论?最终得到符合逻辑性的结论。 Doll andHill(19501964)确定吸烟与肺癌关系的研究分析与归纳?英国扫烟筒工人阴囊上皮癌多发?是由于煤炭不完全燃烧的颗粒夹于阴囊皱褶所致?染料中含有胺易引起工人多发膀胱癌类比推理某些化学物质可以致癌?烟草的不完全燃烧也可有致癌物质?促使肺癌的多发假说形成吸烟可致肺癌演绎推理假如吸烟可以引起肺癌的假说成立?那么在此前提下?通过演绎推理确定的调查内容应该是合理的?烟草的发行量与肺癌的发病率应该是平行上升的?肺癌病人与非肺癌病人配对调查?前一组吸烟者应比后一组多?吸烟史也该长?由果及因-回顾性调查?吸烟医生与非吸烟医生配对跟踪多年后?前一组肺癌发病率应比后一组高?由因及果-前瞻性调查?肺癌死亡率高低与吸烟量多少应为正相关?戒烟后医生中的死亡率应该低于不戒烟者在假说的演绎推理指导下安排相关的研究?科学假说的作用?帮助研究者有一个明确的目标?看清一个事物的重要意义。 假说是对于自然现象规律性的一种推测?研究者可以根据假说确定的研究方向进行主动的、有计划的观察和实验?避免盲目性和被动性?大多数评审专家都认为一份好的申请书一定是由一个很好的科学假说主导的对同一个问题可能提出一个以上的假说,你要说出为什么选此不选彼?你打算做什么?What doyou intendto do?为什么值得作?为何说有创新?Why isthis worthdoing?How isit innovative?已经做了些什么?What hasalready beendone ingeneral,what haveother researchersdone inthis field?What willthis newwork addto thefield ofknowledge?你或你的合作者有那些与此申报项目相关的工作基础?What haveyou(and yourcollaborators)done toestablish thefeasibility ofwhat youare proposingto do?如何进行这项研究工作?How willthe researchaomplished?Who?What?When?Where?Why?.:1.记住研究计划需要回答的问题?明确选题性质的要求?基础研究或应用研究?认真选题?务使目的明确?构思完整,认真思考怎样回答5个基本问题?从评审人的角度来组织你的计划书的撰写?课题计划书是一篇文章?围绕主题?研究目的?分层次?有条理的进行表述?注意衔接和前后呼应背景陈述?或立题依据?按选题构思过程的逻辑思维顺序进行?研究目的、研究内容和技术路线按研究的具体目的的顺序表达背景陈述尤为重要?是给评审人的第一印象?语言简单、平实、明确、直接?容易被理解和接受?正确和准确地将英文词句用中文表达出来?提供参考文献资料出处?预算合理?设备预算通常不要超过总预算的25%2.计划书撰写注意事项? (1)首页?简表?课题名称、申请人的个人资料、课题组成员名录;课题名称可以用词组或句子表达,尽量包括关键词和三个要素:处理因素,受试对象和实验效应. (2)摘要:在数百字的范围内,简要提供项目科学问题提出的背景、研究目的或假说、拟采用的技术路线或方法、项目特点及科学意义。 (3)目的?陈述申请书中提出的研究项目拟达到何种目的和/或验证何假说。 具体的特殊研究目的? 1、 2、3(Do notconfuse specificaims withyour projects long-term goals.) (4)立项背景和意义:复习和评价现有的知识?国内外研究概况?结合研究目的?提出本课题研究拟填补的空白或发展?创新内容并说明其重要意义?你或你的合作者有那些与此申报项目相关的工作基础结合假说形成的科学思维过程及主要科学依据?