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成 绩大连民族学院制药工程综合训练报告题 目： 野菊花抗氧化药理研究 完 成 人： 杨蕊蕊 班 级： 制药132 指导教师： 李兴太 设计日期：2016年11月7日12月30日 目录1 野菊花化学成分研究进展11.1 绿原酸11.2 黄酮类11.3 挥发油类21.4 氨基酸21.5 多酚21.6 其他成分32 野菊花的药理活性研究进展32.1 抗氧化作用32.2 抗诱变作用32.3 抗肿瘤作用42.4 抗血小板聚集42.5 抗病原微生物、抗感染作用42.6 抗炎镇痛和免疫作用52.7 急慢性呼吸道感染52.8 泌尿生殖系统感染62.9 皮肤感染62.10 保护心脑细胞作用62.11保肝作用72.12 降压作用72.13 其他作用72.14 结语73 野菊花化学成分及药理作用研究83.1 仪器与试剂83.1.1 实验仪器83.1.2 实验试剂83.1.3 试验药液制备83.2 实验方法93.2.1 Fe2+螯合能力的测定93.2.2 还原力的测定93.2.3 羟自由基的测定103.3 实验结果与分析103.3.1 野菊花对的Fe2+螯合能力10.3.2 野菊花还原力测定结果112.3.3 羟自由基测定结果123.3.4 结论13参考文献14171 野菊花化学成分研究进展野菊花为菊科植物野菊的干燥头状花序,味苦辛,性微寒,归肝,心经,清热解毒,用于疔疮痈肿,目赤肿痛,头痛眩晕。其为生长于路边、山坡、荒地及林缘的多年生草本植物,主要分布在东北、华北、西北、华东及西南等地区。野菊花中含有挥发油、黄酮类化合物、绿原酸及其他多种化学成分。现代药理研究证明：野菊花具有广谱抗菌、保护心脏、降压、解热、抑制血小板聚集、增强免疫、抗炎、抗病毒、清除氧自由基、抗肿瘤等作用。野菊花生物活性多样，清香怡人，同时药源广泛，价格低廉，在多个领域具有较大的开发潜力。1.1 绿原酸绿原酸是一种缩酚酸,具有广谱抗菌、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等多种药理活性,是许多生药和中成药的质量控制指标。绿原酸也是野菊花的一种主要活性成分。袁学勤等1用HPLC法测定5批不同产地的野菊花中绿原酸的含量,结果表明差异显著。谭晓杰等2通过RP-HPLC法测定野菊花中绿原酸的含量,为野菊花质量评价提供了可靠的依据;其后又对野菊花注射液中绿原酸和咖啡酸的含量进行RP-HFLC法测定,亦得到稳定数据3。1.2 黄酮类野菊花中黄酮类化合物主要有木犀黄酮贰、刺槐素试、金合欢素-7-0-a-L吡喃鼠李糖基(l6)-D吡喃葡萄糖苷、金合欢素-7-0-a-L吡喃鼠李糖基(l6)2-O-乙酰基吡喃葡萄糖基(l2)-D-吡喃葡萄糖试化合物、木犀草素、洋芹素、野菊花黄酮苷4-5.1.3 挥发油类菊花具生物多样性,因地理环境、产地的差异,其挥发油含量及成分也不同。广西、广东、湖北等地野菊花均含有樟脑、a-侧柏酮、4-松油醉、1,8-按叶脑、乙酸冰片醋和桃金娘醇,但含量不同6。已鉴定子午岭野菊花挥发油化学成分38种,占精油总量84.23%,主要是-石竹烯、棕榈酸乙醋、芳樟醉、糠醛、4-甲基儿茶酚、月桂酸，其中萜类25种,有机酸及其酯类共6种,其它酚类3种,烷烃2种及其它成分2种7。陈耕夫等对野菊花超临界CO2:萃取,GC-MS分离出85个色谱峰,鉴定出50种化合物,其中烷烃类占56.9%,烯类占2.7%,醇类占7.0%,酮类占4.2%。野菊花脂肪酸甲醋化样品中分离出34个色谱峰,鉴定出20种化合物,占气化产物总量的58.96%8。 