第六章32P示踪技术.ppt

第六章32P示踪技术 6 1示踪剂及标记方法一 产品制剂1 能量 半衰期 射线能量大 1 7112Mev 测量方便 但使用时要注意防护 半衰期较短 T1 2 14 3天 便于废物处理 33P Emax 0 249Mev T1 2 25 3天 在电镜自显影和分子生物学等领域应用较多 在后面介绍 2 产品形态 有载体和无载体的磷酸盐 如 32P K2HPO4 32P KH2PO4 32P Na2HPO4 32P NaH2PO4 口服液 磷 32P 酸钠 注射液 磷 32P 酸钠 胶体磷 32P 酸铬注射液 二 标记方法1 肥料标记 核农学P 320 合成法 把32P结合到其中一种成分中去 如可在制备过磷酸钙时 在硫酸中加入32P标记的磷酸盐 用这种硫酸处理磷矿粉 制得的过磷酸钙 除有正常结构外 还有分布均匀的32P示踪原子 32P 磷酸盐 硫酸 处理磷酸粉 32P 标记过磷酸钙 实验室内用32P H3PO4制备标记磷酸铵H332PO4 NH3 NH4H232PO4或H332PO4 2NH3 NH4 2H32PO4 交换法 最常用的标记方法 用32P标记的磷酸盐溶液与普通过磷酸钙肥料混合 搅成糊状 保持若干小时 在此过程中不断搅拌 甚至可以加温至70 左右 以促进肥料中的31P与加入的32P进行同位素交换 直到达到相对平衡 然后烘干 磨细备用 中子活化法 标记难容性矿粉时 用同位素交换法 其速度极为缓慢 可直接把磷矿粉放入原子反应堆中 用中子轰击磷矿粉的方法 中子通量一般不低于1012 13n cm2 sec 使磷矿粉中的31P获得中子后变为32P 31P n 32P r 这种比较方法可使磷矿粉中的其它元素同时被标记 在使用前需将短半衰期的放射性核素进行冷却衰变 在操作及样本测量时 也需要注意其它被活化的放射性核素 如45Ca 46Sc 60Co等放射性的防护和叠加干扰 冷却 Cooling 通过放射性衰变来减弱强放材料的放射性活度的方法 2 土壤标记 将32P标记液注射或喷洒到土壤中 或与土壤均匀混合 可用于测定肥料利用率 磁带土壤有效养分 研究土壤中根条活力 根际磷吸收 耗竭等 3 植物标记 根部引入 用土培 水培或砂培等 地上部分引入 叶面喷涂 茎根注射 主要用于研究植物对磷的吸收 运转和代谢等 4 离体标记 研究磷的运转 代谢等 5 其他 微生物标记通过培养介质标记 单细胞藻类也可通过培养介质标记 如将32P K2HPO4加到培养钝顶螺旋藻的培养液中 可得到32P 钝顶螺旋藻体 进而可用标记的藻体用作鱼饵料的研究和珍珠蚌摄食的研究 核农学通报 1987 2 7 8 6 232P样品的制备和测量一 活体样和鲜样 可以把活体测量看作是测量固体样品的特殊方式 例如 在研究32P标记的肥料自土壤进入植物体的速度时 即要进行活体测量 可用钟罩型计数管进行植物活体测量 活体测量虽然简单易行 但误差很大 一般只能粗略的定性测定 新鲜样品的策略是把新鲜样品采回 稍许加工 不进行灰化 或烘干即进行测量 主要有 打孔法 和 匀浆法 见农学中同位素示踪技术P 122 上述鲜样组织的测样 虽然手续简便 迅速 但误差很大 一般仅能判断同位素在各组织器官中大致的放射性活度 二 干样 粉样 50 100mg 皿 无限薄 均匀 三 湿灰化 1 HClO4 H2O2法 慢灰化 起泡法 2 H2SO4 H2O2法 消煮葛才林等 小麦干粉0 5g 加Na2H32PO4 加3mlHClO4和3mlH2O2 加热起爆至无色 碱液稀释到10ml 闪烁测量 四 干灰化 500 550 马福炉中灰化4 5h 至灰白色 用2NHNO3溶解 蒸发至半干 过滤定容 测量方法 定标器 契伦可夫 液体闪烁测量等 6 3植物对磷的吸收利用和代谢研究一 植物体内32P代谢组分的提取和分离 见实验资料 陈子元主编 核技术及其农业科学中的应用 P518 519 二 磷的吸收 运转研究 1 磷的吸收 运转和小麦生长发育的关系王志芬等 核农学通报 93 14 4 171 179 2 磷在棉株中的吸收 运转和分布规律许萱等 3 磷素代谢研究离体小麦根和叶中32P的转化 P520 521陈子元 核技术及及其农业科学中的应用 6 4磷肥利用的研究一 原理 1 利用标记磷肥 根据同位素稀释原理 Pf Sf PT SP Pf PT SP SfPf 植物中吸收自肥料的磷含量 PT 植物体内的总磷 SP 植物中比活度 Sf 肥料中比活度 Pf PT为植物吸收的肥料磷占植物中总磷的比值 简称Pdff 则吸自土壤P的比值为1 Pdff 磷肥利用率 植物吸收肥料P2O5 