生化全面质量控制及试剂盒的选择与评价 PPT课件

1 生物化学检验的质量控制 2 质量控制 qualitycontrol QC 是利用现代科学管理的方法和技术检测分析过程中的误差 控制与分析有关的各个环节 确保实验结果的准确可靠 也称为实验室质量保证 定义 3 1947年Sundeman首先调查发现不同实验室对同一份标本的实验结果有惊人的误差 1950年Levey和Jennings就将工业质控图移植临床生化实验室 此后 质控图和数理统计一直成为临床生化检验质量控制 QC 的重要手段 1953年世界上出现了商品性的控制血清 1954年发展到国与国之间的质量调查 1960年代初已发展为全面质量控制 1974年在日本召开了第一次临床生化检验质量控制国际专题讨论会 随后WHO和国际临床生化学会都设有质控领导机构 向各国提供标准品和控制物 领导和管理国际性的质量控制工作 专业化发展 4 本章主要内容第一节全过程质量控制第二节室内质量控制第三节室间质量评价第四节实验室认可第五节试剂盒的选择和评价 5 目标和要求1 掌握临床生化检验全过程质量控制的主要内容及室内质量控制的主要方法 室间质量评价的概念和方法 VIS评分法和PT方案的操作和判断指标 2 熟悉室内质量控制的任务及失控后的处理和原因分析 试剂盒的选择和评价 3 了解多规则质控技术 实验室认可的定义和组成 6 第一节全过程质量控制 主要步骤全面质量控制的内容 分析前质量控制 分析中质量控 分析后质量控制 7 全面质量控制的内容主要包括标本分析前的质量保证 分析中的质量控制和分析后的质量评估三个主要过程的质控 它们之间的实验保证体系见图4 1 二 全面质量控制的内容 8 内容主要为 人员的素质和稳定性 实验室的设置和工作环境 实验仪器的质量保证 检测方法的选择和评价 试剂盒的选择与评价 病人准备 标本的采集 处理和储存 实验室用水等 一 分析前质量控制 9 内容主要包括 标本的正确处理和应用 项目操作规程的建立 室内质控和结果分析 登记和填发报告等 二 分析中的质量控制 10 内容主要有 运送实验报告 室内质控的数据管理 参加室间质评 病人投诉调查 临床信息反馈等 三 分析后的质量评估 11 图4 1全面质量控制实验保证体系 分析后质量评估 分析中质量控制 病人准备 检查病人申请检验 标本采集 标本运送 标本处理 人员素质工作环境实验用水实验室管理 仪器质量保证方法选择与评价试剂选择与评价 建立操作规程室内质控及分析标本分析测定 临床医师 反馈信息 室内复查 保留标本随时复查 运送报告病人投诉室间质评 登记填发报告 分析前质量保证 分析中质量控制 12 第二节室内质量控制临床生化实验室常规开展的室内质控 Internalqualitycontrol IQC 旨在检测和控制常规工作的精密度和准确度 提高常规工作中天内和天间标本检测的一致性 能及时地 准确地报告检验结果 13 人员培训建立标准化操作规程仪器的检定与校准质控品 一 室内质量控制的任务 14 实验室每个工作人员都应对开展质量控制工作的重要性 基础知识 一般方法有充分的了解 并在实践过程中不断学习 提高 每个实验室都应培养一批开展质控工作的技术骨干 1 人员培训 15 标准化操作规程 standardoperationalprocedure SOP 包括仪器使用及维护的操作规程 试剂 质控品 标准品等使用的操作规程和每个检验项目的操作规程等 2 建立标准化操作规程 16 对本实验室的相关仪器如分光光度计 量具 自动生化分析仪以及其它测定仪器等要定期按要求进行检定和校准如对自动化分析仪 分光光度计的摩尔吸收系数 的定期校准 所有校准和检定都应有时间 结果 变更和频度的记录和说明 3 仪器的检定与校准 17 18 为质控目的而制备的标本称为质控品 质控品含有与测定标本同样的基础物质 通常为小牛血清 