1.4 氨基酸王庆兰等对我国8 大主流菊花氨基酸种类及含量进行测定，结果表明，8 种菊花均含有17 种氨基酸，包括人体所需的 8 种必需氨基酸 ；菊花中以门冬氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸的含量高，胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸含量低。黄菊除含有 8 种菊花共有的 17 种氨基酸外，还含有胱氨酸，并且在所测氨基酸中除天门冬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸外的 15 种氨基酸含量均较其他品种菊花高，从氨基酸含量看其质量较优。怀菊除脯氨酸、羟脯氨酸含量高外，其他 15 种氨基酸含量均较低 ；贡菊含有 4 种氨基酸 ( 天门冬氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、羟脯氨酸 )，在 8 种菊花中最低9。1.5 多酚多酚是分子中具有多个羟基的酚类植物成分的总称，植物中多酚的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素。植物多酚又称植物单宁，具有多酚结构，是植物体内的复杂酚类次生代谢产物，主要存在于植物的皮、根叶、壳和果肉中。植物多酚在自然界中的储量非常丰富，因具有独特的抗氧化功能活性，植物多酚目前已广泛应用于医学、食品、制革和日用化工等领域，并发挥着不可替代的作用。同时，随着天然产物开发利用的逐渐兴起，植物多酚类物质已成为天然产物9。1.6 其他成分野菊花尚含有山嵛酸甘油酯、棕榈酸、多糖、- 胡萝卜素、蛋白质、氨基酸、嘌呤、胆碱、水苏碱、鞣质、维生素、叶绿素等成分。另外，不同品种和产地的野菊花都含有人体必需的多种微量元素，而且钙、镁、铁的含量比菊花中的高。野菊花黄色素颜色鲜艳，色泽自然、安全，是一种具有广泛开发前景的食品添加剂9。2 野菊花的药理活性研究进展2.1 抗氧化作用野菊花的抗氧化作用是近年来的一个新发现。野菊花多糖(CIP)不仅能增强免疫力,还有抗衰老等多方面的药理作用。李贵荣10报道由野菊花经提取分离纯化后得到水溶性多糖,并采用邻苯三酚自身氧化反应为产生超氧阴离子自由基模型,采用Fenton反应为产生羟自由基模型,以紫外和可见分光光度法试验观察CIP对模型中产生的O2-和OH-的影响,结果表明:CIP具有较强的清除活性氧自由基的能力。有报道野菊花水提液对离体大鼠心、脑、肝、肾LPO都有不同程度的抑制作用;野菊花水提液还可提高体内抗氧化酶的活力。此外,还有研究表明用乙醇提取野菊花中的黄酮类化合物,亦具有显著的抗氧化作用,且抗氧化作用随着药液浓度的增加而增强,具有明显的量效关系4。2.2 抗诱变作用菊花对环磷酰胺诱变的小鼠骨髓 PCE 微核率有明显的抑制作用，平板掺入法实验也证实，菊花对由 2-氨基芴诱发的 TA98 或 TAl00 菌株的回复突变有明显的抑制作用。也有研究报道，菊花黄酮对黄曲霉毒素B等影响肝脏代谢酶的物质及放射引起的基因突变有抑制作用9。2.3 抗肿瘤作用金沈锐等11采用直接将药物加入培养液的方式,以MTT法观察野菊花注射液在不同浓度下对人肿瘤细胞SMMC7721、PC3、HL60增殖的影响,发现野菊花注射剂在32mg/ml浓度下对人肿瘤细胞株PC3、HL60增殖有明显抑制的作用,该体外实验表明野菊花注射液能抑制人肿瘤细胞株PC3、HL60增殖,具有一定的抑瘤作用。菊藻丸为野菊花和海藻的复方制剂,临床用于多种恶性肿瘤的治疗。药理研究发现,菊藻丸具有直接细胞毒作用药物,对小鼠淋巴白血病细胞L1210细胞、人胃癌803细胞、人宫颈癌海拉细胞的生长有明显的抑制作用5。2.4 抗血小板聚集对雄性家兔进行野菊花注射液对ADP诱导的颈动脉血小板聚集功能的抑制作用和解聚作用实验,利用回归法计算,发现其作用强度在一定范围内随药物在血浆中的浓度增加而增加,而且野菊花注射液的作用强度显著强于丹参、党参。