陈述本课题研究的合理性及预期结果的可及程度。 3.课题计划(申请)书组成部分及应撰写的内容?5?实现申请课题目标已具备的条件?提供申请人本人或课题组有关的研究工作基础?以及提供何能说明申请人及其课题组能胜任该课题研究任务的资料?已有的主要试验设备?已掌握的有关研究技术力量或建立新技术的能力。 ?6?研究内容?核心是实验设计和方法:研究内容、技术路线、实验计划、方法和步骤?以及分析和解释资料的方法?如果涉及新的技术和方法?应作较详细的陈述?并说明比已有的方法的优越性;讨论潜在困难和限制?以及在遇到困难时可采用替代途径和措施。 ?7?其他?研究进度?预期成果和提供成果的形式?经费概算?申请者?参加者与合作者的分工4.背景陈述要受到特别重视?立题依据、科学意义、假说构成的科学及逻辑思维过程?问题的提出?及简介对该问题的认识现状?以假说作为框架?将由文献阅读提炼出的事实和/或自己先前的研究结论?以及由此而形成的观点作为支持假说构建的论点?按假说构成的科学逻辑思维过程?分层次表述?接着明确提出假说?研究目的?点出其创新要点?继而简要提及验证该假说的研究的内容和技术路线?并评价其可行性?目标的可及程度?重要论点可用黑体字标明?以引起评审人注意?牵着评审人的思维按照你的思维过程走。 众多事例证明许多环境化学物可引起兴奋效应(hormesis)?即接触某一化学物低浓度时产生对机体有利效应?而在高浓度时却产生损害效应?剂量-反应关系曲线表现为倒U型和/或J型。 兴奋效应型剂量-反应关系近年引起了多方面的广泛兴趣?因为这一新理论对于环境化学物危险性评价一直所沿用的经典线性阈值或无阈值模型提出了严峻的挑战。 因此?近年在Nature和Science等多种期刊上进行了广泛讨论?大多数学者认为?环境化学物影响机体的主要模型是兴奋效应型剂量-反应关系模型?而并非经典的阈值模型或无阈值线性模型?这一新理论的应用不仅将重新审视毒理学中心法则?而且将引起环境、医学、公共卫生等众多领域发生广泛变革1?4。 目前这方面的研究国外文献主要是描述和发现某些环境化学物引起兴奋效应现象?尚未深入开展其机制研究?国内仅见几篇对国外文献的综述报道。 为了使兴奋效应型剂量-反应关系能真正被人们完全理解和普遍接受?就必需阐明其发生的分子机制?提出令人信服的机制基础.项目的立项依据多种环境因素引起多种生物产生不同观察终点的兴奋效应?但目前尚未发现产生兴奋效应的环境因素存在某一共同理化特性?但多数兴奋效应的反应却呈现非特异性和生物个体易感性。 对于环境化学物所致兴奋效应的机制?有学者提出以下几点解释?1?排出和/或灭活具有抑制效应的化学物?2?机体动态平衡的逆转所致的过度补偿?overpensation?或反弹?rebound?使机体的应激能力提高?3?抑制性的金属行使结构相近的正常金属离子效应?表现出激活作用5。 但是?这些解释都不能全面阐明环境化学物所致应奋效应现象?更没有从分子水平阐述其发生的机制。 最近?Damelin等6发现低浓度重金属Mn、Cd和Cu引起McCoy细胞兴奋效应时?表现出应激蛋白如热休克蛋白70?HSP70?和金属硫蛋白含量被诱导升高?而且这两种蛋白含量升高峰值与兴奋效应峰值在时间上一致?从而认为兴奋效应可能与机体的应激调节有关。 亚砷酸钠?NaSO2?是砷?As?元素在环境中存在的主要形式?不仅其分布非常广泛?而且对机体的影响非常复杂。 众多的研究已发现过量摄入亚砷酸钠可引起机体多种损害?而且其已被确认为人类肯定致癌物。 但有趣的是?从古到今许多地区流传服用低剂量砷化物来强身健体的现象?而且?目前有学者认为砷元素也是人体必需的微量元素?只是由于机体对其必需的量极其微小?所以容易被人们忽视。 