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西 南 大 学动物科技学院微生物学讲稿(供生物工程专业四年制本科用)动物科技学院：李能章tel-mail:2005年9月10日第一章 绪论第一节：微生物学的研究对象一、微生物的含义（什么是微生物）非分类学上名词，来自法语Microbe一词。是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构的低等生物的通称。二、生物分界（微生物在生物界的位置）1、 两界系统（亚里斯多德）动物界 Animalia：不具细胞壁，可运动，不行光合作用。植物界 Plantae：具有细胞壁，不运动，可行光合作用。三界：原生生物界 Protista：（E. H. Haeckel, 1866年提出） 2、 五界系统(R. H. Whitakker, Science, 163: 150-160, 1969)原核生物界 Monera：细菌、放线菌等原生生物界 Protista：藻类、原生动物、粘菌等真菌界 Fungi：酵母、霉菌动物界 Animalia：植物界 Plantae：五界系统是以细胞结构分化的等级以及和光合、吸收、摄食这三种主要营养方式有关的组织类型为基础的。六界：加上病毒界。3、 三界（域）系统 Woese用寡核苷酸序列编目分析法对60多株细菌的16SrRNA序列进行比较后，惊奇地发现：产甲烷细菌完全没有作为细菌特征的那些序列，于是提出了生命的第三种形式-古细菌(archaebacteria)。随后他又对包括某些真核生物在内的大量菌株进行了16Sr RNA(18SrRNA)序列的分析比较，又发现极端嗜盐菌和极端嗜酸嗜热菌也和产甲烷细菌一样， 具有既不同其他细菌也不同于其核生物的序列特征，而它们之间则具有许多共同的序列特征。于是提出将生物分成为三界(Kingdom)(后来改称三个域)：古细菌、真细菌( Eubacteria)和真核生物(Eukaryotes)。1990年，他为了避免把古细菌也看作是细菌的一类 ，他又把三界(域)改称为：Bacteria(细菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物)。并构建了三界(域)生物的系统树。四、微生物特点生命基本特征：生命通过它的耐久性、适应性、它的生长及修复的能力和它的繁殖而延续下去，这是生命的基本的和普遍的特征。新陈代谢，包括外部的和内部的，是一切生命的另一基本特征。控制与调节，是生命的又一基本特征。1、体积小、比表面积大大小以um计，但比表面积（表面积/体积）大，（插入表），必然有一个巨大的营养吸收，代谢废物排泄和环境信息接受面。这一特点也是微生物与一切大型生物相区别的关键所在。特点1举例：乳酸杆菌：120，000，鸡蛋：1.5，人（200磅）：0.3 2、吸收多、转化快这一特性为高速生长繁殖和产生大量代谢物提供了充分的物质基础。特点2举例：重量相同下：乳酸菌：1小时可分解其体 重1000至10000倍乳糖。人：2.5105 小时消耗自身体重1000倍乳糖。3、生长旺、繁殖快极高生长繁殖速度，如E. coli 20-30分钟分裂一次，若不停分裂，48小时2.21043菌数增加，营养消耗，代谢积累，限制生长速度。这一特性可在短时间内把大量基质转化为有用产品，缩短科研周期。也有不利一面，如疾病、粮食霉变。4、 适应强、易变异极其灵活适应性，对极端环境具有惊人的适应力。遗传物质易变异。5、 分布广、种类多：分布区域广，分布环境广。生理代谢类型多，代谢产物种类多，种数多。五、微生物作用1、 在自然界物质循环中作用2、 空气与水净化，污水处理3、 工农业生产：菌体，代谢产物，代谢活动4、 对生命科学的贡献六、分支学科根据不同研究领域和不同研究对象划分第二节、微生物学发展简史一、我国微生物发展科学的历史就是科学本身。 歌德中国古代：酒文化，仪狄作酒，禹饮而甘之。书经若作酒醴，尔惟曲蘖（nie）齐民要术提倡轮作制。宋真宗时代（公元998-1022）种痘防天花。二、国外微生物学发展1、 微生物的发现形态学时期Antony Van Leeuwenhock，1632-1723，第一个报告自己观察的人。他观察了几乎每一个想看到的东西，雨水、污水、血液、体液、酒、醋、牙垢等，发现了微生物，称为微动体。2、 微生物学的奠基生理学时期Louis Pasteur，1822-1895，他的一生给人类生活带来了史无前例的影响。（1） 证实了微生物活动和否定了微生物自然发生学说。（2） 免疫学预防种痘（3） 发酵的研究（4） 其他贡献否定自生说关于自然发生的争论：自然发生说（无生源说）：认为微小动物是从无生命的物质自然发生的。生源说：认为微小动物是从微小动物的种子或胚形成的，种子或胚存在于空气中。