同时,野菊花注射液的解聚作用也很强,其50%的解聚剂量相当于丹参的60%剂量、党参的50%剂量左右,但解聚作用较抑制作用弱12。2.5 抗病原微生物、抗感染作用野菊花挥发油抑菌实验研究表明,不同产地野菊花均对金黄色葡萄球菌有抑菌作用,对白色葡萄球菌的抑制作用显著,但其抑菌作用的程度有一定产地差异13。任爱农等14对野菊花水提物与挥发油的抑菌和抗病毒活性实验研究结果表明,二者均具抑菌和抗病毒活性。对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓假单胞菌、福氏志贺菌的抑制作用及抗病毒活性水提物强于挥发油,而对肺炎链球菌则相反。周丽萍等15采用琼脂稀释法测定野菊花、白花蛇舌草、复金钱草等中草药对71株解脲脲原体抑菌作用,发现野菊花抑菌效果明显,且随浓度升高而增强。彭敬红16研究发现野菊花对浅部真菌也有抑制作用。张振亚等17报道在体外实验条件下,野菊花提取物对呼吸道合胞病毒有一定抑制作用。据报道,野菊花用沸水浸泡后再煎,可用于预防上呼吸道感染和慢性支气管炎发作; 100%的野菊花注射液可用于治疗呼吸道感染18。药理实验证明,野菊花能降低金黄色葡萄球菌溶血素的效价,对金黄色葡萄血浆凝固酶的形成有一定的抑制作用,并能使三联菌苗致热家兔的体温降低以对抗细菌毒素或抑制毒性产物对机体的影响,这些研究为野菊花治疗一般感染性疾病提供了药理作用基础19。2.6 抗炎镇痛和免疫作用野菊花挥发油明显抑制二甲苯小鼠耳肿胀:水提物抑制蛋清大鼠足坨肿胀,明显降低小鼠碳粒廓清速率:二者均能显著抑制2,4-二硝基氯苯引起的小鼠迟发型超敏反应1181。野菊花总黄酮对小鼠耳肿胀、大鼠足爪肿胀和棉球肉芽肿均有抑制作用;在0.0550 mgL-1,浓度依赖性地抑制PMO中PGEZ和LTB4的产生。野菊花总黄酮(84,168,336 mgkg-1)灌胃给药能明显抑制佐剂性关节炎(AA)大鼠的继发性足肿胀:减轻非致炎侧踩关节的组织水肿与炎细胞浸润,提高低下的脾淋巴细胞增殖水平,抑制腹腔巨噬细胞产生过高的IL-1水平,提高脾淋巴细胞IL-2水平。野菊花正丁醇部位抑制小鼠耳肿胀度,提高小鼠脾细胞生成抗体水平及绵羊红细胞免疫小鼠的血清中IgG和IgM水平,增强小鼠单核-巨噬细胞的吞噬指数和碳粒清除速率,增强小鼠的迟发型超敏反应。野菊花栓对大鼠的角叉菜胶足肿胀、急性细菌性前列腺炎、异物性子宫炎及小鼠的醋酸性腹膜炎等均有一定的抑制作用;对小鼠腹膜醋酸致痛及热板致痛等有抑制作用。野菊花总黄酮0.05,0.5,5,50 mgL-1明显抑制大鼠腹腔巨噬细胞PGE2和LTB4的产生。野菊花对III变态反应有抑制作用,降低可溶性白细胞介素2受体(SIL-2R)形成;对IL-6、TNF-a也有抑制作用。野菊花抗炎和免疫功能,可能与其影响PGE2和LTB4的生物合成,平衡细胞因子有关,活性成分可能与黄酮类有关。2.7 急慢性呼吸道感染 野菊花及其复方可用于感冒、流感、脑膜炎、慢性支气管炎等的预防和治疗。野菊花全草挥发油注射液,治疗急性支气管炎100例,显效88例,对发热、咳嗽、哮喘等症状改善较为明显。双花喷雾剂(野菊花、金银花、鱼腥草、柴胡、薄荷油)治疗小儿上呼吸道感染208例,总有效率99.03%。2.8 泌尿生殖系统感染野菊花栓用于治疗前列腺炎及慢性盆腔炎等疾病,能够促进局部组织微循环,加强新陈代谢,软化纤维组织,调整局部生理机能,促进前列腺的炎症消退和修复。尤其对非细菌性前列腺炎及改善症状效果明显。野菊花栓治疗慢性细菌性、非细菌性前列腺炎,对改善疼痛或不适、排尿症状和生括质量均有效,前列腺液白细胞显著下降。野菊花栓治疗急、慢性盆腔炎效果明显。热淋清联合野菊花栓治疗尿道炎后前列腺炎40例,总有效率67.5%。