丝素蛋白、介孔生物玻璃陶瓷复合材料修复颅骨缺损.doc

www.CRTER.org郭志豪，等. 丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料修复颅骨缺损丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料修复颅骨缺损郭志豪，田林强，刘 槃，刘晓潭，王宏伟(新乡医学院第三附属医院骨科，河南省新乡市 453000)引用本文：郭志豪，田林强，刘槃，刘晓潭，王宏伟. 丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料修复颅骨缺损J.中国组织工程研究，2017，21(2):192-196.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.006 ORCID: 0000-0003-3825-0278(王宏伟)文章快速阅读：丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料修复颅骨缺损的效果结果表明：丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料可促进骨缺损的修复置入后4，8周，进行颅骨CT检查与组织学观察实验组于骨缺损处置入丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合膜材料，对照组于骨缺损处置入丝素蛋白膜材料建立颅骨缺损模型，随机分为2组文题释义：生活活性玻璃材料：具有较高的生物活性和骨结合强度，并且具有良好的生物相容性。与一般生物活性玻璃相比，介孔生物玻璃具有更高的有序的介观尺度，在机体内能激活成骨细胞基因，更加有利于提高细胞的增殖和分化，具有良好的骨传导和骨诱导作用。鉴于无定形硅谷架的存在，介孔生物玻璃仍然为无定形态。丝素蛋白：是一种天然的、具备两性荷电性能的聚氨基酸膜，本身具备良好的多孔网状结构，因此，具有良好的吸附性和缓释性能。同时，丝素蛋白作为一种非生物活性的蛋白质，其分子构象决定了其功能特性，使得丝素蛋白具备较低的强度和弹性模量，具备良好的机械性能和环境稳定性。摘要背景：文献报道丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷骨复合材料修复骨缺损效果理想，具备良好的生物相容性，但对于复合材料的制备方法、生物安全性缺乏报道。目的：研究丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料的制备方法及其修复颅骨缺损的效果。方法：取32只SD大鼠，建立颅骨缺损模型，随机分为2组，实验组于骨缺损处置入丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合膜材料，对照组于骨缺损处置入丝素蛋白膜材料。置入后4，8周，进行颅骨CT检查与组织学观察。结果与结论：CT检查：置入后4周，实验组骨缺损空隙较小，可见较多致密的新骨；对照组缺损部位缩小，可见少量新骨。置入后8周，实验组缺损部位修复完整，对照组缺损部位存在空隙，实验组置入后不同时间点的骨体积大于对照组(P 0.05)；苏木精-伊红染色观察：置入后4周，实验组置入的材料与宿主骨之间存在新骨，无炎症反应；对照组材料周围存在少许新生骨和纤维组织。置入后8周，实验组缺损边缘存在较多新骨且形态与宿主骨相类似，支架完全降解；对照组依然看到材料的存在；结果表明：丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料可促进骨缺损的修复。关键词：生物材料；骨生物材料；丝素蛋白；介孔生物玻璃陶瓷；骨修复复合材料；制备方法；生物安全性；静电纺丝；孔隙率；颅骨缺损主题词：丝素蛋白；陶瓷制品；组织工程基金资助：河南省科技攻关项目(201401012)Silk fibroin/mesoporous bioactive glass ceramics repair skull defects Guo Zhi-hao, Tian Lin-qiang, Liu Pan, Liu Xiao-tan, Wang Hong-wei (Department of Orthopaedics, the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, Henan Province, China)郭志豪，男，1981年生，河南省洛阳市人，汉族，主治医师，主要从事骨科疾病的研究与治疗研究。 