Lee报道亚砷酸钠能增加叙利亚仓鼠胚胎细胞克隆形成数?其生长呈倒U型曲线?而胚胎细胞畸变率比对照低30?40?。 Brown报道亚砷酸钠在1/25和1/5LD50剂量可引起大鼠肝和肺的DNA损伤明显低于对照?呈J型曲线?说明低剂量亚砷酸钠能拮抗大鼠本底所引起的DNA损伤?而且发现低浓度亚砷酸盐可促进淋巴细胞DNA合成和损伤修复?而高浓度则相反7。 28个国家和地区居民微量元素饮食摄入量与癌症关系的流行病学调查也发现?多种癌症与低剂量亚砷酸钠摄入量呈负相关性?提示在正常摄入范围内?亚砷酸钠对癌症具有一定拮抗作用8。 本课题组在前期研究中已发现低浓度亚砷酸钠可明显降低人胚肺成纤维细胞?HLF?HRPT基因的自发突变率和拮抗过氧化氢?H2O2?所致DNA损伤和细胞凋亡。 总之?已有众多事例表明亚砷酸钠对细胞具有明显兴奋效应。 热休克蛋白?HSP?是一类被众多环境应激因素所诱导的细胞适应性保护蛋白?如HSP70能拮抗其他因素所致DNA损伤和细胞凋亡9。 Seems报道亚砷酸钠在低浓度可诱导HSP70含量升高?而高浓度则引起HSP70含量降低10。 我们在前期研究中用Western blotting检测也发现相同的研究结果?而促凋亡蛋白Caspase-3含量却被亚砷酸钠低浓度诱导降低?被高浓度引起升高?同时?用基因表达芯片检测发现HSP70和Caspase-3基因的表达结果与Western blotting检测结果一致。 从而提示?低浓度亚砷酸钠引起的细胞兴奋效应可能与细胞适应性保护蛋白含量被激活升高?从而引起细胞产生一系列适应性保护反应有关。 丝裂素活化蛋白激酶?MAPK?家族的信号通路是将细胞外信号传递至细胞核?引起基因表达改变的重要信号通路?其对细胞生长和应激反应具有重要调控作用。 哺乳动物细胞的MAPK家族的信号通路主要包括三条通路?即细胞外信号调节激酶?ERK?通路、c-jun N末瑞激酶?JNK?/应激活化蛋白激酶?SAPK?通路和p38MAPK通路。 多数学者认为ERK通路激活通常与促进细胞增殖与分化有关?而参与细胞应激反应调控的JNK/SAPK和p38MAPK通路的早期、短暂性激活通常与细胞生存和分化有关?而后期、长期性激活则与细胞凋亡和坏死有关。 因此?生长因子激活的ERK通路和应激激活的JNK/SAPK和p38MAPK通路之间的平衡和精确调节?是影响细胞生长和应激反应的重要调控机制11。 Dorion发现正常细胞受到适度应激作用后?将产生对随后严重应激损伤的保护作用?其机制与适度应激引起JNK磷酸酶?是一种抑制JNK通路的酶?抑制而激活JNK通路有关12。 我们用基因表达芯片检测也发现JNK基因表达被亚砷酸钠低浓度诱导上调?而被高浓度引起下调。 因此?我们推测MAPK家族信号通路中的JNK/SAPK通路在亚砷酸钠低浓度所致兴奋效应与高浓度引起损伤效应中可能发挥不同作用。 众多研究发现亚砷酸钠可引起机体和细胞内活性氧?ROS?含量升高?其升高与亚砷酸钠剂量存在较好的剂量-反应关系13,14。 以前认为ROS只是一种破坏性强大的毒性物质?引起生物大分子氧化性损伤?现在?则发现ROS还是对细胞具有广泛调节功能的信息分子?参与细胞信号转导、激活转录因子?影响基因表达?从而影响细胞的生长和应激功能?所以?有人认为适度的ROS水平对于细胞具有一定保护作用15。 有文献报道ROS可以激活JNK/SAPK信号通路?而对ERK信号通路的作用报道不一?有的发现是激活作用?有的发现是抑制作用16。 所以?有人认为?MAPK家族的信号通路可能是细胞内ROS与其所致应激和/或损伤效应之间的一条串话?cross-talk?。 细胞为维护自身稳定?已形成了多种DNA损伤修复机制?当细胞受到一定程度DNA损伤应激时?可促使细胞代偿性上调修复功能?