mg 应用的肥料P2O5 mg 100 Pdff PT 应用的肥料P2O5 100 2 利用标记土壤 将标记的磷酸盐与土壤充分拌匀 使土壤磷获得标记 然后在这种标记突然施入未标记的磷肥 以不施磷肥的对照 种植作物 收获后 植物材料烘干 消化 或灰化 测总P和32P活度 按下式计算磷肥利用率 PE Pf f P PS f 1 f P Pe r re Pf 吸自肥料的磷 f 施用的肥料磷 PS 吸自土壤的磷 r 为施磷肥植株32P放射性活度 re 为不施磷肥处理植株32P放射性活度 Pe 不施磷肥处理植株吸磷量 二 实例 各种矿质磷有效性的直接评价R D Armstrong等 plantAl Variscite这四种形态P 由人工合成 用中子照射均匀标记 以强烈搅拌的悬浮液加到盆钵中 水溶性P KH2PO4 无载体H332PO4与土壤混合 土壤充分干燥后 加水至田间持水量 种植玉米 各种形态P的回收 植株中Pdff 植物中P比活度 14 18天 以KH2PO4为100 Al PFe PStrengiteVarisciteKH2PO440 5319 3 38 91 1 1 92 6 3 4100 配施水溶性磷肥 重过磷酸钙 TSP 对增加磷矿粉中磷的有效性的效应 S H Chienetal SoilSci Sol Am J 60 1173 1177 配施TSP增加玉米和cowpea 缸豆 对磷矿粉的吸收利用效率 处理 soil PR 用32P KH2PO4标记土壤 1ml32P 5LK2HPO4 20mg L 取80ml 4kg土 1wk后 施用PR soil TSP 标记TSP 用交换法 soil TSP labeled PR 其中TSP PR 50 55在各处理中种植玉米和缸豆 采样 42天收地上玉米 45天收cowpea 烘干 粉碎 用HNO3和HClO4混合液消化 测消化液中P浓度 闪烁测量32P 计算 soil PR 植物从磷矿粉吸收的P的量 PdfR 1 Pdfs 1 SA PR soil SA soil PPR PdfR Psoil PR soil TSP PdfT SA TSP soil SA TSP PTSP PdfT P TSP soil Psoil TSP P soil TSP PTSP TSP PR soil 标记TSP PdfT PR SA PR TSP soil SA TSP PPTS PR PdfT PR P PR TSP soil PPR soil TSP P PR TSP soil PTSP PR PPR TSP PPR soil TSP Psoil PR TSP 假定Psoil TSP PR Psoil TSP 则 式可求 因为研究表明 在有TSP时 加本试验矿添加的PR 对植物吸收土壤中的P无大影响 比较PR单独施用时和配施TSP时 植物对PR中P的吸收 结果由于配施TSP 使玉米和cowpea对PR P的吸收分别增加了3 48mg和1 38mg每盆 相对增加165 和72 6 5同位素示踪法测定有效磷土壤中的养分 并不是均对植物有效 为了衡量土壤中有效养分 即土壤肥力 或供应养分的能力 最早是用作物对施肥的反应来估测的 常规的化学提取法虽然能测定土壤固体表面吸附的养分量 但提取并不是专一的 而且在抽提过程中可能会引起养分形态的变化 采用同位素法不仅可测定土壤中可交换养分量 而且根据植物吸收来评价土壤中有效养分的量 用来平衡同位素的系统不同 测定的有效养分可分为E L和A值 都以典型的同位素稀释公式来计算 E L和A值 S1X S2 X X S1 S2 1 式中X为加入系统中示踪剂的量 S1和S2分别为平衡前后同位素的比活度 一 测定原理 1 E 值 核农学P 313 土壤加水或0 01MCaCl2 组成悬浮液 加入32P 磷酸盐 溶液中32P与土壤颗粒表面的31P会发生同位素交换反应 31P表 32P溶 32P表 31P溶达到平衡时 固体表面和溶液中的32P比活度相等 即 32P表 31P表 32P溶 31P溶 则31P表 32P表 31P溶 32P溶 用这种同位素交换法测得的31P表 McAuliffe等称为表面磷 Russell等提出有效磷概念 即为表面磷加溶液磷 代表系统中能为同位素交换的或能进行同位素稀释的这部分磷 称为E 值 由于E 值与平衡时间有关 故又用Et表示 根据Et的概念 可交换P Et 应为表面P与溶液P之和 所以 Et 31P表 31P溶 31P溶 32P表 32P溶 31P溶 31P溶 32P表 32P溶 1 31P溶 32P表 32P溶 32P溶 其中 