通讯作者：王宏伟，副主任医师，新乡医学院第三附属医院骨科，河南省新乡市 453000 中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2017)02-00192-05稿件接受：2016-11-06Guo Zhi-hao, Attending physician, Department of Orthopaedics, the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, Henan Province, ChinaCorresponding author:Wang Hong-wei, Associate chief physician, Department of Orthopaedics, the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, Henan Province, ChinaAbstract3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 BACKGROUND: Silk fibroin/mesoporous glass ceramic composites have been reported to exert satisfactory repair outcomes in bone defects and hold good biocompatibility. However, the biosafety and preparation methods are rarely reported.OBJECTIVE: To investigate the preparation method and treatment outcomes of silk fibroin/mesoporous bioactive glass ceramic in skull repair.METHODS: Thirty-two Sprague-Dawley rats were enrolled to establish the skull defect models and were then randomized into two groups: fibroin/mesoporous glass ceramic materials and silk fibroin were respectively implanted into the defect region in experimental and control groups. At 4 and 8 weeks after implantation, the CT examination and histological observation were performed.RESULTS AND CONCLUSION: CT examination showed that at 4 weeks after implantation, the defect area in the experimental group diminished in size, showing more dense new bones. The defect area of the control group was reduced, and a small amount of new bones were observed. At 8 weeks after implantation, bone defect repair was completed in the experimental group, but not in the control group. The bone volume in the experimental group was significantly larger than that in the control group at different time points after implantation (P 0.05). Hematoxylin-eosin staining found that at 4 weeks after implantation, in the experimental group, there was new bone between the implant and the bone, which did not cause inflammation; there were few new bones and fibrous tissues in the control group. At 8 weeks after implantation, many new bones formed in the experimental group, with similar morphology to the host bone and the scaffold was degraded completely. Conversely, the implant material still existed in the control group. In conclusion, the silk fibroin/mesoporous glass ceramic composite can promote bone repair.Subject headings: Silk; Ceramics; Tissue EngineeringFunding: the Key Scientific and Technological Project of Henan Province, No. 201401012Cite this article: Guo ZH, Tian LQ, Liu P, Liu XT, Wang HW. Silk fibroin/mesoporous bioactive glass ceramics repair skull defects. