酶传感基础.doc

酶固定化与反应l 酶，是特异性生物催化剂。 酶蛋白辅助因子（即：辅酶，辅基，或金属离子）全酶IGlucoseImaxIl 酶分类：氧化还原酶 (如：E.C. 1.1.3.4：葡萄糖氧化酶)转移酶， 水解酶， 裂解酶， 异构酶， 连接酶l 酶活性：以在规定条件下，每分钟能催化转化1微克分子的底物所需要的酶量为一个活性单位。常以Unite/mg或Unite/mL为单位。不同公司生产的酶活性定义不同，不好直接比较。l 酶催化反应动力学过程： ， ，称为米氏常数，Vk2Etotal,叫做最大速度，当v=V/2时KmS，所以米氏常数是反应速度为最大速度一半时底物的浓度。可见米氏常数越小说明底物浓度很小时酶仍能保持高的反应速度，也就是酶活性越高。（注意，米氏常数并不是最大可检测的底物浓度的一半，而是反应速度为最大速度一半时底物的浓度。）变化为线性形式：，根据此方程可算米氏常数。在电化学中用电流代替反应速度可写成：*，斜率为Km*Glucose oxidase （Gox, GOD）的反应：GOD：MW：186 000， （sigma，niger），从黑曲霉素提取的GOD分子量不同，Km一般为9.61033.310-2 M，4度下能稳定6-12个月干粉0下可保存2年,-15下可保存8年。pH为5.5时活性最大。等电点：pH4.2GOD酶蛋白FAD（黄素二核苷酸，是活性中心和氧化还原中心）总反应：分步反应： 第一代生物传感器 缺点：受溶解氧含量影响第二代：不用氧M：为二茂铁、天青I等氧还剂，缺点：介体固定困难，泄漏第三代： GlucoseGluconic acidO2H2O2Gluconic acidMredMredGlucoseGluconic acidGlucose分子导线为何要用酶传感？使无电响应的物质有响应，使响应慢的响应快，使广泛的响应变为特异性的响应。以上三类都涉及酶的固定化，如何固定酶于电极表面？程琼，嘉兴高等专科学校学报1999，12（2）40-43吸附法，包埋法，交联法（戊二醛），载体耦联法，载体很重要，要求量大，活性高，保存时间长。纳米SiO2，有序Al2O3孔，不同大小的金胶纳米例子的影响，壳聚糖改性，CNT修饰，环糊精可能大大改善酶固定化后的活性（但是一定要求是纳米级）。如何研究酶电极反应？1.活性，可以分别在buffer和glucose中慢扫线性伏安法（稳态）观察电流大小，斜率2.响应，搅拌下恒电位加样，做“台阶”；或不搅拌在不同glucose浓度中测恒电位测稳态电流，或以不同glucos中峰高为响应。在线性范围内可计算Km3.关于除氧，要看原理。关于电位范围，要看原理。4.作用机制，光谱：UV，IR，AFM，SECM等表征如：Au纳米GOD活性增强，Au的UV，GOD的UV，Au纳米GOD的UV，IR（或SERS）光谱变化说明结合的键，AFM看看形貌，SECM算算电子转移速率常数。FAD的结构：酶的固定化在生物传感器中的应用OpticalElectrochemicalPiezoelectricalThermalAmperometricPotentiometricImpedanceI. GenerationII. GenerationIII. GenerationGlass electrodeIon-selective electrodeIon-sensitive field-effect transistor (ISFET)l 传感器类型： l 电化学生物传感器基本原理：如下图，l 固定化技术决定着酶生物传感器的稳定性、灵敏度和选择性，其应满足以下条件（3S）：保持良好的生物活性sensitive；酶层与换能器紧密接触；酶层具有良好的稳定性stable；减少酶层中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选择性selective。l 酶的固定化方法:吸附法包埋法交联法共价键结合1. 吸附法酶的物理或化学吸附是一种简单的固定化技术，条件温和，可保持酶的生物活性。通过酶分子的极性键、氢键或疏水键作用，将酶吸附于不溶性载体上。可供选择的载体包括天然或人工合成的无机与有机高分子材料等，如再生丝素 、凝胶树脂、多孔SiO2 、分子筛等。缺点是酶与固体表面结合力弱，在表面上进行任意取向的不规则分布，使制得的生物传感器易发生酶的泄漏，灵敏度低 。2. 包埋法包埋法一般是采用凝胶/聚合物包埋，将酶包埋于聚合物胶、膜或表面活性剂基底中，是较为直接、更接近生物体的一种固定化方式。直接将酶混入石墨粉中进行包埋 。电聚合高分子包埋法是通过将导电高分子单体和酶混合溶解于电解液内，在电解聚合生成导电聚合物膜的同时，可以将酶包埋于高分子聚合物膜内，直接固定于电极表面。导电高分子聚合物的典型代表有聚吡咯（PPy），聚苯胺（PAn）和聚噻吩（PTh）等。将酶包埋在类脂层中。 3. 交联法交联法是在温和的条件下，游离酶的氨基酸残基与双官能团或多功能团交联剂反应而被固定化，可获得酶蛋白单位浓度较高的固定化酶。最常用的交联试剂为戊二醛，与蛋白质的自由氨基反应，其原理反应式如下：载体NH2 + OHC-(CH2)3-CHO + NH2酶 载体NH-CH(OH)-(CH2)3-CH(OH)-NH酶常用的载体有硅胶，尼龙，聚酰胺膜。该法的缺点主要有：反应难以控制，形成的酶蛋白层膨松，坚固性差，所需生物样品量多，扩散阻力大以及酶蛋白在多分子的固化层中活性降低。4. 共价键结合将酶通过共价键与电极表面结合而固定的方法称为共价键合法，通常要求在低温、低离子强度和生理pH条件下进行，当共价键在生物分子的非活性部位键合时，被固定的生物分子仍能保持较高的活性。通过共价键合法固定的酶具有良好的稳定性。共价键合法的过程通常包括三个步骤：a. 基体电极表面的活化；b. 酶的偶联；c. 除去键合疏松的酶。共价键合法存在的问题主要有：共价键合反应使酶的活性损失较大，且操作过程复杂。共价键合的主要方法：a. 碳二亚胺缩合法b. 重氮盐偶联法c. 混合酸酐法d. 琥珀酰亚胺活化法e. 过碘酸盐氧化法l 酶的自组装：l 酶的结构1. Microperoxidase MP-11 (1.9 kDa) redox protein obtained by proteolytic digestion of horsecytochrome c.2. Cytochro