已进行的实验：1665年，Fracesco Redi 腐肉生蛆实验，否定了动物自生说。Spallanzani实验，充分加热的有机汁液中长出微生物原因是由于空气将微生物带进了汁液，因而采取完全密封隔绝的封闭法。18世纪末发现O2 ，意识到O2 是动物生活必需一种气体。Pasteur实验：1、 首先验证了空气中确实含有显微镜可观察到的有机体。2、 加热过的空气通入汁液（煮沸过）并不导致微生物生长。3、 在一封闭容器内，对完全灭菌的汁液加上一些收集到的微生物，无例外地引起微生物生长。4、 设计鹅颈瓶进行实验，最终否定自生说。免疫学贡献Edward Jenner，1796发明种痘，不了解机制。Pasteur 1877研究了鸡霍乱、炭疽病和恐水病，发现钝化病原体可以诱发免疫性和预防疾病。发酵研究:相信一切发酵作用都和微生物的存在及繁殖有关。不同的发酵是由不同的微生物引起的。发明巴斯德消毒法。观察丁酸发酵时，发现厌氧生命，提出好氧、厌氧术语。Robert Koch 1843-1910建立微生物学研究基本技术（1） 分离和纯化细菌：划线法，混合倒平板法。琼脂、培养皿（Petri）（2） 设计了培养细菌用的肉汁胨培养液和营养琼脂培养基。（3） ）设计了细菌染色技术证实疾病的病原菌学说，提出了柯赫准则。柯赫准则:1、某一种微生物，当被怀疑是病原体时，它一定伴随着病害而存在。2、必须能自原寄主分离出这种微生物，并培养成为纯培养。3、用已纯化的纯培养微生物，人工接种寄主，必须能诱发与原来病害相同病害。4、必须自人工接种发病的寄主内，能重新分离出同一病原微生物并培养成纯培养。其他人:Serge Winogradsky,1856-1953,发现微生物的自养生活。Beijerinck M. W.,1851-1931，发现了非共生固氮菌。Joseph Lister,1864,提出无菌外科操作技术。Elie Metchnikoff 发现白细胞的吞噬作用。Ivanovsky 发现烟草花叶病毒。P. Ehrlich 现代化疗的开始3、现代微生物学发展分子生物学阶段1)、现代发酵工业的形成：1941，Florey & Chain 将青霉素投入生产，是通气培养微生物的开端，将微生物学与工程学结合。 2)、微生物代谢作用研究； 1944，Avery 肺炎球菌转化实验，确定DNA是遗传物质，标志着分子生物学的形成。1953，Watson & Crick 提出DNA双螺旋结构以及半保留复制假说。4、分子生物学阶段20世纪70年代，基因工程的发展，工程菌的构建更促进了微生物学的发展。微生物学推动生命科学的发展促进许多重大理论问题的突破对生命科学研究技术的贡献与人类基因组计划三、展望第二章 纯培养和显微技术第一节 微生物的分离和纯培养 大多数动物植物的研究、利用都能以个体为单位进行，而微生物由于个体微小，在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物（culture），而只有一种微生物的培养物称为纯培养物（pure culture）。由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。相应的，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。实际上，正是由于显微技术及微生物纯培养技术的建立才使我们得以认识丰富多彩的微生物世界，并真正使对微生物的研究发展成为一门科学。一、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术（aseptic technique）。1. 微生物培养的常用器具及其灭菌 试管、玻璃烧瓶、平皿（culturedish，Petri dish）在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质（称为培养基（culture medium）可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。2. 接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作（图2-1），或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作（图2-2）。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。二、用固体培养基分离纯培养1. 稀释倒平板法先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000.），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。