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(2):192-196.195ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction缺损后难以实现自我修复，多数患者需要行手术方法完成缺损部位的修复。常规方法主要以自体骨、异体骨修复为主，但自体骨由于来源相对有限，难以达到预期的修复效果；异体骨虽然能满足颅骨缺损要求，但植入机体后容易引起免疫排斥反应，安全性较差，容易增加病毒、疾病传播。随着中国颅骨缺损疾病发生率的不断提高，对于人工骨修复材料及制品需求量相对较大1-4。因此，寻找新型的复合材料促进骨缺损修复，提高材料的生物安全性具有深远的临床意义。理想的骨修复材料应该具备以下特性：具有良好的生物力学特性、可塑性及生物相容性，具有骨诱导和骨传导作用，能促进骨缺损部位修复5-6。目前，人工合成无机生物材料包括硅酸盐、羟基磷灰石等。其中，生活活性玻璃材料具有较高的生物活性和骨结合强度，并且具有良好的生物相容性8。与一般生物活性玻璃相比，介孔生物玻璃具有更高的有序的介观尺度，在机体内能激活成骨细胞基因，更加有利于提高细胞的增殖和分化，具有良好的骨传导和骨诱导作用。鉴于无定形硅谷架的存在，介孔生物玻璃仍然为无定形态7-8。因此，实验尝试构建既具备介孔结构又具备磷灰石纳米晶体的介孔生物活性微晶玻璃陶瓷，更好地模拟天然骨9-10。但是，在骨缺损上方如果能覆盖合适的引导骨再生膜，代替损伤骨膜，具备屏障作用，控制并组织周围纤维、生僻细胞长入骨缺损部位，可为骨细胞生长提供适合的生长空间，促进骨缺损部位修复11-14。实验观察丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷骨修复复合材料的制备方法及生物安全性。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 对比观察动物性实验。1.2 时间及地点 实验于2015年3月至2016年5月在新乡医学院第三附属医院骨科完成。1.3 材料实验动物：清洁级雄性SD大鼠32只，体质量250- 300 g，由新乡医学院附属医院动物实验中心提供。实验过程中对大鼠饲养、处理均符合关于善待实验动物的指导性意见相关规则10。将32只大鼠分随机为对照组(n=16)与实验组(n=16)。主要仪器和试剂：正硅酸乙酯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；磷酸三乙酯(天津市博迪化工有限公司)；三羟甲基氨基甲烷(国药集团化学试剂有限公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；手术器械一套(上海第六人民医院)；恒温磁力搅拌器(南京科尔仪器有限公司) ；水热反应釜(河南郑州杜甫仪器厂)；真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；桑蚕(新乡医学院实验室)。1.4 实验方法1.4.1 新型介孔生物玻璃陶瓷的制备 碳球的制备：采用水热合成方法制备碳球12。将8 g葡萄糖溶解在40 mL水中，形成透明澄清溶液，160 保温2 h。将获得的黑色产品1 000 r/min离心5 min，放入水、乙醇中洗涤。在80 下烘干获得。介孔生物玻璃陶瓷的制备：采用双模板法制备介孔生物玻璃陶瓷，见图1。以P123作为介孔模板，将正规酸酯(TEOS)作为硅源、磷酸三乙酯作为作为磷源、硝酸钙(Ca(NO3)2)作为钙源，将其溶解在60 g无水乙醇中，加入7.4 g正规酸酯、0.68 g磷酸三乙酯及0.98 g Ca(NO3)2。根据14的比例将碳球加入上述溶液中，搅拌3 d，将获得的溶液在50 下进行挥发诱导自组装，老化处理7 d。将获得的凝胶在氮气下进行3 h碳化，转入700 空气下煅烧8 h，去除有机结构导向剂和模板，烘干后获得新型介孔生物玻璃陶瓷粉末15。丝素蛋白的制备：将桑蚕放入浓度为0.05%NaCO3的水溶液中煮沸2 h，去除丝胶，重复3次操作。将获得的蚕丝采用CaCl2/H2O/C2H5OH三元容积中(摩尔比为182)，在 75 下溶解8 h，冷却后过滤去除不溶物，透析3 d，过滤溶液中的杂质，获得纯净的丝素蛋白溶液16。丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料的制备：称取一定质量的介孔生物玻璃陶瓷，放置在含有丝素蛋白溶液中(两者之比为14)，连续搅拌5 h，使得介孔生物玻璃陶瓷粉末与丝素蛋白溶液充分混合均匀，将混合溶液放置在培养皿中，在室温下烘干，获得丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷骨修复复合材料。