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晋升网官方域名：FcRIIb基因真核表达质粒的构建与表达 作者：秦三利，黄菱，杨志伟 作者单位：(宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系，银川750004) 【摘要】目的构建FcRIIb基因的真核表达重组质粒pEGFP-FcRIIb，并观察其在真核细胞中的表达。 方法以U937细胞的RNA为模板，通过RT-PCR扩增FcRIIb基因，并将其定向插入绿色荧光蛋白质粒pEGFP-C1中，构建真核表达重组质粒pEGFP-FcRIIb。经PCR、限制性核酸内切酶Hind 和Sma I的酶切鉴定及DNA序列分析后，用脂质体法将pEGFP-FcRIIb转染NIH3T3细胞，用荧光显微镜观察pEGFP-FcRIIb的表达。 结果扩增出了963bp的FcRIIb基因，成功构建了真核表达重组质粒pEGFP-FcRIIb。在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光，表明pEGFP-FcRIIb 成功转入NIH3T3 细胞，并在NIH3T3 细胞中得到了表达。结论构建的真核重组表达质粒pEGFP-FcRIIb能够表达FcRIIb蛋白，为进一步研究FcRIIb的功能奠定了基础。 【关键词】 FcRIIb ; pEGFP-FcRIIb;蛋白表达 FcRIIb(Fc gamma receptor IIb，FcRIIb)是一种抑制性受体，该受体的胞内区含有ITIM(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif，ITIM) 抑制基序，可通过免疫复合物与激活型受体交联，对众多含ITAM(Immunoreceptor Tyrosine- based Activation Motif，ITAM)的受体发挥负调节作用1-2，是维持机体外周免疫耐受平衡的关键受体。研究发现，FcRIIb表达的下降或缺失可引起自身免疫疾病3，因此，对于抑制性受体FcRIIb功能的深入研究有望为临床上自身免疫疾病的治疗提供新的思路和途径。本研究旨在构建FcRIIb基因的重组质粒pEGFP-FcRIIb，并在真核系统中表达，为进一步研究FcRIIb的免疫学功能奠定基础。 1材料和方法 1.1材料 人组织淋巴瘤细胞U937细胞来源于上海科学院细胞库;克隆宿主大肠杆菌DH5、质粒pEGFP-C1均由本室保存;琼脂糖凝胶回收试剂盒、纯化试剂盒、2Taq PCR MasterMix及RT-PCR试剂盒均为TIANGEN公司产品;质粒提取试剂盒购自E.Z.N.ATM Omega公司;内切酶Hind 和Sma I购于Fermentas公司;T4 DNA连接酶购自BioLabs公司;TRIzol总RNA抽提试剂及Lipofectamine2000均为Invitrogen公司产品。 1.2方法 1.2.1FcRIIb基因的扩增 根据Genebank的FcRIIb序列，自行设计两对FcRIIb基因的特异性引物，分别在5端和3端加上限制性内切酶Hind 以及Sma I的酶切位点和保护碱基，两对引物的碱基序列分别如下：第一对引物：上游引物p1：5-CCCAAGCTTTAGGGTAGA ATCCGCCAAGC-3下游引物p2：5- TCCCCCGGGAGGCCAGGAAATACCAGATC-3第二对引物：上游引物p3：5-GACGGCCCCAAGCTTATGGGAATCCTGTCATTCTTACC-3下游引物p4：5-TCCCCCGGGGAATTCCTAAATACGGTTCTGGTCATCAG-3。培养U937细胞，待其处于对数生长期时，按Trizol试剂盒说明书提取细胞的总RNA，用微量核酸定量仪测定其浓度和纯度。逆转录过程按试剂盒说明书进行。 PCR反应体系：cDNA 3L，p1(10 mol?L-1) 1L，p2(10 mol?L-1) 1L,2Taq PCR MasterMix 12.5L，无RNase水7.5L。反应条件为：预变性95 3 min，变性95 30s，复性56 45s，延伸72 1min，共35个循环，总延伸是72 5min。反应完成后，依此次PCR反应产物为模板进行巢式PCR。其反应体系：模板PCR产物3L，P3(10 mol?L-1) 2L，P4(10 mol?L-1) 2L,2Taq PCR MasterMix 50L，无RNase水 43L。反应条件与上述反应条件相同。第2次PCR扩增产物经1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测后，用普通琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。 1.2.2质粒pEGFP-C1的制备 将含有质粒pEGFP-C1的大肠杆菌接种于含卡那霉素(30mg?L-1)的LB固体培养基中，培养过夜后，挑取一个单菌落接种到5mL含卡那霉素(30mg?L-1)的LB液体培养基中，于37恒温摇床中培养过夜，收集菌液，用质粒提取试剂盒提取质粒pEGFP-C1。 