达到维护基因组稳定性目的?所以DNA损伤修复也是一种重要的细胞应激保护机制。 只有当DNA损伤程度超过了细胞的修复能力?细胞才会表现出损害效应。 最近已有研究发现细胞受到适度应激作用可引起DNA修复功能上调?这种保护性反应可能与细胞修复DNA双链断裂?DSB?的DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)和ATM酶活性有关17。 而Ku70蛋白是DNA-PK重要成分之一?其在修复氧化性损伤和细胞V(D)J重组所致DSB?从而维护染色体和基因组稳定性中发挥重要作用18?19。 我们用基因芯片检测发现?Ku70基因表达被亚砷酸钠低浓度诱导上调?而被高浓度引起下调。 从而提示?亚砷酸钠低浓度所致兴奋效应与高浓度引起损伤效应时?Ku70修复DSB功能表现不同。 因此?我们根据环境化学物所致兴奋效应特征和ROS、HSP、MAPK家族的信号通路及DNA损伤修复功能特性?结合国内外研究进展和我们前期研究所提供的线索?提出亚砷酸钠所致细胞兴奋效应的分子机制之一的假说如下?低浓度亚砷酸钠引起细胞内产生低水平ROS?通过激活JNK/SAPK信号通路?使细胞产生一系列适应性保护反应?从而使应激蛋白如HSP含量升高?DNA损伤修复功能上调?而产生抗基因突变和抗DNA损伤的细胞兴奋效应?而高浓度亚砷酸钠则通过相反的分子机制引起细胞产生损伤效应。 由于环境化学物所致兴奋效应具有非特异性特征?所以?我们有理由推测?如果这一假设成立?则其可能也是其他环境因素所致兴奋效应的分子机制之一。 当然?由于细胞对环境因素的反应和细胞内调控信号通路非常复杂?这一假设肯定只是兴奋效应分子机制之一?还存在许多其他机制?需要不断进一步研究。 目前?关于环境化学物所致细胞兴奋效应研究尚处于起步阶段?其主要存在以下两方面问题?1.由于众多干扰因素?低剂量环境化学物所致细胞兴奋效应易被掩盖?给建立细胞兴奋效应模型带来一定困难?需要不断优化实验条件和反复比较观察不同浓度不同时间环境化学物所致细胞效应。 2.目前?环境化学物所致兴奋效应虽被多数学者认可?但由于其发生机制尚不清楚?所以这一新理论尚未被普遍理解和接受?从而给其应用也带来许多困难。 根据环境化学物所致细胞兴奋效应研究的意义、国内外研究进展和存在的问题?本课题拟在已建立低浓度亚砷酸钠所致HLF细胞兴奋效应模型基础上?进一步深入探讨我们提出的分子机制假设?从而揭示亚砷酸钠所致细胞兴奋效应的部分分子机制?为进一步理解和接受环境化学物所致兴奋效应及其应用、全面了解砷化物对机体的影响提供理论依据。 建立稳定的低浓度亚砷酸钠明显抗HRPT基因突变和抗DNA损伤的HLF细胞兴奋效应模型?为研究兴奋效应机制及影响因素提供稳定的细胞实验模型。 通过探讨ROS、HSP、JNK信号通路及Ku70修复功能在亚砷酸钠所致HLF细胞兴奋效应中的作用及其相互关系?揭示亚砷酸钠所致细胞兴奋效应的部分分子机制?为理解和应用兴奋效应理论提供科学依据。 发现亚砷酸钠低剂量所致细胞兴奋效应与高剂量所致细胞损伤效应分子机制的异同?为全面了解砷化物对机体的影响及寻找相关分子生物学标志提供科学依据。 研究目标研究内容进一步优化实验条件?观察不同浓度亚砷酸钠处理不同时间对HLF细胞的HPRT基因突变和DNA损伤的影响?寻找建立稳定的亚砷酸钠所致HLF细胞兴奋效应模型的优化条件及兴奋效应与损伤效应之间的临界浓度。 观察用抗氧化剂和Caspase-3抑制剂预处理对低浓度亚砷酸钠抗HLF细胞HPRT基因突变和抗DNA损伤兴奋效应的影响?探讨ROS和Caspase-3在亚砷酸钠所致细胞兴奋效应中的作用。 用RNAi技术关闭JNK基因后?再观察低浓度亚砷酸钠抗HLF细胞HPRT基因突变和抗DNA损伤兴奋效应的变化?