草本胶囊CDV-PRO体内外抗菌作用的研究.doc

草本膠囊CDVPRO體內外抗菌作用的研究劉啟（香港啟正寵物獸醫中心）CDV-PRO草本膠囊系德國alfavet公司於2004年開發的純天然草本藥劑（herbal medicine）.其主要成份以HoneySuchle Blumen Extract，Forsythia Extract、Echinacea purp Extract、Mentha piperita Extract、Achillea millefolium Extract為主，以傳統中國醫學理論結合西歐藥物提純技術。具有抵抗炎症，退熱，改善呼吸道症狀，增強免疫機能的作用（anti-infection, reduce fever, improvement of respiratory symptoms Strengthening the immune system）。2008年本中心引進該藥物，使用至今，用於犬貓病毒性呼吸器疾病(caninfeline viral respiratory diseases)的醫治，效果較為理想。為驗證cdv-pro膠囊對犬貓幾種呼吸器感染常見可分離之病原體的抑制效果，通過幾種呼吸器疾病常見致病細菌包括（Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes）的分離鑒定以及對分離菌株進行體內外抗病原體作用的研究，為犬貓常見致病微生物引起的呼吸器疾病的治療和預防提供科學的理論依據。1 材料與方法11材料1.1.1 致病微生物 從本醫療中心幾間分店就診之患寵呼吸器採取的樣本，經細菌形態觀察，生化試驗、以及小白鼠致死性試驗等鑑定上述微生物體為呼吸器致病性病原體。1.1.2 試驗動物 健康atc種小白鼠，體重1820g。由TGH醫療科技公司提供。1.1.3 藥物 CDVPRO膠囊，由VETSHINE醫療貿易行提供。藥劑規格為200mg/cap。將膠囊拆開後，溶解於5ml滅菌蒸餾水中。1.2 方法1.2.1 體外抑制微生物試驗 KB紙片擴散法：將含不同濃度CDVPRO的滅菌紙片（直徑6mm）平置於已均勻涂布好Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes的平板表面，同時以生理鹽水紙片為陰性對照，置37培養24h後取出，測量各紙片周圍抑菌圈直徑。 瓊脂二倍稀釋法：藥液按無菌法依次稀釋至2，4，8，16倍，即濃度分別為0.5，0.25，0.125，0.63，即濃度分別為0.02，0.01，0.005，0.0025g/ml.將已稀釋藥液與普通瓊脂培養基充分混勻，制成含藥物的平板培養基。用接種環取1：1000的Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes等五種懸液，畫線接種於上述含藥平板培養基上，37培養24h，觀察細菌的生長情況，細菌不生長的最低濃度即為該藥物對該菌的最小抑菌濃度（MIC值）。1.2.2 體內抗菌試驗 動物分組及用藥：健康atc種小白鼠250只，雌雄隨機，隨機分為5組，每組10只，CDVPRO設高，低劑量組，劑量分別為15，5G、kg，陽性對照組為amp組，同時設正常對照組和感染對照組。經預試測得感染小白鼠死亡的最小致死量，並作為感染菌量。結果使小白鼠死亡率達到90%的Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes濃度分別是3X 105，6X 107，3X 108，6X 107，6X 105，劑量是0.5ml/只。連續灌胃給藥7D，每天1次，於給藥第4天皮下注射（sc inject）上述Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes菌液（0.5ml/只）感染小白鼠，再連續給藥3D，統計每組小白鼠死亡數。2 結果2.1 體外抑菌作用2.1.1KB紙片擴散法的試驗結果 結果見表1表1.1 各紙片周圍的抑菌圈直徑（Bordetella bronchiseptica）藥物濃度/(g/ml)抑菌圈直徑/mm對照組CDVPRO組CDVPRO組CDVPRO組AMP組0.250.510.507.340.348.320.6514.210.775.310.54表1.2各紙片周圍的抑菌圈直徑（Pseudomonas aeruginosa）藥物濃度/(g/ml)抑菌圈直徑/mm對照組CDVPRO組CDVPRO組CDVPRO組AMP組0.250.510.506.330.359.720.7613.210.988.340.67表1.3各紙片周圍的抑菌圈直徑（Klebsiella）藥物濃度/(g/ml)抑菌圈直徑/mm對照組CDVPRO組CDVPRO組CDVPRO組AMP組0.250.510.507.340.657.670.559.210.375.310.55表1.4各紙片周圍的抑菌圈直徑（Staphylococcus aureus）藥物濃度/(g/ml)抑菌圈直徑/mm對照組CDVPRO組CDVPRO組CDVPRO組AMP組0.250.510.506.340.948.320.8912.210.775.310.34表1.5各紙片周圍的抑菌圈直徑（Streptococcus pyogenes）藥物濃度/(g/ml)抑菌圈直徑/mm對照組CDVPRO組CDVPRO組CDVPRO組AMP組0.250.510.507.780.358.320.6513.280.877.340.74由表1各表可知，CDVPRO在0.25，0.5，1.0g/ml濃度時，對Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes均有明顯抵制作用。