2. 涂布平板法：由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图2-4）。3. 平板划线法：用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线（图2-5），微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。4. 厌氧微生物的分离：用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式* 。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间（图2-6）。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡-石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。三、用液体培养基分离纯培养通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。四、单细胞（孢子）分离采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。五、选择培养分离没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其它被抑制。1. 利用选择平板进行直接分离：主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件：例如在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。2. 富集培养：主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。六、二元培养物：培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。第二节 显微镜和显微技术一、显微镜的种类及原理1. 普通光学显微镜2. 暗视野显微镜3. 相差显微镜4. 荧光显微镜5. 透射电子显微镜6. 扫描电子显微镜7. 扫描隧道显微镜 二，显微观察样品的制备（略）第三章 微生物类群与形态结构第一节 真细菌细菌是微生物一大类群，主要研究对象。是单细胞，大小在1um左右，1000倍以上显微镜才能看到其形状。一、 细菌的形态和大小1、基本形态1）菌 Coccus：球形或近球形，根据空间排列方式不同又分为单、双、链、四联、八叠、葡萄球菌。不同的排列方式是由于细胞分裂方向及分裂后情况不同造成的。2）杆菌 Bacillus (Bacterium)：杆状或圆柱形，径长比不同，短粗或细长。是细菌中种类最多的。3）螺旋菌 Spirillum：是细胞呈弯曲杆状细菌统称，一般分散存在。根据其长度、螺旋数目和螺距等差别，分为弧菌Vibrio（菌体只有一个弯曲，形似C字）和螺旋菌（螺旋状，超过1圈）。与螺旋体 Spirochaeta 区别：无鞭毛。细菌形态不是一成不变的，受环境条件影响（如温度、培养基浓度及组成、菌龄等）异常形态：一般，幼龄，生长条件适宜，形状正常、整齐。老龄，不正常，异常形态。畸形：由于理化因素刺激，阻碍细胞发育引起。衰颓形：由于培养时间长，细胞衰老，营养缺乏，或排泄物积累过多引起。2、细菌大小如何测量：显微测微尺球菌直径0.5-1um杆菌直径0.5-1um ，长为直径1-几倍螺旋菌直径03-1um，长1-50um细菌大小也不是一成不变的。细胞重量10-13-10-12g ，每g细菌含1-10万亿个细菌。细菌细胞结构:研究细菌细胞结构是分子生物学重要内容之一，有了电子显微镜才有可能。其结构分为基本结构和特殊结构。基本结构是细胞不变部分，每个细胞都有，如细胞壁、膜、核。特殊结构是细胞可变部分，不是每个都有，如鞭毛、荚膜、芽孢。（一）基本结构1、 细胞壁 cell wall：位于细胞表面，较坚硬，略具弹性结构。功能：1）维持细胞外形；2）保护细胞免受机械损伤和渗透压危害；3）鞭毛运动支点；4）正常细胞分裂必需；5）一定的屏障作用；6）噬菌体受体位点所在。另外与细菌的抗原性、致病性有关。革兰氏染色Cristein Gram，1884发明（Koch实验室）染色过程：凡是不能被乙醇脱色，呈蓝紫色，称为革兰氏阳性菌 G+凡是经乙醇脱色，呈复染剂颜色，称为革兰氏阴性菌 G-结果不同主要是细胞壁组成及结构差异造成的。（1） 革兰氏阳性菌 Gram positive以金黄色葡萄球菌为例，Staphylococcus aureus细胞壁构成：一连续层，厚20-80nm两部分：网状骨架：微纤丝组成基质：骨架埋于基质中化学组成：主要是肽聚糖和磷壁酸肽聚糖 peptidoglycan (粘肽、胞壁质)大分子复合体，许多亚单位交联而成。