其分析物应具有参考值 病理值和医学决定水平三种水平浓度 4 质控品 定义 19 是指对临床诊治疾病具有决定性作用的被分析物的浓度 是临床上按照不同病情给予不同治疗方案而确定的阈值 医学决定水平 定义 20 某一测定成分可有多个医学决定水平 如血糖有四个决定水平 2 5mmol L表示低于此值出现低血糖症状 6 6mmol L表示空腹时确定糖尿病的水平 10mmol L表示出现尿糖 16 5mmol L以上出现高血糖昏迷 特点 21 根据质控品的物理性状不同分为冻干质控品 液体质控品和混合血清等 根据有无测定值可分为定值 蓝色标签 质控品和非定值 红色标签 质控品 各实验室可根据各自的情况选用以上一种质控品作为室内质控品 质控品的种类 22 人血清基质 分布均匀 无传染性 添加剂和调制物的数量少 瓶间CV 酶类应小于2 其它应小于1 冻干品复溶后稳定 2 8 时不少于24小时 20 时不少于20天 某些不稳定成分 如BIL ALP等 在复溶后4小时的变异应小于2 在实验室的有效期应在一年以上 合理的成本 质控品应具有的特征是 23 严格按质控品说明书操作 冻干质控品的复溶要确保溶剂的质量 冻干质控品复溶的加量要准确一致 冻干质控品复溶应轻轻摇匀切忌剧烈震摇 质控品应按规定方法保存不用超期品 质控品要与标本同样测定条件下测定 质控品的正确使用和保存 24 二 室内质量控制的主要方法 确定质量目标设定靶值和控制限Levey Jennings质控图多规则质控技术 25 质量目标是实验室选用的质控方法所需达到的目标 质量目标可用总允许误差的形式表示 目前中国尚未确立各项目的总允许误差 可参考美国 表 和欧洲 表 一 确定质量目标 26 最佳变异 optimalconditionsvarianceOCV 表示实验室在最佳条件下测定项目所能达到的最好精密度水平 常规变异 routineconditionsvarianceRCV 表示实验室在常规条件下测定项目所能达到的精密度水平 RCV20CV时 不可接受 二者是反映实验室工作水平的基础指标 也是开展室内质控工作的基础工作 最佳变异和常规变异的设定 27 1 稳定性较长的质控品 暂定靶值的设定 对新批号的质控品进行测定 根据至少20次质控测定的结果 计算出平均值和标准差 作为暂定靶值和暂定标准差 常用靶值的设立 以最初20个数据和三至五个月在控数据汇集的所有数据的累积平均数作为质控品有效期内的常用靶值和常用标准差 2 稳定性较短的质控品3 特殊情况的处理 二 设定靶值和控制限 28 对新批号的质控品应确定控制限 控制限通常是以多个标准差表示 即以标准差的倍数表示 不同项目 定量测定 的控制限要根据其采用的质控规则来决定 4 设定控制限 29 均数 标准差 s 质控图是临床最常用的质控图 以监测分析的精密度 均数 标准差 S 质控图 三 evey ennings质控图 根据前面确定的靶值 和标准差绘制 s质控图 得到均值线 警告线 2s 和失控线 3s 与质控图制作相同批号的控制血清 每天随病人标本分析 结果点在图上 直线连接 1 方法 30 d 均数 2S 2S 3S 3S 正常分布 31 正常分布规律 95 数据落在 2s内 不能有连续5次结果在同一侧 不能有5次结果渐升或渐降 不能连续2个点落在 2s以外 不应该有落在 3s以外的点 2 结果分析 32 d 均数 2S 2S 3S 3S 正常分布 33 趋势变化 漂移 精度变化 均数 标准差质控图 3S 3S 2S 2S d 均数 34 漂移 提示存在系统误差 趋势性变化 说明试剂或仪器的性能已发生变化 精度变化 提示测定的偶然误差较大 如仪器 试剂不稳定等 异常表现 35 1 方法 要求在常规条件下 同时测定2份定值质控血清 并要求质控血清所含测定物浓度最好分别为医学决定水平的上限 高值 或下限 