隨著CDVPRO濃度的增強，抑菌作用更顯著。抑菌效果均好於amp組。2.1.2 瓊脂二倍稀釋法的試驗結果 在0.0025g/ml的CDV-PRO平皿中可以看到有細菌散在生長，而在0.02，0.01，0.005g/ml的CDVPRO平皿中無細菌生長。因此確定CDVPRO對Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes的MIC值為0.005g/ml.2.2 體內抗菌作用結果見表2表2.1 CDVPRO對Bordetella bronchiseptica感染小鼠的保護作用組別藥物劑量/(g/kg)動物數/只死亡數/只死亡率/%保護率/%正常對照組感染對照組CDVPRO高劑量組CDVPRO低劑量組AMP組155510101010100901409001040101009060表2.2 CDVPRO對Pseudomonas aeruginosa感染小鼠的保護作用組別藥物劑量/(g/kg)動物數/只死亡數/只死亡率/%保護率/%正常對照組感染對照組CDVPRO高劑量組CDVPRO低劑量組AMP組155510101010100902509002050101008050表2.3 CDVPRO對Klebsiella感染小鼠的保護作用組別藥物劑量/(g/kg)動物數/只死亡數/只死亡率/%保護率/%正常對照組感染對照組CDVPRO高劑量組CDVPRO低劑量組AMP組155510101010100901509001050101009050表2.4 CDVPRO對Staphylococcus aureus感染小鼠的保護作用組別藥物劑量/(g/kg)動物數/只死亡數/只死亡率/%保護率/%正常對照組感染對照組CDVPRO高劑量組CDVPRO低劑量組AMP組15551010101010091360901306010907040表2.5 CDVPRO對Streptococcus pyogenes感染小鼠的保護作用組別藥物劑量/(g/kg)動物數/只死亡數/只死亡率/%保護率/%正常對照組感染對照組CDVPRO高劑量組CDVPRO低劑量組AMP組15551010101010091230901203010908070由表2.12.5可知，CDVPRO高，低劑量組可明顯降低小白鼠受Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes感染後的死亡率，對致病性Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes感染的小白鼠有顯著的保護作用。3 小結與討論 體外抑菌試驗結果表明，CDVPRO對犬貓致病性呼吸器的Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes具有較強抵制作用，抑菌效果隨著藥液濃度的升高呈現高效性，瓊脂二倍稀釋法測得MIC值為0.005g/ml；由體內抗菌試驗可見，CDVPRO可以明顯提高致病性Bordetella bronchiseptica,Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella、Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes感染的小白鼠的存活率，有明顯保護作用。試驗從體外，體內兩方面的抗菌作用驗證了CDVPRO具有良好的抗菌作用，具效果顯著，從而為該藥防治犬貓呼吸器疾病提供了一定的藥理學理論依據。 CDVPRO的主要成份為HoneySuchle Blumen Extract，Forsythia Extract、Echinacea purp Extract、Mentha piperita Extract、Achillea millefolium Extract因為受儀器設備的制限，無法做病毒方面的研究，但CDVPRO中各成份起協同作用以及對機會具有免疫作用有關，希望在以後的做進一步的研究。四、参考文献1，狗的疾病认识Part-3-6 犬瘟热 岩元照男 着 大坤书局 19922，犬的病气预防手册 Part-3传染病 练马小动物研究会 着 金园社 19973，金丝桃素对禽流感H5N1和H9N2亚型病毒的杀灭效果 梁剑平20054，The invasive shrub, Lonicera maackii, reduces growth and fecundity of perennial forest herbs Miller KE (Gorchov DL, Miami Univ, Dept Bot, Oxford, OH 45056, USA) ； Gorchov DL Oecologia 2004 年139卷3期5，Regeneration of Lonicera tatarica plants via 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