Sf为平衡时溶液32P的比活度 即 Sf 32P溶 31P溶 如果土壤固磷能力很强 或土壤有效P含量很低时 须加入载体 采用载体法 这时 式中的Et须减去加入的磷 Et 32Pi Sf 31Pi Si 31Pi Sf 31Pi 31Pi Si Sf 1 其中Si 32Pi 31Pi为所加示踪剂的比活度 因由土壤吸附的磷酸盐保持可交换的状态 所以加到平衡溶液中的磷的量对E 值没有影响 也即用载体32P和用无载体32P得到的结果一致 但如土壤中具有强亲和力的化合物时 以无载体法加到土壤的32P与这些化合物作用 而被土壤吸附或固定不再参与同位素交换 因而引起32P的损失 而使测定值过高 如果采用载体法 由于32P只占31P的很少部分 则由于固定或吸附所引起的损失可忽略不计 因而能正确地反映土壤中可交换磷的量 但如果加到土壤中的磷比可交换磷的量大得多 则稀释前后的比活度差别很小 而使灵敏度降低 用无载体法还是有载体法 以及载体法所加载体的量依土壤上固磷能力的大小来决定 试验表明 固定能力低的土壤 示踪剂的损失可忽略不计 故可用载体法 中等固定能力的土壤 无载体法显示示踪剂的损失 这种情况下 采用载体法 损失可忽略不计 而对于高磷能力的土壤 即使用载体法 也不可避免32P的损失 所以测定可交换磷必须用二种方法进行比较 如获得同样的结果 表明无载体法的结果可靠 Fathi等提议的载体法 是1g土用0 2mg L的磷酸盐溶液平衡30 而M Fried等则用2mg L的磷酸盐溶液 无载体法则用0 03mg L磷酸盐溶液 Et值还受温度 土壤和水分比例等影响 所以在测定时要保持条件一致 2 L 值 将标记磷加到田间湿度的土壤中 并充分混合 使加入的32P与土壤有效库中的31P交换 种植作物 收获植株 分析植株中总P和32P 按同位素稀释公式可计算土壤中有效磷的量 即由生长的植物系统测定的土壤和土壤上溶液中能与加入土壤中的正磷酸盐离子进行交换的这部分磷 称为L 值 即 L w Sf SP 1 无载体时 L 加入的32P cpm g土 植物P比活度 cpm ugP ugP g土 式中Sf为应用磷肥的32P比活度 SP为植物样品的32P比活度 w 为标记磷肥的施用量 连续测定试验植株的32P比活度表明 当完全达到同位素平衡时 L 值与应用磷的量无关 并与采样时间无关 为了达到同位素平衡 准确测定L 值 要求将标记磷肥与土壤充分混合 采用无载体法 则更容易达到平衡 L 值与E 值的区别 概念不同 Et 31P表 31P溶 为能与悬浮液中32P交换的土壤颗粒表面的磷 L为在田间水分条件下 与加到土壤中的32P交换的土壤有效磷 条件 E 实验室 L 田间水分含量 测定方法 E 悬浮液 平衡时 溶液中P浓度和32P活度 L 种植株 测定植株总P和32P活度 3 A 值 根据Fried等的有效养分概念 当土壤中存在二个源时 植物从每个源吸收的养分与各自存在的有效养分成正比 其中一个源是已知的 另一个源即是我们要测定的土壤有效养分源 那么只要测定植物吸收来自这两个源的养分比例 就可计算土壤有效养分 这可以将肥料用同位素标记 求出Pdff和Pdfs 1 Pdff 根据Fried的概念 A w 1 Pdff Pdff A w Sf SP 1 由此测得的土壤中对植物有效养分量 称之为A 值 以施肥单位表示 如kg ha 式中w 为施用肥料的量 Sf和SP分别为应用肥料和植物样品中的比活度 测定A 值与测定L 值一样 也向土壤中施用标记P 种植物 测定植物的总P和32P 但施用的是比较磷肥 由于A 值是以一个标准来比较的 如果这个标准变化 A 值也会变化 所以在不同试验条件下 测得的A 值不是恒定的 它随施肥量 施肥方式和作物种类而变化 A 值与L 值的比较 见农学中同位素示踪技术P 246 概念 A 值和L 值的概念以及用它们解释作物对土壤和肥料养分的利用率时两者的差别主要在于标记肥料和土壤之间的混合程度不同 以及植物根系在土壤内随时间的分布不同 然而当标记肥料载体与土壤彻底混合并且植物有充分的吸收时间时 则A 值和L 值相等 目的 A 值的目的是测定土壤养分的有效性 测定中参照标准的营养液 L 值的目的是测定土壤磷中植物有效磷总量 它是指土壤及土壤上溶液中能加到土壤中的正磷酸盐磷离子进行交换的那部分磷 并假定已达到同位素交换平衡 最佳试验条件 测定A 值是 可用任意量的载体处理 要求尽量不使肥料与土壤相互作用 使肥料分布于土壤中能与根系接触进行短期试验 以尽量减少肥料与土壤之间的反应 相反 L 值法则要求32P的载体尽量少 而且要与全部土壤充分混合 以利