亚单位：1） 双糖单位：N-乙酰胞壁酸（NAM）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）通过-1，4糖苷键相连而成。2） 短肽：L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala3） 肽桥：短肽之间连接。短肽全部或部分连至NAM上，短肽之间也有连接，组成一网状结构。肽聚糖是细菌细胞壁特有成分，也是原核微生物特有成分（古生菌没有）磷壁酸 teichoic acid (垣酸)G+特有成分。多元醇与磷酸复合物，通过磷酸二酯键与NAM相连。根据多元醇不同，有甘油型、核糖醇型等5种类型。主要功能：使壁形成负电荷环境，吸附二价金属离子，维持壁硬度和一些酶活性。还可提供噬菌体位点。（2） 革兰氏阴性菌 Gram negative以大肠杆菌为例：内壁层：厚2-3 nm，单（双）分子层，由肽聚糖构成。与G+区别：交联低；DAP取代 L-Lys；肽桥。外壁层：内层：脂蛋白层，以脂类部分与肽聚糖相连。中层：磷脂层。外层：脂多糖层，外壁重要成分，8-10 nm。脂多糖 lipopolysaccharide LPSG-特有成分。结构：类脂A + 核心多糖 + O-侧链功能：1）内毒素物质基础；2）吸附镁、钙离子；3）决定G-表面抗原；4）噬菌体受体位点。钙离子是维持LPS稳定性所必需的。D-AA存在优点G+与G-比较革兰氏染色机制在细胞壁与细胞膜之间，有周质空间（隙），含水解酶、载体蛋白等。（3） 细胞壁缺陷细菌A 、原生质体protoplast：人工条件下用溶菌酶除去细胞壁或用青霉素抑制细胞壁合成后，所留下的部分。一般由G+形成。B 、球形体spheroplast：残留部分细胞壁，一般由G-形成。有一定抗性。特点：对渗透压敏感；长鞭毛也不运动；对噬菌体不敏感；细胞不能分裂等。C、 细菌 L型：一种由自发突变形成的变异型，无完整细胞壁，在固体培养基表面形成 油煎蛋 状小菌落。D 、支原体：长期进化形成。2、 细胞膜 cell membrane在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有弹性的半透性膜。厚7-8nm。化学组成：蛋白和磷脂，蛋白含量高达75%，种类也多。膜不含甾醇类。膜结构（插入）功能：1)高度选择透性膜，物质运输：2)渗透屏障，维持正常渗透压；3)重要代谢活动中心；4)与壁、荚膜合成有关；5)鞭毛着生点，供运动能量。3、 间体 mesosome(中质体)细胞膜内陷形成。功能：1)拟线粒体，呼吸酶系发达。2)与壁合成，核分裂，芽孢形成有关。4、 细胞核 nuclear body核质体原核无明显核，一反差弱的核区。特点：无核膜、核仁、固定形态，结构简单，细胞分裂前核分裂。一般单倍体。成分：DNA：环状双链，超线圈结构，负电荷被镁离子、有机碱（精胺、腐胺）所中和。与真核区别：5、 核糖体 ribosome RS核糖核蛋白的颗粒状结构，RNA+蛋白。原核：游离态、多聚核糖体，70S真核：游离态、结合内质网上，70、80S多聚核糖体：一条mRNA与一定数目的单个RS结合而成。功能：6、 细胞质及内含物是无色透明胶状物，原核与真核不同。主要成分：水、蛋白、核酸、脂类及少量糖和无机盐。富含核糖核酸。不同细菌细胞内，含不同内含物，是细胞的贮藏物质或代谢产物。（插入）内含物优点？微生物储藏物的特点及生理功能：1） 不同微生物其储藏性内含物不同。例如厌气性梭状芽孢杆菌只含PHB，大肠杆菌只储藏糖原，但有些光合细菌二者兼有。2） 微生物合理利用营养物质的一种调节方式。当环境中缺乏能源而碳源丰富时，细胞内就储藏较多的碳源类内含物，甚至达到细胞干重的50%，如果把这样的细胞移入有氮的培养基时，这些储藏物将被作为碳源和能源而用于合成反应。3） 储藏物以多聚体的形式存在，有利于维持细胞内环境的平衡，避免不适合的pH，渗透压等的危害。例如羟基丁酸分子呈酸性，而当其聚合成聚-羟丁酸（ PHB）就成为中性脂肪酸了，这样便能维持细胞内中性环境，避免菌体内酸性增高。4） 储藏物在细菌细胞中大量积累，是重要的自然资源。（二） 特殊结构1、 荚膜 capsule：某些细菌细胞壁外面覆盖着一层疏松透明粘性物质。厚度不同，名称不同。折光率低，负染法观察。成分：90%以上为水，余为多糖（肽）。功能：1)抵抗干燥；2)加强致病力，免受吞噬；3)堆积某些代谢废物；4)贮存物。2、 鞭毛和菌毛鞭毛flagellum：某些细菌表面一种纤细呈波状的丝状物，是细菌运动器官。直径20-25nm，长超过菌体若干倍。电镜或特殊染色法观察，悬滴法观察运动。