低值 或者是分析方法测定范围的上限和下限 将测定结果分别绘成2份不同浓度的 s质控图 当有一份质控血清测定值处于质控图上2s 3s界限内 发出 警报 信号时 即应采用其余各条规则对质控图进行全面检查 若符合其中一条 就应把该批分析测定的结果判为 失控 2 Westgard多规则质控法 36 12S警告规则 当2份质控血清中的任意1份测定值处于 2s 3s界限内 为 警报 信号 12 5S规则 若有一个质控结果超过 2 5s提示存在随机误差 13S规则 当2份质控血清中的任意1份测定值超过 3s界限 为 失控 提示存在随机误差 R4S规则 同一批中二个质控结果之差超出4s范围 其中一个超出 2s限值 另一个超出 2s限值 为 失控 属随机误差过大 2 判断规则 37 22S规则 同批两个质控品结果同方向超出 2s限值 或同一质控品连续两次质控结果超出 2s限值为 失控 多由系统误差造成 41S规则 当1份质控血清的测定结果连续4次超过 1s或 1s界限 或2份质控血清的测定结果同时连续2次超过 1s或 1s界限时 为 失控 一般由系统误差所至 7T规则 当7个连续的质控结果呈现向上或向下的趋势 提示存在系统误差 10规则 当1份质控血清测定结果连续10次偏于均值一侧时 或2份质控血清的测定结果同时连续5次偏于一侧时 为 失控 是系统误差所致 38 操作者在测定质控时 如发现质控数据违背了质控规则 应填写失控报告单 对失控结果要进行回顾 检查 重复测定 或另取质控品分析 或检查仪器 试剂和操作等 以纠正失控 三 失控后处理 39 第三节室间质量评价 室间质量评价 externalqualityassessment EQA 是指多家实验室分析同一标本 由外部独立机构收集 分析和反馈实验室检测结果 评定实验室常规工作的质量 观察实验的准确性 建立起各实验室分析结果之间的可比性 40 鉴定实验室的工作缺陷 操作程序 制度 建立方法的可接受限 鉴定方法的可信性 为实验室执照评定或认可提供客观依据 评价实验室工作人员的能力 评价实验室结果的可比性目的是通过实验室间的比对 观察各实验室结果的准确性 一致性 并采取一定措施 使各实验室结果渐趋一致 一 室间质评的目的 41 二 室间质评应具备的条件 要有一支素质较高的质控技术队伍 室间质评要有室内质控的基础 要有良好质控血清作为调查样本 样本定值方法可靠 有参考实验室作后盾 统一测定方法及校准品 42 1 方法组织若干实验室 共同在规定时间内测定同一批样品 收集测定结果 作统计分析并按规定评分 二 室间质评的方法 43 能力比对分析 proficiencytesting PT 是室间质量评价技术方案之一 现已成为全球性室间质量保证系统的主要内容 以保护病人的利益和公众的福利 PT方案是通过实验室之间的比对判断实验室的检测能力的活动 美国国会1988年临床实验室修正案 Clinicallaboratoryimprovementamendment CLLA 88 强制性地将PT作为实验室认可的主要内容之一 能力比对分析 44 表4 3美国CLIA 88能力比对检验对临床化学的分析质量要求 45 46 国际CLIA 88的PT方案规定 临床生物化学项目每年至少进行3次PT调查 每次调查至少包括5个不同的质控样本 在一年内 对于任一项至少可得15个测定结果 通过各实验室间持续的比较 作出结果判断 一 方法 47 针对某一项目的得分 Score S1 对调查的全部项目的得分 S2 二 计算 48 国际CLIA 88技术细则规定 S1 S2均应大于80 否则判为不满意 且如果S1或S2连续两次或两次以上不满意 即为失败 对于某一个接受结果 不再进行优劣分级 三 判断 49 PT是对实验室常规工作进行评价的活动 目的是为了全面提高检验的质量 所以对PT调查的标本应完全按照病人标本一样对待 