应用中药野菊花散外用治疗慢性宫颈炎患者100例,成功率达95%-98%。在低盐饮食加西药基础上加野菊花复方(野菊花、鱼腥草、蒲公英、车前子草、白茅根、土茯苓、赤芍等),治疗急性肾小球肾炎330例,取得满意效果。2.9 皮肤感染野菊花为中医治疗热毒疮疖要药,常配伍金银花、蒲公英、紫花地丁及天葵子为五味消毒饮内服以治疗疮疖、脓肿、乳腺炎等。野菊花每日5g,用250-300mL开水冲泡后代茶饮,治疗传染性软疣49例,总有效率87.76%。金银花和野菊花的有效成分制成药膏,治疗面部湿疹和寻常痤疮各30例,治疗湿疹的总有效率为76.7%,治疗痤疮的总有效率为76.7%14。2.10 保护心脑细胞作用 近年研究显示，TFC 可降低小鼠心肌肥厚指数和心肌 Ang含量，起到防治心肌肥大、心室重构作用。其机理主要是通过调节心肌MMP-2、MMP-9 蛋白和 mRNA 的异常表达，降低神经内分泌因子和心肌型胶原蛋白，改善心肌纤维化；另外，吴琦等20-21。研究表明，TFC 可通过降低心肌胶原容积分数（CVF）、心肌血管周围胶原容积分数（PVCA），缩小压力超负荷大鼠左室心肌细胞横截面积，减少心肌胶原沉积等作用机理，在防治心肌肥大、心室重构中发挥作用。野菊花提取物可抑制大鼠脑组织的单胺氧化酶活性，降低大鼠脾脏辅助 T 细胞的数量，起到神经保护作用22。在体外建立的人SK-N-SH 神经细胞缺乏葡萄糖损伤模型中，野菊花水提液能明显增强损伤的神经细胞活力，其作用机理有待进一步研究23。2.11保肝作用王保伟等24研究发现 TFC 对大鼠酒精性脂肪性肝炎具有较好的防治作用，其作用机理是降低血清天门冬氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、乙醇脱氢酶（ADH）、肿瘤坏死因子-（TNF-）水平，降低肝脏中丙二醛（MDA）含量，增强肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性。另外，病理组织学显示 TFC 能明显改善该大鼠的肝细胞脂肪变性25。2.12 降压作用 有研究比较了95%、50%和25%乙醇热浸及水提取的野菊花浸膏对麻醉猫的降压作用,发现乙醇浓度越低,提取到的成分降压效果越差,水提物基本无降压作用;野菊花95%乙醇浸提物主要含有野菊花内酯和黄酮苷等水难溶物质,对麻醉猫或正常狗均有一定的降压效果,而且降压作用缓慢、持久,是较理想的降血压药物5。2.13 其他作用 野菊花水煮醇沉液，静脉注射银环蛇或眼镜蛇蛇毒中毒的小鼠，死亡率比对照组低 ；但对尖吻蝮蛇蛇毒中毒的小鼠无效。菊藻丸为野菊花和海藻的复方制剂，临床用于多种恶性肿瘤的治疗，药理研究发现，菊藻丸具有直接细胞毒作用，在 2,186mg/mL、2,816mg/mL 药物浓度对小鼠淋巴白血病细胞 L1210 细胞、人胃癌 803 细胞、人宫颈癌 Hella 细胞的生长有明显的抑制作用11。2.14 结语我国野菊花资源丰富,存在生物多样性,大部分品种尚未开发研究,现有中成药主要有野菊花栓、野菊花注射液、菊藻丸,大多数以各种复方汤剂形式使用。野菊花具有广谱抗菌作用,抗氧化和抗炎作用广泛,心血管系统作用有较大潜力。另外,野菊花可药食共用,生津止渴、清热解毒,饮用芳香甘醇,作为健康饮品受广大人群喜爱,有较大的市场前景。3 野菊花化学成分及药理作用研究3.1 仪器与试剂3.1.1 实验仪器AEG220电子天平：Shimadzu Libror，日本；Polystat 34恒温水浴锅：Techne，美国。721可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。