将复合材料溶解在六氟异丙醇溶液中，超声下5 h，搅拌5 h，加入质量分数为8%混合纺丝液，后经体积分数75%的乙醇溶液进行10 min处理，采用去离子水洗涤3次，去除残余乙醇后晾干、备用。1.4.2 体内置入实验 将32只SD大鼠放入手术台上，静脉注射浓度为3%戊巴比妥钠麻醉，固定大鼠四肢后，对手术部位进行除毛、铺巾、消毒处理，在正中部位切开头皮，长度为2 cm，向两侧分离皮下组织。切除骨膜后，在两侧顶骨正中部位采用牙科钻制作长为5 mm的全层颅骨缺损，对缺损部位采用生理盐水进行冲洗，去除骨渣、血渍等，保证硬脑膜的完整，见图2。随后，对照组于骨缺损处覆盖直径为6 mm的丝素蛋白膜材料，实验组于骨缺损处覆盖直径为6 mm的丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料，一次缝合骨膜及头皮，所有手术操作均在无菌条件下完成，手术由同一人完成。置入后4，8周，每个时间点每组各处死15只大鼠，解剖后将颅骨放入40 g/L多聚甲醛溶液中，备用17。1.5 主要观察指标 利用扫描电镜观察丝素蛋白及丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料18；观察两组大鼠骨体积：将大鼠颅骨植入物取出，经体积分数4%甲醛固定，采用CT进行观察，层厚18 m，建立三维图像，采用自带软件计算骨体积；组织学观察：置入后4，8周，取脑部缺损组织进行苏木精-伊红染色。将标本放入10%EDTA溶液中脱钙，利用乙醇梯度脱水，制备5 m切片，放入苏木精中染色5 min，在倒置显微镜下观察结果19。1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件处理，计数资料采用n/%表示，行卡方检验，计量资料采用s表示，行t 检验，P 0.05提示差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合膜材料的形貌 采用六氟异丙醇溶液作为溶剂静电纺丝获得丝素蛋白纤维，表面平整光滑，纤维呈现缎带状结构，存在纤维之间的轻微粘连和分叉现象；丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合膜纤维直径呈逐渐变大趋势，黏度增加，直径分布也相对较粗，见图3。2.2 丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料纤维膜的孔径分布 静电纺丝膜的内在间距，即孔径分布有利于细胞的迁移、增殖和分化。丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合材料纤维孔径比丝素蛋白的1.29 m增大，复合材料的孔径在2.87 m左右，见图4。2.3 体内置入实验结果2.3.1 实验动物数量分析 32只大鼠均进入结果分析。2.3.2 两组大鼠一般情况观察 实验组大鼠生命体征正常，能自由活动，颅骨缺损部位创面清洁、伤口整齐，未见感染，无积脓现象；对照组大鼠基本正常，2只颅骨缺损部位伤口不整齐，1只发生感染。2.3.3 两组大鼠骨体积比较 实验组置入后4，8周的骨体积显著大于对照组(P 0.05)，见表1。CT检查显示，实验组置入后4周的骨缺损空隙较小，发现更加致密的新骨；对照组缺损部位缩小，发现少量新骨；置入后8周，实验组材料与颅骨缺损部位连接，缺损部位得到修复，而对照组缺损部位存在空隙，见图5。表1 两组修复后不同时间点的骨体积比较 (s，n=15，mm3)Table 1 Comparison of the bone volume in the two groups at different time points after implantation 组别修复后4周修复后8周实验组0.5对照组0.4P 0.05 0.052.3.4 两组苏木精-伊红染色结果比较 置入后4周，实验组材料生物相容性良好，与宿主骨之间存在新骨，无炎症反应；对照组材料周围存在少许新生骨和纤维组织。置入后8周，实验组缺损边缘存在较多新骨且形态与宿主骨相类似，支架完全降解；对照组依然看到材料的存在，见图6。3 讨论 Discussion理想的生物材料首先应具备良好的生物相容性，即生物材料置入机体后能保持相对稳定、不被宿主排斥和破坏的生物学特性，材料无毒性、无刺激性、无畸形。在骨再生组织工程领域，合理的设计骨修复材料，使其具有可控的结构组成及力学的生物学性能，直接影响其在动物骨缺损中的修复效果20。因此，多数学者根据骨组织组成结构、特点，构建类似于细胞外基质的物理、化学环境。传统的人工骨，如高分子材料、无机材料等均存在存在各自的应用限制。目前，有机/无机复合支架在临床上得到应用，但如何制备及置入机体后的生物安全性尚存在较大的争议21。丝素蛋白是一种天然的、具备两性荷电性能的聚氨基酸膜，本身剧本良好的多孔网状结构，因此，具有良好的吸附性和缓释性能。从材料来源来说，丝素蛋白是从天然蚕丝纤维中提取的一种蛋白，由于两根丝素蛋白呈近似三角形的丝素蛋白纤维组成蚕丝的主体部分，其含量占蚕丝的70.0%22。蚕丝中的丝胶则包裹在丝素蛋白的外围，占25%，其余5%为蚕丝的杂质。同时，丝素蛋白作为一种非生物活性的蛋白质，其分子构象决定了其功能特性，使得丝素蛋白具备较低的强度和弹性模量，具备良好的机械性能和环境稳定性。