与病人标本同时进行分析 切忌互相核对结果 这样才能反映实验室真正的日常工作水平 各实验室应该与PT组织者密切合作 解决实验中出现的各种问题 不断提高检验质量 四 目的意义 1 目的 50 通过能力比对分析可获得本实验室与使用同一方法的其他实验室结果的差异 以及与做同一试验但使用不同方法的实验室结果比较的情况 能力比对分析还可评价实验室的分析能力 监控实验室可能出现的技术问题 可作为实验室质量保证的外部监督工具 2 意义 51 变异指数得分法1985年全国临床检验质量控制会议上通过的提案 建议变异指数得分计算公式如下 V VI 其中 为各实验室某项目的测定值 T为靶值 V为变异百分数 VI为变异指数 CCV为已选定的变异系数 补充 52 表4 5WHO推荐的CCV值 K Na Cl Ca2 P3 Glu 2 91 62 24 07 87 7 5 77 78 93 97 59 6 BUNUACrTPAlbTBI 53 判断标准 一 在计算时 VIS只计整数位 不带正负符号 当VI 400时 VIS VI 当VI 400时 VIS 400 WHO的标准为 VIS 50为优秀 VIS 100为良好 VIS 150为及格 54 二 我国的标准为 VIS 80为优良 80 VIS 150为及格 VIS 200 表明结果中有临床上不允许的误差 VIS 400的测定结果会造成临床的严重失误 是绝对不许可的 55 VIS方案过去运用的相当广泛 但随着科学的发展 已暴露出自身的不足 比如说酶 HDL 胆固醇等指标已成为当今实验室的常规项目 但由于VIS方案还没有给出它们的CCV值 所以无法计算VIS 而CCV值的确定是一个复杂而漫长的过程 并需要随着仪器的更新随时进行调整 从而使VIS的计算值无法真正代表当前的实际水平 VIS方案的评价 56 一 定义实验室认可 laboratoryaccreditation 是由权威性专业组织按照一定的标准对实验室或实验室工作人员进行检查 考核 认可能够开展或胜任某些工作 并授予资格的过程 第四节实验室认可 57 认可委员会 一系列标准及档案 经选拔和培训并取得资格的评审员 二 基本组成 58 第五节试剂盒的选择和评价 本节主要内容生化检验试剂的发展生化诊断试剂的制备试剂盒的选择和评价 59 临床生化试剂盒临床生化商品试剂与标准液按检测项目组合成一套放在一个包装盒内叫试剂盒 reagentkit 或叫试剂组合 reagentset 与自动化分析仪匹配的试剂盒的研制 生产和供应走向产业化的道路 它无疑是临床生化发展史上一个巨大的技术进步 60 第一节试剂盒的分类和发展 临床生化诊断试剂种类繁多 有液体型 粉剂型 片剂型 有单一试剂 双试剂 干试剂 多试剂等 纵观近20多年来的发展 临床生化体外诊断试剂盒的分类和发展历史可表示如下 61 化学分析法 方法学物理性状组合形式操作方式 液体型自配试剂 液体多剂型试剂 手工法多步操作 酶法分析 干粉片型试剂 液体单剂型试剂 流动离心式分析仪 免疫学法 液体型商品试剂 液体双剂型试剂 任选分立式分析仪 干化学法 干式多层胶片型试剂 单剂型干片式试剂 干片式分析仪 62 一 液体型试剂优点是液体型试剂的试剂组分高度均一 瓶间差异小 测定重复性好和使用方便 它也无需加入任何辅助试剂及蒸馏水 避免了外源性水质对试剂的影响 性能较稳定 测定结果较为准确 缺点是液体型试剂 尤其是酶试剂 保存时间较短 不便于运输 一 液体型试剂和粉 片 剂型试剂 63 所谓液体单试剂就是将某种生化检验项目所用到的试剂科学地混合在一起 组成为一种试剂 应用时 只须将标本和试剂按一定比例混合 即可进行相应的生化反应 然后用适当的方法检测结果 1 液体单试剂 64 内源性甘油给甘油三酯测定的干扰 内外源性NH4 对尿素酶法测定的干扰 内源性丙酮酸对ALT