1.2.3pEGFP-FcRIIb重组质粒的构建 用Hind和SmaI 双酶切扩增的FcRIIb基因及载体pEGFP-C1，将纯化后的FcRIIb基因及载体pEGFP-C1按摩尔比21加入连接体系，加入T4 DNA连接酶后，于16反应16 h，转化已制备好的200L DH5感受态细胞中4，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37培养12h，筛选阳性克隆，提取重组质粒DNA。将构建的重组质粒命名为pEGFP-FcRIIb。 1.2.4重组质粒的鉴定 提取重组质粒pEGFP-FcRIIb后，对所提质粒采用引物P3、P4进行PCR鉴定及用限制性内切酶Hind 和Sma I分别对重组质粒pEGFP-C1-FcRIIb进行酶切鉴定。将经过PCR及酶切鉴定阳性的重组质粒pEGFP-FcRIIb送上海生工生物技术有限公司测序。 1.2.5重组质粒pEGFP-FcRIIb转染NIH3T3细胞 分别挑取含重组质粒pEGFP-FcRIIb和空质粒pEGFP-C1的单个菌落，接种于5mL含有卡那霉素(30mg?L-1)的LB液体培养基中，于37恒温摇床中培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒。复苏冻存于液氮中的NIH3T3细胞，将其培养于含10%胎牛血清的DMEM 中，置37、5%CO2恒温培养箱中培养。当NIH3T3细胞处于对数生长期时，在24孔板中接种(0.52)105个mL-1细胞，加500L完全培养基于37、5%CO2恒温培养箱中培养。转染时，实验分空白对照组、空质粒pEGFP-C1对照组和重组质粒pEGFP-FcRIIb组。 分别将0.8g质粒DNA和2L脂质体稀释于50L不含双抗的DMEM中，轻混匀，室温孵育5min。而后将二者混合，室温孵育20min，制备复合物。将复合物按每孔100L加入到24孔板中，于37、5%CO2培养箱中培养。4 h后弃掉孔中复合物，更换含血清的新鲜培养基DMEM。转染2448h后可通过荧光显微镜直接观察瞬时转染的情况。即用PBS清洗爬片2次，40 g?L-1多聚甲醛固定30 min，甘油封片，在荧光显微镜下观察结果。 稳定转染：转染24h后，以110传代培养细胞，1d后将培养基更换为含G418(300mg?L-1)的DMEM完全培养基中继续培养，每2d更换1次培养液，当空白对照孔细胞全部死亡时，G418含量减半，继续扩大培养，持续3周可获得稳定转染。 2结果 2.1FcRIIb基因的PCR扩增 FcRIIb基因的扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，得到一条约960bp的条带，与预期FcRIIb基因片段大小一致(图1)。M： D2000 marker; 1： PCR 产物;2： 阴性对照图1FcRIIb 基因的PCR扩增产物电泳结果 2.2重组质粒pEGFP-FcRIIb的PCR鉴定及酶切鉴定 重组质粒pEGFP-FcRIIb进行PCR扩增后，得到一条约960bp的条带，符合预期长度的DNA片段大小。用Hind 对重组质粒pEGFP-FcRIIb进行单酶切后，电泳结果显示有约6360bp的相应条带出现;用Hind 和Sma I 双酶切后，电泳结果显示同一泳道出现约5400 bp和约960bp的两条条带。重组质粒pEGFP-FcRIIb的单酶切和双酶切结果均与预期结果相符(图2)。M1： DNA 2000 marker;1： PCR产物;2： Hind 酶切质粒pEGFP-FcRIIb;3： Hind 和Sma酶切质粒pEGFP-FcRIIb;4： Hind 酶切质粒pEGFP-C1;M2： DNA 8000 marker图2重组质粒pEGFP-FcRIIb的PCR及酶切鉴定结果 2.3重组表达载体 pEGFP-FcRIIb的基因序列测定结果 本研究中所构建的重组载体pEGFP-FcRIIb的测序结果通过BLAST软件与GenrBank中FcRIIb的序列进行相似性比较，结果发现二者的同源性为99%，其中，有5个碱基位点发生突变，分别为第298位A-G、第302位T-A、第335位G-A、第533位A-G、第775位C-A，基本上未影响抗原决定基，对蛋白质的空间结构和功能没有大的影响(图3)。 2.4荧光显微镜检测pEGFP-FcRIIb在细胞中的表达 重组表达载体pEGFP-FcRIIb转染的NIH3T3细胞，在荧光显微镜下可见细胞膜和细胞3期秦三利，等.FcRIIb基因真核表达质粒的构建与表达图3pEGFP-FcRIIb重组质粒与GeneBank中FcRIIb序列的比对结果内均有较强的绿色荧光，表明pEGFP-FcRIIb已成功转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得瞬时表达。而空质粒pEGFP-C1转染的NIH3T3细胞和空白对照组在荧光显微镜下均未检测到绿色荧光(图4 见封2)。 3讨论 FcRIIb是一种抑制性受体，由FcRIIb基因编码，其广泛表达于嗜中性粒细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞中，而在T细胞和NK细胞中没有发现表达5-6。