化学成分：主要是蛋白质。结构：G+与G-区别；原核与真核区别鞭毛着生位置与数目，可作为分类依据。鞭毛着生状态决定运动特点。趋性运动：栓菌实验菌毛fimbria (pilus )：许多G-尤其是肠道菌，表面有比鞭毛更细，数目多，短直硬的丝状体。直径7-10nm ,长2-3um。性菌毛（F菌毛）3、 芽孢 spore, endospore某些菌生长一定阶段，于营养细胞内形成一个内生孢子，是对不良有抗性的休眠体。每一细胞仅形成一个芽孢，所以其没有繁殖功能。形成芽孢属于细胞分化（形态发生）Bacillus, clostridium, Spirillum, Vibrio, Sarcina结构组成特点：含水量低（平均40%），壁致密，芽孢肽聚糖和吡啶-2,6-二羧酸钙（DPA-Ca ）芽孢有极强的抗热、辐射、化学药物和静水压的能力，休眠力惊人。伴孢晶体孢囊 cyst，等等。芽孢的细致构造: a) 细菌繁殖与群体形态1、 繁殖方式：裂殖为主，少数有性接合。2、 菌落形态：菌落colony：由单个或少数几个细胞在固体培养基表面繁殖出来的，肉眼可见的子细胞群体。3、 形态包括大小、形状、隆起、边缘、表面状态、表面光泽、质地、颜色等等。4、 纯培养：克隆clone5、 菌苔lawnb) 常见常用细菌细胞结构、菌落特点、代谢产物等。第二节：放线菌 Actinomycetes因菌落呈放射状而得名，是丝状分枝细胞的细菌。一般分布在含水量低，有机质丰富的中性偏碱性土壤中，特殊土腥味。大多数是腐生菌，少数寄生；多数异养，好氧。突出特性是产各种抗生素。一、 形态与结构由菌丝构成，直径0.2-1.2um，无横隔，仍是单细胞。气生菌丝孢子丝菌丝组成菌落，分为两类。放线菌仍是原核微生物？二、 繁殖以无性孢子为主，菌丝断裂片段也可繁殖成新菌体。孢子形成方式：横隔分裂孢囊孢子放线菌生活史（发育周期）三、 表属及常见菌（一）链霉菌属 Streptomyces90%抗生素，菌丝发育良好。如龟裂链霉菌S. rimosus, 灰色链霉菌S. griseus(二)小单孢菌属Micromonospora无气生菌丝，基内菌丝顶端着生一孢子。（三）诺卡氏菌Nocardia原放线菌属，降解能力强。（四）放线菌属Actinomyces只有基内菌丝，不形成孢子，厌氧。（五）链孢囊菌属Streptosporangium形成孢子囊，孢囊孢子。放线菌、细菌异同？第三节：其它几类原核微生物重要了解大小、G、培养、细胞及代谢。立克次氏体 Rickettsia：某些性质与病毒相近a 、专性活细胞寄生物，除五日热（战壕热）立克次氏体（Rickettsia wolhynica）外均不能在人工培养基上生长繁殖。这是因为它们体内酶系不完全，一些必需的养料需从宿主细胞获得；细胞膜比一般细菌的膜疏松，营养物质较易通过，细胞内物质也容易漏出。这种可透性膜，一方面使它们有可能容易从宿主细胞获得大分子物质，另一方面也决定了它们一旦离开宿主细胞则易死亡）b、大小介于病毒与一般细菌之间，除伯氏立克次氏体（Rickettsia burneti）外，均不能通过细菌过滤器（球状体：0.2-0.5 mm；杆状体：0.3-0.5 x 0.3-2 mm；）2）由于长期适应的结果，立克次氏体形成了一种必须从一种宿主传至另一宿主的特殊生活方式，它们几乎都有自己的天然动物宿主，主要以节肢动物（虱、蜱、螨等）为媒介，寄生在它们的消化道表皮细胞中，然后通过节肢动物叮咬和排泄物传播给人和其他动物。有的立克次氏体能引起人类的流行性斑疹伤寒、恙虫热、Q热等严重疾病，而且立克次氏体大多是人兽共患病原体。对热、干燥、光照、脱水及普通化学试剂的抗性均差，离开宿主仅能存活数小时至数日，但如随节肢动物粪便排出，在空气中自然干燥后，其抗性变得相当强。有的可在室温下保持毒力二年左右。支原体Mycoplasma：1）无细胞壁，只有细胞膜，细胞形态多变；2）个体很小，能通过细菌过滤器，曾被认为是最小的可独立生活的细胞型生物。3）可进行人工培养，但营养要求苛刻，菌落微小，呈典型的“油煎荷包蛋”；4）一些支原体能引起人类、牲畜、家禽和作物的病害疾病，如肺炎支原体；5） 应用活组织细胞培养病毒或体外组织细胞培养时，常被支原体污染。衣原体Chlamydia：1）细胞结构与细菌类似；具有类似的细胞壁，细胞壁内也含有胞壁酸、二氨基庚二酸等。核糖体也是由30S和50S二个亚基组成。2）细胞呈球形或椭圆形，直径为0.2-0.3 mm，能通过细菌滤器；专性活细胞内寄生；衣原体有一定的代谢活性，能进行有限的大分子合成，但缺乏产生能量的系统，必须依赖宿主获得ATP，因此又被称为“能量寄生型生物”3）在宿主细胞内生长繁殖具有独特的生活周期，即存在原体和始体两种形态。具有感染性的原体通过胞饮作用进入宿主细胞，被宿主细胞膜包围形成空泡，原体逐渐增大成为始体。