AST测定的干扰等 维生素C和胆红素对Trinder反应的干扰 单试剂存在抗干扰能力差的缺点 给测定结果带来相当大的分析误差 例如 65 所谓液体双试剂就是将某些生化检测项目所用到的试剂 按用途科学地分成两类 分别配成两种试剂 通常第一试剂加入后可起到全部或部分消除某些内源性干扰的作用 第二试剂为启动被检测物质反应的试剂 两种试剂混合后才共同完成被检项目的生化反应 然后用适当的方法检测结果 2 液体双试剂 66 所谓粉剂型及片剂型试剂 即是将试剂的各组分用球磨技术粉碎成粉剂或混合后压成片剂 使用前再加入指定的溶液复溶成液体试剂 二 粉 片 剂型试剂 67 用固体原料研磨后制成粉剂或片剂 则存在许多问题 要使试剂各组分混合得非常均匀 技术难度很大 分装过程中的称量误差及复溶时加水量的准确性影响试剂的瓶间差 水质优劣对试剂的稳定性和测定的可靠性有相当大的影响 68 二 其它类型试剂 一 快速反应试剂盒如血液葡萄糖快速测定试剂盒 二 一步法试剂盒如直接测定出高密度胆固醇 三 多项同测组合试剂盒 四 卡式试剂盒 五 浓缩试剂盒 69 液体双试剂盒的特点 一 提高了抗干扰反应的能力 二 使测定更科学合理 三 稳定性能优良 四 试剂组分高度均一 70 第二节临床生化诊断试剂的制备 诊断试剂 包括标准品 的质量是影响分析质量的一个主要因素 因而在试剂研制生产过程中推行标准化的要求是保证试剂质量的关键所在 71 一 标准品的制备 1 必备的主要条件 纯度高 定值准确可靠 稳定性好 在保管 使用有效期内其示值误差不超出证书的许可范围 均一性好 任何一份分装的小样品都具备整个标准物质的特性指标 2 附加条件 摩尔质量尽可能大 具有符合使用目的之反应特性 制造简便 价格低廉 购买方便 标准物质的组成若发生变化 如吸潮 时 可采用重新干燥 恒重 等措施使其复原 72 二 标准液的配制 2 标准液的质量鉴定不论是实验室自行配制或厂家生产的标准液 都需要认真地按照国家卫生部的规定做好质量检定 提出的规范化的要求和质量检定标准 并在标准液制备过程中应该严格检定程序 使其达到质量标准 1 标准液配制的依据供临床生化常规测定用的标准液属于二级标准物质 其示值的准确性对检验质量有重大影响 必须在标准物质选择 恒重方法程序 基质 包括水 的质量 最优化的配方和制备工艺上都要严格按照我国卫生部医政司主持编写修订的 全国临床检验操作规程 1997年5月 第二版 的要求进行 73 三 标准液的正确使用 1 应采购诊断试剂正规生产厂家生产的商品标准液 尤其有国家卫生部生产文号的产品 2 一瓶标准液只能使用一次 避免反复冻融 反复使用 尤其是标准物质稳定性较差的标准液 如尿素 葡萄糖 胆红素 白蛋白等 以及标准液的基质易挥发的标准液 如用无水乙醇配制的胆固醇标准液等 更应注意 3 定值质控血清只能用于临床生化室内质量控制及室间质量评价 不能用作常规分析的标准物质 也不能用于相应物质含量的标化或仪器分析性能准确性的评价 4 按照各种标准液不同保存条件妥善保管 并在其有效期内使用 74 二 试剂中常用工具酶的质量保证 一 工具酶的概念工具酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶 它是酶试剂的核心 它的质量是酶试剂质量的决定性因素 在临床生化领域里 目前已设计出几百种酶试剂系统和测定方法 用于200多个临床生化检验项目 使酶试剂方法成为最有发展前途的分析方法 可以预见 在不远的将来 现有的临床生化分析方法将基本上被酶试剂方法所取代 75 二 工具酶的来源和理化特性 临床生化酶试剂中的工具酶主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程 在早期 酶多由含酶丰富的动植物组织提取 在当代 除了脲酶 过氧化物酶 