3.1.2 实验试剂1、HEPES：称HEPES 0.952 g用去离子水定容至200 mL；2、0.6mg/mL EDTA：称固态EDTA 0.012 g用去离子水定容至20 mL； 3、0.375 mM 硫酸亚铁：称取FeSO47H2O 0.02 g，用去离子水定容到200 mL；4、0.2M PBS (pH6.6) (磷酸盐缓冲液): 称3.66 g 磷酸氢二钠，0.538 g 磷酸二氢钠和0.9g 氯化钠，用去离子水定容至100mL.5、 2.25mM Ferrozine：称取Ferrozine 24 mg，用去离子水定容至20 mL；6、1% K3Fe(CN)6：称取K3Fe(CN)6 200 mg，用超去离子水定容至20 mL；7、0.5mg/mL BHT：称取20mgBHT，用无水甲醇定容至40 mL；8、0.1mM 过氧化氢: 称取0.2mL 50mM的过氧化氢，并用去离子水定容至100 mL；9、1%H2O2：取0.3ml 30% H2O2加8.7ml H2O。10、1 mg/mL 氯化铁：称取氯化铁0.02 g，用去离子水定容至20 mL；11、5 mM邻二氮菲:称取198 mg邻二氮菲，加入C2H5OH 20mL，混匀，取2 mL加水稀释至20 mL；12、7.5mmol/L FeSO4：21 mg FeSO47H2O加超纯水10 ml。3.1.3 试验药液制备称取0.5g野菊花，加去离子水50ml，放于电炉上加热熬制30min后，过滤，收集滤液，将滤渣加去离子水40ml继续熬制20min后，再次过滤，将两次过滤所得滤液合并，加热浓缩至10ml，制得50mg/ml的药品溶液。3.2 实验方法3.2.1 Fe2+螯合能力的测定（1）取11支干净的试管并分别对其进行编号；（2）按照下表所示，分别向各试管中加入不同试剂的药品，并摇匀；（3）在室温放置20min后，在562nm处测各管的吸光值，并将实验数据记录下来。表1 野菊花对Fe2+螯合能力的测定系统编号调零对照(1)对照(2)阳性对照(1)阳性对照(2)阳性对照(3)阳性对照(4)样品(1)样品(2)样品(3)样品(4)Hepe（L）29002800280027902780277027602790278027502700药品(L)1020501000.6mg/mL EDTA(L)102030400.375 mM 硫酸亚铁(L)1001001001001001001001001001001002.25mM Ferrozine（L）100100100100100100100100100100吸光度0.0000.3730.3760.1680.0420.0070.0090.2880.3020.3220.350结果以螯合率表示，以EDTA为阳性对照，按下式计算。 螯合率/% = （A对照A样品或EDTA）/A对照100 3.2.2 还原力的测定将药、PBS、铁氰化钾和水按表剂量加入，用超纯水将样品管补足至3 mL, 50放置20分钟加1mL TCA(100g/L) 3000rpm 10分钟，离心后取上清1.5mL +1.4ml H2O+0.1mL FeCl3 (1g/L) 测定A700 ，记录数据。表2 野菊花还原能力的测定系统编号调零阳性对照(1)阳性对照(2)阳性对照(3)阳性对照(4)样品(1)样品(2)样品(3)样品(4)0.2MPBS (L)5005005005005005005005005001%铁氰化钾(L)500500500500500500500500500药品(L)1020100200BHT (L)1020100200H2O(L)500490480400300490480400300吸光度0.00 0.0330.0670.0785 0.150.0990.2160.8021.215 3.2.3 羟自由基的测定将试管分为调零、空白对照、对照、阳性对照和样品组，各管按表配试剂，样品管中加入不同剂量药品，加入1%H2O2后37温水浴60分钟，测定A536 ，结果如图所示。