始体无感染性，但能在空泡中以二分裂方式反复繁殖，形成大量新的原体，积聚于细胞质内成为各种形状的包涵体（inclusion body），宿主细胞破裂，释放出的原体则感染新的细胞。4）衣原体广泛寄生于人类、哺乳动物及鸟类，少数致病，如沙眼衣原体是人类砂眼的病原体，甚至引起结膜炎、角膜炎、角膜血管翳等临床症状，成为致盲的重要原因。1956年，我国微生物学家汤飞凡等应用鸡胚卵黄囊接种法，在国际上首先成功地分离培养出沙眼衣原体。现衣原体可用多种细胞培养。5）衣原体不耐热，60度10分钟即被灭活，但它不怕低温，冷冻干燥可保藏多年。对红霉素、氯霉素、四环素敏感。粘细菌生活史：1、营养细胞：杆状、柔软、缺乏坚硬的细胞壁，无鞭毛，产生粘液，可在固体表面作“滑行”运动，以分类方式进行繁殖。2、子实体：营养细胞发育到一定阶段，在适宜的条件下彼此向对方移动，在一定位置聚集成团，形成形态各异，肉眼可见的子实体。单个子实体中可能含有109个或更多由某些营养细胞转变而成的休眠结构，称为拈孢子（mycospore）。能形成子实体是粘细菌区别于其它原核微生物的最主要标志。而在营养生长阶段如果有足够的养料就不形成子实体，当营养耗尽时，营养细胞群就开始形成子实体。子实体干燥后，可借助风力、水力等到处传播，遇到适宜的环境又萌发成为营养细胞。蓝细菌Cyanobacteria：含叶绿素，进行放氧型光合作用的原核生物。由于抵抗力和固氮能力，可在贫瘠沙滩荒岩上生长，称为 先锋生物 。1）分布极广；2）形态差异极大；有球状、杆状和丝状体，个体直径一般为3-10 mm，有的可达60 mm。当许多个体聚集在一起，可形成肉眼可见的、很大的群体。若繁茂生长，可使水的颜色随菌体颜色而变化。3）细胞中含有叶绿素a，进行产氧型光合作用。它被认为是地球上生命进化过程中第一个产氧的光合生物，对地球上从无氧到有氧的转变、真核生物的进化起着里程碑式的作用。4）具有原核生物的典型细胞结构：细胞核无核膜，也不进行有丝分裂，细胞壁含胞壁酸和二氨基庚二酸，革兰氏染色阴性。5）营养极为简单，不需要维生素，以硝酸盐或氨作为氮源，多数能固氮，其异形细胞（heterocyst）是进行固氮的场所。6）分泌粘液层、荚膜或形成鞘衣，因此具有强的抗干旱能力。7）无鞭毛，但能在固体表面滑行，进行光趋避运动。8）许多种类细胞质中有气泡，使菌体漂浮，保持在光线最充足的地方，以利光合作用。古生菌：1977年，Carl Woese以16S rRNA序列比较为依据，提出的独立于真细菌和真核生物之外的生命的第三种形式。在分类地位上与真细菌和真核生物并列为三域（Domain），并且在进化谱系上更接近真核生物。在细胞构造上与真细菌较为接近，同属原核生物。多生活于一些生存条件十分恶劣的极端环境中，例如高温、高盐、高酸等。蛭弧菌Bdellovibrio：寄生于其他细菌并导致裂解，可滤过，运动活跃，G-。生物防治。第四节 酵母菌 yeast非分类名词，一群单细胞微生物，属真菌类。第一种 家养微生物 ，与人类关系密切。主要分布在含糖较高偏酸性环境中，又称 糖真菌 。一、形态大小单细胞，无鞭毛。细胞形态多样，常见球、卵、圆桶形。大小在1-5um X 5-30um之间。二、细胞结构1、细胞壁：厚0.1-0.3um，三层，由酵母纤维素组成（甘露聚糖、葡聚糖、蛋白、类脂）。用蜗牛酶（heliase）破坏壁来制备原生质体。2、细胞膜：与原核基本相同，但含甾醇（麦角固醇）。由于有细胞器分化，功能不及细菌多，主要是调节渗透压、吸收营养、分泌代谢物等3、细胞质及内含物4、细胞核：真核：双层单位膜，大量核孔，可见染色体，一个或几个核仁，核膜外有中心体。5、线粒体：含有一环状DNA。呼吸酶系载体， 动力工厂 。有氧时需要，厌氧或过量葡萄糖存在时，被阻遏。环状 2um质粒 ：外源DNA载体。6、核糖体：细胞质中80S，线粒体70S。三、菌落特征与细菌相似，但大且厚。四、繁殖方式与生活史（一）繁殖方式1、无性繁殖(1)芽殖 budding：最普遍方式（过程）(2)裂殖 fission：少数（裂殖酵母）(3)无性孢子：节孢子、掷孢子、厚垣孢子。2、有性繁殖产生子囊和子囊孢子。过程：质配-核配-减数分裂3、形成孢子条件营养充足强壮幼龄细胞适当温、湿度（25-30，80%）空气要流通适当的生孢子培养基（二）生活史 life history(life cycle) 某种生物在整个发育阶段，有一个或几个同形或不同形的个体前后相继形成一个有规律的循环。四种基本类型：1、无生殖，仅有营养繁殖。（细菌）2、仅有一个单倍体生活，双倍体短。3、仅有一个双倍体生活，单倍体短。4、有世代交替现象，单倍体有性，双倍体无性。酵母菌有三种类型：单倍体型：八孢裂殖酵母双倍体型：路德类酵母世代交替型：酿酒酵母五、常见常用酵母菌酵母图示第五节：霉菌 molds“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。