介孔生物玻璃陶瓷也是临床上使用较多的材料，该材图1 新型介孔生物玻璃陶瓷合成示意图Figure 1 Schematic diagram of mesoporous glass ceramic synthesis图注：新型介孔生物玻璃陶瓷复合过程中首先完成碳球的制备，经过一系列复杂的过程得到生物玻璃陶瓷。9060300图4 不同材料的孔径分布Figure 4 Pore size distribution of different materials0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0百分比(%)图2 建立大鼠颅骨缺损模型Figure 2 Establishment of a rat skull defect model图注：图中A为实验大鼠；B为颅骨5 mm缺损模型。粒径(m)A图3 扫描电镜观察不同材料的形貌(50)Figure 3 Morphology of different materials under scanning electron microscope (50)图注：图中A为丝素蛋白，纤维呈现缎带状结构，存在纤维之间的轻微粘连和分叉现象；B、C为丝素蛋白/介孔生物玻璃陶瓷复合膜，纤维直径呈逐渐变大趋势，黏度增加，直径分布也相对较粗。CB图5 两组修复后不同时间点的颅骨CT模型Figure 5 CT images of the skull in the two groups at different time points after implantation图注：图中A、C分别为实验组修复后4，8周；B、D分别为对照组修复后4，8周。置入后4周，实验组骨缺损空隙较小，发现更加致密的新骨；对照组缺损部位缩小，发现少量新骨。置入后8周，实验组材料与颅骨缺损部位连接，缺损部位得到修复，而对照组缺损部位存在空隙。CBDA图6 两组修复后不同时间点的颅骨组织病理变化(苏木精-伊红染色，40)Figure 6 Histological changes of the rat skull in the two groups at different time points after implantation (hematoxylin-eosin staining, 40)图注：图中A为实验组修复后4周，材料生物相容性良好，与宿主骨之间存在新骨，无炎症反应；B为实验组修复后8周，缺损边缘存在较多新骨且形态与宿主骨相类似，支架完全降解；C为对照组修复后4周，材料周围存在少许新生骨和纤维组织；D为对照组修复后8周，依然看到材料的存在。图中N为新生骨；箭头为置入的材料。料生物活性相对较高，骨结合能力也比较强，具有激活成骨细胞基因，增强骨细胞增殖与分化能力，具有骨诱导和骨传导的作用。相关研究显示，介孔生物玻璃陶瓷具有更快的生物矿化能力和细胞生物相容性，是骨组织修复中的最佳材料之一23。实验采用水热方法合成制备介孔生物玻璃陶瓷骨材料，并且将材料粉末溶解于丝素蛋白溶液中，从而获得丝素蛋白/介孔生物剥离陶瓷复合纤维膜材料，该复合材料孔隙率较高、纤维间网络结构较好，是骨缺损修复理想的材料。文献报道显示，骨缺损处填充支架材料后能使得来自周围组织的结缔组织发生迁移，形成骨细胞潜能的细胞块，容易包膜骨填充材料，从而能延缓骨愈合时间影响骨修复的质量。研究中，对30只SD大鼠建立5 mm颅骨缺损模型，并且分别置入素蛋白和丝素蛋白/介孔生物剥离陶瓷复合纤维膜材料，控制两组其他质变因素，分析不同材料的修复结果。术后实验组大鼠生命体征正常，能自由活动，颅骨缺损部位创面清洁、伤口整齐，未见感染，无积脓现象；对照组大鼠基本正常，2只颅骨缺损部位伤口不整齐，1只发生感染。由此看出，丝素蛋白/介孔生物剥离陶瓷复合纤维膜材料的置入并不会引起大鼠术后感染等，伤口较齐，更加有利于大鼠术后恢复。实验组置入后4，8周的骨体积显著大于对照组(P 0.05)，CT下复合材料组术骨缺损得到愈合，而纯丝素蛋白组缺损部位存在空隙。提示：复合材料能促进大鼠骨缺损修复，能缩短骨缺损修复时间，促进机体早期恢复。苏木精-伊红染色结果显示，实验组缺损边缘存在较多新骨，且新骨与宿主骨类似；而对照组依然看到材料的存在。由此看出，复合材料与宿主之间具备良好的生物相容性，能促进缺损部位早期恢复。作者贡献：郭志豪进行实验设计，实验实施为田林强，实验评估为刘槃，资料收集为刘晓潭，王宏伟成文，郭志豪审校。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验方案经新乡医学院动物实验伦理委员会批准。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References1 张翔,周大利,龙泌,等.磷灰石-硅灰石生物活性玻璃陶瓷表面接枝多肽改性研究J.无机材料学报,2013,28(10):1137-1142.2 Fujihara K,Kotaki M,Ramakrishma S.Guided bone regeneration membrane 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