表3 野菊花对羟自由基清除能力的测定系统编号调零空白对照(1)空白对照(2)对照(1)对照(2)阳性对照(1)阳性对照(2)阳性对照(3)阳性对照(4)样品(1)样品(2)样品(3)样品(4)5mM邻二氮菲（l）09090909090909090909090900.2MPBS(l)30002750275026002600259025802550250025902580255025007.5mMFeSO4(l)0160160160160160160160160160160160160药品(l)102050100BHT(l)1020501001%H2O2(l)150150150150150150150150150150吸光度0.0000.3070.3090.1000.0870.1080.1200.1050.1580.0970.1120.1250.181对OH的清除通过式下式计算。SR/%= （A1A0）/（A2A0）100式中：A0为对照组（加H2O2但不加样品和BHT）吸光度；A1为样品或BHT组吸光度；A2为空白对照组（不加样品、BHT和H2O2）吸光度。3.3 实验结果与分析3.3.1 野菊花对的Fe2+螯合能力本测定系统中A562值会随着测定系统中Fe2+ 含量的减少而减少，本实验结果如下表所示，药品组吸光值明显比对照组小，表明药品野菊花对Fe2+具有螯合能力，并且，实验数据还表明，在本实验所用的浓度范围内，药品对Fe2+的螯合能力是随着实验剂量的增加而降低。表4 野菊花对Fe2+螯合能力的影响组别浓度 (mg/mL)A562螯合率(CR%)对照组0.3730.376EDTA0.0020.16855.00.0040.04288.70.0060.00798.10.0080.00998.0ACV0.1670.28822.80.3330.30219.00.8330.32213.71.6670.3506.17图1 野菊花对Fe2+螯合能力的影响.3.2 野菊花还原力测定结果本实验以野菊花还原Fe3+作为测定野菊花还原能力指标，A700会随着还原能力的增强而增大，实验结果表明，野菊花具有良好的还原能力，且在本实验的剂量范围内，随着野菊花的增加其还原能力增强。表5 野菊花对还原力的影响组别浓度(mg/mL)A700BHT0.0030.0330.0070.0670.0330.07850.0670.15药品0.3330.0990.6670.2163.3330.8026.6671.215图2 野菊花对还原力的影响2.3.3 羟自由基测定结果本实验以Fe2+-H2O2诱导羟自由基的产生作为测定系统，吸光值A536将会随羟自由基含量减少而增加，实验结果表明，野菊花在实验所运用的试剂范围内，其对羟自由基清除能力随着剂量的增加而增强。 表6 野菊花对羟自由基清除能力的影响组别浓度(mg/mL)A536清除率（SR%）空白对照组0.3070.309对照组 0.1000.087BHT0.0020.1050.0240.0030.1080.0390.0080.1200.0970.0170.1580.280ACV0.1670.0970.0140.3330.1120.0580.8330.1250.1211.6670.1810.391图3野菊花对羟自由基清除能力的影响3.3.4 结论有以上结果可以看出，在一定浓度范围内，野菊花对Fe2+有一定的螯合能力，随着实验剂量的增加而增强；野菊花具有良好的还原能力，随着野菊花量的增加其还原能力增强；野菊花对羟自由基有很好的清除能力，随着实验剂量的增加而增强。参考文献1 袁学勤,迟静波,胥 云. 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