乳酸脱氢酶等分别由豆类种子 辣根和心肌中提取外 工具酶主要依赖微生物发酵工程获得 微生物发酵工程包括高产酶菌种的筛选 放大培养和酶提取纯化三个部分 不同来源的同一种工具酶有不同的理化特性 为了更有效地发挥工具酶的催化效能 形成最佳的酶试剂配方 必须确切地掌握该酶对底物的专一性 分子量 等电点 Km 最适pH 最适温度等理化特性参数 并熟悉辅助因子 激活剂和抑制剂对酶活性的影响 76 三 工具酶的纯度要求 不同的酶试剂系统对工具酶的纯度有不同的要求 以NADH的生成或减少作为指示反应的测定系统中 由于组织匀浆中往往含有NADH 细胞色素C还原酶 它将消耗NADH而出现干扰反应 因此要求该测定系统的工具酶有较高的纯度 而在Trinder反应中 由于人体液中氧化酶较少 产生副反应的机会较少 因此对测定系统中工具酶的纯度要求相对低一些 衡量工具酶纯度的要求指标是 1 酶的比活性酶的比活性是评价酶纯度的最好标准 即每毫克 酶 蛋白所具有的酶活性 U mg 酶的比活性越高 酶的纯度越高 一般要用推荐的酶活性测定方法测定 2 杂酶含量为了兼顾工具酶的较低生产成本和保证酶试剂质量 对工具酶中容易引起副反应的其他酶 即所谓杂酶 含量提出了 允许限度 的要求 见表6 2 但是目前尚未有国家卫生部或中华医学检验学会的推荐标准 77 三 缓冲液的配制 一 缓冲液的组成缓冲液是临床生化诊断试剂的重要组成部分 由于它对外来的H 和OH 有双向调节作用 因而能为酶试剂中的待测物质反应提供最适pH 以利于这些酶最大限度地发挥其催化效能 也为以酸碱指示染料作为显色剂的试剂提供稳定的pH环境 以保证这些试剂和方法有准确可靠的测定结果 一般的缓冲剂都由一共轭酸及一共轭碱组成 酸性 缓冲液含有一弱酸及其盐 共轭碱 碱性 缓冲液含有弱碱及其盐 共轭酸 共轭酸和共轭碱一起可阻止溶液pH发生剧烈的变化 78 二 缓冲液的缓冲容量 缓冲液维持pH恒定的效力取决于其缓冲容量的大小 缓冲容量是指使1L溶液的pH改变个1pH单位所需要的酸或碱量 mol 缓冲容量决定于盐与酸 或碱 的真实浓度及两者的比值 缓冲液的浓度越高 缓冲容量越大 一般的缓冲液总浓度在0 05 0 2mol L之间 当总浓度固定时 盐与酸 或碱 的比值为1时 其缓冲容量最大 如果两者比值相差10倍以上时 则缓冲容量将大为减小 在实际工作中 不能无限制地加大缓冲液的浓度来增加其缓冲容量 因为盐类浓度过高将抑制酶的活性 对电泳分离也有不利的影响 79 三 配制缓冲液的注意事项 1 所有试剂最好选用分析纯或优级纯 并必须恒重后方能配制 具体的恒重方法因试剂种类而有不同 如 琥珀酸 甘氨酸 巴比妥及其钠盐放在氯化钙干燥器中至恒重 用柠檬酸钠 含2H2O 及柠檬酸 含H2O 不需恒重直接配制其溶液 无水醋酸钠 在100 下干燥3h 醋酸溶液用分析纯冰醋酸直接配制 然后再用氢氧化钠标准液进行标定 2 所用仪器必须清洁 容量仪器最好经过校正 以保证准确 3 配好的缓冲液必须用酸度计校正其pH值 准确至小数点后两位 如对其浓度有怀疑时 则应用滴定法检查其浓度 80 一 检查包装是否完整 二 试剂质量初评 三 试剂性能特征的评估 第三节 试剂盒的选择和评价 81 一 检查包装是否完整 商品试剂盒不仅应具有优质的试剂内容 而且应有完整牢固的包装和详尽明确的说明书 1 外包装外包装应完整牢固 封口严密 2 内包装内包装应有清晰完整的标签 牢固贴于容器表面 3 说明书内容包括试剂名称 用途 测定原理和技术要求 标本要求 卫生部批准的文号等 82 一 说明书审查说明书是用户了解和正确使用试剂盒的指南 审查内容包括 试剂名称 用途 测定原理和技术要求 试剂盒内的包装内容 适用仪器 83 一 说明书审查 标本要求 测定步骤及注意事项 贮存的条件及有效期 性能特征 包括准确度 精确度 特异性 受干扰的程度 线性范围