探讨JNK通路在亚砷酸钠所致细胞兴奋效应中的作用。 用反义抑制技术下调Ku70基因表达后?观察降低DNA双链断裂损伤修复能力对亚砷酸钠抗HLF细胞HPRT基因突变和抗DNA损伤兴奋效应的影响?探讨DNA修复功能在亚砷酸钠所致细胞兴奋效应中的作用。 脑神经元再生近4年来在Science、Nature、Cell三大著名期成年刊上有大量报道?已成为神经科学领域的研究热点?其对认知大脑这一最复杂、最神奇的器官?以及对中风和神经退化性疾病的治疗具有重大科学意义。 长期以来认为?成年哺乳动物中枢神经系统无再生能力?脑组织损伤后不能自行修复1。 因此?关于中风及其他神经退化性疾病的治疗策略主要是防止神经元死亡2。 然而?新近发现成年哺乳动物脑神经元可以再生3?打破了传统观念的桎梏。 现已证实?各种成年哺乳动物脑都存有神经干细胞?其具有长期自我更新能力4?5。 神经干细胞在成年哺乳动物脑中曾被认为主要宿住在侧脑室室管膜下?现知其还广泛存在于脑实质5?6。 包括人类在内的各种成年哺乳动物脑组织终生都有新神经元生成?新神经元主要诞生于海马齿状回?dentate gyrus,DC?颗粒细胞层下和侧脑室嘴侧室管膜下?然后迁移至目的地7?11。 这些新生神经元在迁移过程中逐渐成熟?行使其生理功能7?12。 最近又发现?局灶性或全脑缺血可激发成年脑神经元大量再生?新生的神经元可迁移至损伤部位?替代死亡神经元?改善神经缺陷症状6?13?14。 这意味着通过调控某些缺血相关的分子可激活内源性神经元再生机制?促使脑损伤修复。 显然?阐明脑缺血激发神经元再生的分子调控机制?将更新中风及其他神经退化性疾病的治疗策略、明晰正确的药物干预环节和发现新药靶。 然而?目前关于成年脑神经元再生的研究主要着重于发现现象?而决定这些现象的本质问题所知甚少。 我们研究发现?在大脑中动脉阻塞再灌注引起的局灶性脑缺血动物模型?缺血后24小时诱生型一氧化氮合酶?inducible nitricoxide synthase,iNOS?开始在远离梗死灶的海马齿状回表达。 iNOS基因缺陷或使用iNOS抑制剂?可完全抑制缺血刺激引起的海马齿状回神经元再生?说明iNOS表达激发了脑缺血后的神经元再生15。 而后我们研究又发现?使用选择性神经元型一氧化氮合酶?neuronal nitricoxide synthase,nNOS?抑制剂或nNOS基因缺陷?可使脑缺血动物海马神经元再生能力增加数倍?表明脑缺血后nNOS激活遏制了海马神经元再生。 然而在局灶性缺血的iNOS基因缺陷动物?nNOS抑制剂的促神经元再生作用显著减弱?说明nNOS激活遏制脑缺血后神经元再生的作用?在一定程度上是iNOS表达依赖性的16。 既然nNOS和iNOS地催化产物都是一氧化碳?nitricoxide,NO?为何二者对脑缺血后神经元再生打作用截然相反?阐明这一问题?将从一个侧面揭示脑缺血激发神经元再生的细胞和分子调控机制。 成年后正常脑组织不表达iNOS17?而脑缺血后期iNOS在远离梗死灶的海马齿状回区的胶质细胞大量表达15。 星形胶质细胞可诱导成年动物的神经干细胞或神经元前期细胞增殖并分化成神经元表型18。 实际上放射状胶质细胞、星形胶质细胞等本身就是神经元前期细胞大一种?可以直接分化成新神经元19?20。 转录因子cAMP反应元件结合蛋白?cAMP responsiveelement binder,CREB?磷酸化?是启动神经干细胞和神经元前期细胞增殖及向神经元表型分化大主要下游分子事件。 脑缺血后磷酸化CREB选择性分布在神经干细胞宿住地21。 新近发现?NO通过cGMP途径?使CREB磷酸化并使之激活22。 由此我们推测?脑缺血后期?胶质细胞表达iNOS产生的NO?作用于毗邻的神经干细胞?通