与激活性受体相比，FcRIIb主要通过依赖于其胞浆区ITIM结构域的方式，与免疫复合物结合后引起ITIM结构域中酪氨酸的磷酸化，导致肌醇磷酸酶(SHIP)和SHP-1等分子的募集，抑制相关激酶参与的细胞活化效应，介导对多种免疫细胞功能的负反馈调节反应3。FcRIIb还可以通过不依赖ITIM的信号传导方式导致自身反应性B细胞凋亡。当细胞表面BCR封闭或缺乏BCR信号时，FcRIIb可由同型受体在B细胞上的集聚，通过Btk和Jnk，依赖于c-Abl家族激酶成员发出凋亡信号，介导细胞凋亡7。作为Fc受体家族中唯一的抑制性受体，FcRIIb的抑制作用对于维持机体免疫系统活化和抑制的平衡，保持正常的免疫功能是非常重要的。当FcRIIb活性缺失时，可引起机体免疫调节的失衡，亲细胞抗体和免疫复合物诱导免疫效应增强，最终可能会导致自身免疫疾病的发生2。研究显示，FcRIIb基因启动子附近的多态性可以引起FcRIIb在活化的B细胞转录和表达的下降，引发如红斑狼疮等的自身免疫性疾病3,8。对小鼠模型的研究发现，当敲除FcRIIb基因时，小鼠更容易诱发自身免疫性疾病9。 研究发现，抑制性受体在固有免疫和适应性免疫应答的负调控中起关键作用，其可控制由抗原抗体免疫复合物介导的免疫反应。最新研究表明，恢复系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)小鼠B细胞上的FcRIIb的水平，可修复自身耐受，阻止自身免疫疾病的发生10。2008年Werwitzke又证实可溶性的FcRIIb胞外区能够治疗NZB/NZW F1小鼠模型的免疫复合物引起的系统性红斑狼疮11。 本实验选用载体pEGFP-C1，主要考虑： pEGF P-C1表达载体含有CMV启动子，具有高效表达的能力;pEGFP-C1包含一系列调控所需的功能元件。如果在荧光显微镜下观察到绿色荧光，表明目的基因在NIH3T3细胞中有效表达。这不仅简化了实验的步骤，也降低了实验的费用。实验中选用的NIH3T3细胞是一株小鼠的成纤维细胞，常用来做转染及基因表达的研究。此类细胞株能表达SV40病毒编码的产物-大T抗原，从而激发SV40复制起点的起始复制。此外，NIH3T3细胞还可以产生一些带SV40复制起点的DNA进行复制时所必须的辅助性因子12，促进DNA的复制。由于质粒pEGFP-C1含有SV40复制起点，因此在转染NIH3T3细胞后，在其所表达的大T抗原的作用下能够进行稳定的复制并传代，从而保证了外源目的基因在NIH3T3细胞中的高效表达。本研究采用RT-PCR技术从U937细胞中提取总RNA，依RNA为模板，加入上下游引物后扩增得到963bp 的FcRIIb全部基因，同时将扩增的目的片段定向插入真核载体pEGFP-C1，经过PCR、酶切及生物公司测序鉴定后，成功构建了重组表达载体pEGFP-FcRIIb，并在NIH3T3细胞中能有效的表达，为进一步研究该受体的免疫学功能奠定了基础。（晋升网（）是目前国内收录中文最多最权威医学杂志、医学杂志；网罗和甄选海量优秀医学论文，提供免费全文阅读。网站可以实现文章内容的全文检索，可以提供医学论文的免费查询、阅读、下载以及提供最及时的医学信息，最丰富的医学文献 ，最权威的期刊杂志，最有效的学习方法）。 【参考文献】 1Daeron M.Fc receptor biologyJ.Annu Rev Immunol,1997,15：203-234. 2Cohen-solal J F，Cassard L，Fridman WH，et al.Fc receptorsJ.Immunol Lett,2004,92：199-205. 3Tarasenko T，Dean JA，Bolland S.FcRIIB as a modulator of autoimmune disease susceptibility J.Autoimmunity September,2007,40(6)：409-410. 4J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南M3版.科学出版社，2002：96-98. 5席俊.huFcRII线性结合表位的鉴定及对SLE小鼠的治疗效果D.吉林大学，2009：8-10. 6Stefanescu RN，Olferiev M，Liu Y，et al.Inhibitory Fc gamma receptors： From gene to disease J.Clin Immunol,2004,24(4)：315-326. 7Tzeng SJ，Bolland S，Inabe K，et al.The B cell inhibitory Fc receptor triggers apoptosis by a novel c-Abl-family kinase dependent pathwayJ.J Biol Chem,2005,280(42)：35247-35254. 8Blank MC，Stefanescu RN，Masuda E，et al.Decreased transcription of the human FCGR2B gene mediated by the -343 G / C promoter polymorphism and association with systemic lupus erythematosusJ.Human Ge