霉菌菌体均由分枝或不分枝的菌丝（hypha）构成。许多菌丝交织在一起，称为菌丝体（mycelium）。霉菌在自然界分布极广，土壤、水域、空气、动植物体内外均有它们的踪迹。常在潮湿的气候下大量生长繁殖，长出肉眼可见的丝状、绒状或蛛网状的菌丝体，有较强的陆生（可能因为好氧，在液体中生活不好）。它们同人类的生产、生活关系密切，是人类实践活动中最早认识和利用的一类微生物。食物、工农业制品的霉变（据统计全世界平均每年由于霉变而不能食（饲）用的谷物约占2%，这是一笔相当惊人的经济损失。有用物品的生产（如风味食品、酒精、抗生素（青霉素、灰黄霉素）、有机酸（柠檬酸、葡萄糖酸、延胡索酸等）、酶制剂（淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等）、维生素、甾体激素等。在农业上用于饲料发酵、植物生长刺激素（赤霉素）、杀虫农药（白僵菌剂）等）引起动植物疾病，可引起约3万种植物病害，是植物传染性病害的主要病原微生物，例如，我国在1950年发生的麦锈病和1974年发生的稻瘟病，使小麦和水稻分别减产了60亿公斤；霉菌可引起多种人及动物的皮肤疾病及其他一些深层病变，如既可侵害皮肤、粘膜，又可侵害肌肉、骨骼、内脏，如可引起肺炎，此外，一些被霉菌感染的食品也可使人得病，如大米、花生中黄曲霉素、黄米毒素等均可引起动物致癌）腐生型霉菌在自然界物质转化中也有十分重要的作用。一、形态和构造营养体由菌丝（hyphae）构成，直径3-10um，菌丝再形成菌丝体（mycelium）菌丝：无隔，多核单细胞，低等真菌，有隔，多细胞，高等真菌菌丝体：营养菌丝，伸入培养基吸收营养气生菌丝，向空中生成，形成繁殖器官。（特化形式）细胞壁厚100-250nm，多含几丁质。二、繁殖与生活史1）无性孢子繁殖不经两性细胞配合，只是营养细胞的分裂或营养菌丝的分化（切割）而形成新个体的过程。无性孢子有：厚垣孢子、节孢子、分生孢子、孢囊孢子等。2）有性孢子繁殖两个性细胞结合产生新个体的过程：a）质配：两个性细胞结合，细胞质融合，成为双核细胞，每个核均含单倍染色体（n+n）。b）核配：两个核融合，成为二倍体接合子核，此时核的染色体数是二倍（2n）。c）减数分裂：具有双倍体的细胞核经过减数分裂，核中的染色体数目又恢复到单倍体状态。霉菌有性孢子繁殖的特点：a）不如无性繁殖那么经常与普遍，在自然条件下较多，在一般培养基上不常见。b）方式因菌种不同而异，有的两条营养菌丝就可以直接结合，有的则由特殊的性细胞（性器官）相互交配，形成有性孢子。c）核配后一般立即进行减数分裂，因此菌体染色体数目为单倍，双倍体只限于接合子。d）霉菌的有性繁殖存在同宗配合和异宗配合两种情况。e）霉菌的有性孢子包括接合孢子、卵孢子、子囊孢子等。霉菌的生活史：无性繁殖阶段：菌丝体（营养体）在适宜的条件下产生无性孢子，无性孢子萌发形成新的菌丝体，多次重复。有性繁殖阶段：在发育后期，在一定条件下，在菌丝体上分化出特殊性器官（细胞），质配、核配、减数分裂后形成单倍体孢子，再萌发形成新的菌丝体。有一些霉菌，至尽尚未发现其生活史中有有性繁殖阶段，这类真菌称为半知菌。霉菌孢子的特点：霉菌具有极强的繁殖能力，可以通过无性繁殖或有性繁殖方式产生大量新个体。虽然其菌丝体上任一部分的菌丝碎片都能进行繁殖，但在正常自然条件下，它们还主要靠形形色色的无性或有性孢子进行繁殖。霉菌的孢子具有小、轻、干、多以及形态色泽各异、休眠期长和抗逆性强等特点。但与细菌的芽孢却有很大的差别。霉菌孢子形态常有球形、卵形、椭圆形、礼帽形、土星型、肾形、线形、镰刀形等。每个个体所产生的孢子数量，经常是成千上万的，有时竟然达到几百亿、几千亿，甚至更多。孢子的这些特点，都有助于真菌在自然界中随机散播和繁殖。对人类的实践来说，孢子的这些特点有利于接种、扩大培养、菌种选育、保藏和鉴定等工作。对人类不利之处则是易于造成污染、霉变和易于传播动植物的真菌疾病。真菌孢子与细菌芽孢的比较：项目 霉菌孢子 细菌芽孢大小 大 小数目 一条菌丝或一个细胞产多个 1个细胞只产1个形态 形态、 色泽多样 形态简单形成部位 可在细胞内或细胞外形成 只在细胞内形成细胞核 真核 原核功能 最重要的繁殖方式 不是繁殖方式，是抗性构造（休眠方式）抗热性 不强，在60-70下易杀死 极强，一般100数十分钟才能杀死产生菌 绝大多数种类可以产生 少数细菌可产生三、菌落粗而长的分枝状菌丝组成，菌落疏松，呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，比细菌菌落大几倍到几十倍，有的没有固定大小。各种霉菌，在一定培养基上形成的菌落大小、形状、颜色等相 对稳定，所以菌落特征也为分类依据之一。四、分类过去依据菌丝体及有性繁殖特征分为三纲一类，藻状菌纲、子囊菌纲、担子菌纲、半知菌类。五、常见常用霉菌中国食用和药用大型真菌(一)食用真菌1、种类资源：担子菌675种，子囊菌45种。通常栽培的仅10多种。2、营养：蛋白含量高，AA多达18种左右，特别是人体必需AA。还含有多种维生素、糖类和矿物质。Lys含量一般较高。3、栽培：发展栽培同时，重视采用菌丝体的深层培养，特别是风味特殊而鲜美的种类。菌丝体培养物可新鲜食用，或冷冻干燥成粉，制成食品。目前栽培广而产而产量大的品种：双孢菇、大肥菇、香菇、草菇、金针菇、侧耳（平菇）、凤尾侧耳、滑菇、银耳、木耳、猴头菌、长裙竹荪等。培养料来源多且广，棉子壳、锯末、秸杆、蔗渣、酒糟等。4、应用：食用子实体、菌丝体深层培养。作调味品、香味、饮料等。（二）药用真菌1、资源：担子菌345种，子囊菌28种，其它11种。2、应用：有20多个方面，主要抗癌、抑菌。目前认为抗癌物质主要是多糖，如香菇多糖、银耳酸性异多糖、芸芝多糖（PSK）、茯苓多糖、猪苓多糖、灵芝多糖等。细胞型生物小结真菌、细菌、放线菌比较：第四章 微生物的营养第一节 微生物的营养要求营养物：必须得到的细胞结构 成分，必须得到的能量储存物质。营养：把营养物从外界吸收至细胞内，复制出新细胞结构的过程。一、 微生物细胞的化学组成 整个生物界大体相同，主要是C、H、O、N（占干重90-97%），C（约50%），此外为各种无机元素，由这些元素再组成化合物。其中C/N一般是5:1。1、水分和无机元素含水70-90%（鲜重），无机元素（3-10%干重）依次为P、S、K、Mg、 Ca、Fe、Zn、Mn等。2、有机物蛋白质,核酸,碳水化合物,类脂,维生素等二、营养物质及其生理功能主要功能：提供合成原生质和代谢产物原料；产生合成反应及生命活动所需能量；调节新陈代谢。（一）碳源物质定义：凡能提供微生物营养所需碳元素的营养源。功能：碳源、能源微生物碳源谱：（二）氮源物质定义：凡能提供微生物营养所需氮元素的营养源。功能：氮源，一般不作能源。微生物氮源谱：氨基酸自养型和异养型生物速效氮源和迟效氮源生理碱性、酸性、中性盐（三）能源化学能：有机物-化能异养微生物无机物 -化能自养微生物光能：光能自养型和光能异养型微生物（四）生长因子定义：一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳、氮源自行合成的所需极微量的有机物。种类：维生素、AA、base、FA等。作用：辅酶或酶活化来源：酵母膏、玉米浆、麦芽汁等，复合维生素。浓度：（五）无机盐所需浓度在10-3-10-4M的元素为大量元素，如P、S、K、Mg、Na和Fe等所需浓度在10-6-10-8M为微量元素，如Cu、Zn、Mn、Mo、Co、Ni、Sn、Se等。主要功能：构成菌体成分；酶活性基组成或维持酶活性；调节渗透压、pH、Eh；化能自养微生物能源等。无机元素来源与功能：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属的化合物，电位和作为某些微生物生长的能源物质等。一些无机元素加入：（六）水存在状态：游离态（溶媒）和结合态（结构组成）生理作用：组成成分；反应介质；物质运输媒体；热的良导体。三 微生物的营养类型(nutritional types) 1光能无机自养型（光能自养型）能以CO2为主要唯一或主要碳源；进行光合作用获取生长所需要的能量；以无机物如H2、H2S、S等作为供氢体或电子供体，使CO2还原为细胞物质；例如：藻类及蓝细菌等和植物一样，以水为电子供体（供氢体），进行产氧型的光合作用，合成细胞物质。红硫细菌，以H2S为电子供体，产生细胞物质，并伴随硫元素的产生。2光能有机异养型（光能异养型）不能以CO2为主要或唯一的碳源；以有机物作为供氢体，利用光能将CO2还原为细胞物质；在生长时大多数需要外源的生长因子；例如，红螺菌属中的一些细菌能利用异丙醇作为供氢体，将CO2 还原成细胞物质，同时积累丙酮。3化能无机自养型（化能自养型）生长所需要的能量来自无机物氧化过程中放出的化学能；以CO2或碳酸盐作为唯一或主要碳源进行生长时，利用H2、H2S、Fe2+、NH3或NO2-等无机物作为电子供体使CO2还原成细胞物质。4化能有机异养型（化能异养型）生长所需要的能量均来自有机物氧化过程中放出的化学能；生长所需要的碳源主要是一些有机化合物，如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等。氧化还原电位：又称氧化还原电势（redox potential），是度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标，其单位是V（伏）或mV（毫伏）。第二节 培养基 培养基（m