生化综合实验报告--测定蛋白质含量的三种方法及其比较.doc

本科学生综合性实验报告学号 姓名 学院 专业、班级实验课程名称 测定蛋白质含量的三种方法及其比较 教师及职称 开课学期 至学年 学期 填报时间 年 月 日云南师范大学教务处编印实验序号十十二实验名称测定蛋白质含量的三种方法及其比较实验时间2012/11/162012/11/30实验室睿智楼3幢331（生物技术实验室4）1实验目的：掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质含量的原理和方法。掌握紫外吸收法定量测定蛋白质含量的原理和方法。比较三种定量测定方法的异同。2 实验原理、实验流程或装置示意图（1）双缩脲法 (Biuret 法)测定蛋白质浓度原理：在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与Cu2+作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。具有两个或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用比色法测定蛋白质的浓度。在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。测定范围为110mg蛋白质。（2）考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度（ Bradford 法）原理：考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250（coomassie brilliant blue，CBB）在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质.色素结合物在595 nm波长下的光吸收符合比尔定律，故可用于蛋白质的定量分析。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合2min左右达到平衡。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量。（3）紫外吸收法测定蛋白质浓度原理：白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（O.D280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。3实验设备及材料（1）双缩脲法实验器材： 容量瓶 试管、试管架 恒温水浴槽 吸量管 分光光度计 电热套 锥形瓶 比色皿实验试剂： 标准酪蛋白溶液: 用0.05 mol/L NaOH溶液配制。酪蛋白要预先测定其蛋白质纯度，再根据其纯度配制成标准溶液。也可用牛血清蛋白或卵其清白蛋白配制标准蛋白溶液。 双缩脲试剂: 溶解1.5g CuSO45H2O和6.0g NaKC4H4O64H2O于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300 ml 10% NaOH溶液，用蒸馏水定容到1升刻度，混匀备用。一实验设计方案蛋白质样品或蛋白质样品溶液。(2) 考马斯亮蓝染色法试剂: 考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 ml。 标准蛋白质溶液: 牛血清蛋白或卵其清白蛋白等，预先测定其蛋白纯度，再根据纯度用蒸馏水或0.9NaCl 准确配制。器材: 容量瓶 试管及试管架 恒温水浴槽 吸量管 分光光度计 电热套 锥形瓶 比色皿(3) 紫外吸收法试剂: 样品蛋白溶液:准确称样品蛋白质,配制成一定浓度的溶液。器材: 紫外分光光度计 容量瓶 试管、试管架 吸量管 锥形瓶 比色皿4实验方法步骤及注意事项双缩脲法标准曲线的绘制: 取12支试管分成两组，按下表平行操作，绘制标准曲线。样品测定: 制备样品的蛋白质提取液。 取出两份1.0 ml样品液。操作同标准曲线，测定样品的OD值，平行两份计算: 取两组测定的平均值计算。 从标准曲线上查出其蛋白质浓度，再根据样品称重量和稀释倍数计算样品的蛋白质含量。注意事项：Tris 、铵盐对测定有干扰，有大量脂肪性物质同时存在时，会产生混浊的反应混合物。考马斯亮蓝染色法标准曲线的制作 取12支试管，按下表加入试剂 混匀，室温静置min，以第管为空白，于波长595nm处比色，测定OD值， 以的OD值为纵坐标，各标准液浓度为横坐标作标准曲线 。 未知样品蛋白质含量的测定 准确吸取0.5 ml所制备的蛋白质样品稀释液，加入3.0 ml考马斯亮蓝G-250试剂后，所有的操作完全与标准曲线相同，测定样品的OD值。平行两份。从标准曲线上查出其蛋白质浓度，再根据稀释倍数计算样品的蛋白质含量。注意事项：大量去污剂的存在对颜色影响太大不易消除。紫外吸收法 280nm与260nm的吸收差法 将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm和280nm处分别测出O.D值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。计算: 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45O.D280 0.74O.D260 校正因子法 先计算出O.D280/O.D260的比值后，从下表中查出校正因子为“F”值，将“F”值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。 蛋白质浓度（mg/ml）= F1/dO.D280N 式中，d为石英比色皿的厚度（cm）；N为溶液的稀释倍数。紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子注意事项： 若样品中含有大量吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。5.实验数据处理方法管号双缩脲法试剂012345样品1样品2OD54000.0210.0520.1600.3160.3450.080.029标准蛋白质浓度(mg/ml）012345XY考马斯亮蓝染色法管号试剂012345样品1样品2蛋白质浓度（ug/ml）01020304050XYO.D59500.0210.0520.1600.3150.3450.080.069波长紫外吸收法试剂260nm280nmO.D1.1471.1206.参考文献郑集，陈均辉编 普通生物化学（第4版）高等教育出版社 2007.6陈均辉等编 生物化学实验（第四版） 科学出版社 2008 二实验报告1实验现象与结果（1）双缩脲法制备样品的蛋白质测得O.D值为0.262和0.274，则平均值为0.268，从图中可得蛋白质的浓度约为2.592mg/,ml。样品重量和稀释倍数可得蛋白质的浓度为80/25=3.2mg/ml，则有蛋白质的含量为 2.592/3.2=81%（2）考马斯亮蓝法制备样品的蛋白质测得O.D值为0.240.和0.231，则平均值为0.235，从图中可得蛋白质的浓度约为23.70ug/ml样品重量和稀释倍数可得蛋白质的浓度为30ug/ml，则有蛋白质的含量为23.7/30=79%（3）紫外吸收法260nm:O.D值1.147280nm:O.D值1.120蛋白的浓度（mg/ml）=1.45O.D2800.74O.D260=1.6240.84878=0.775mg/ml校正因子发：O.D280/O.D260=1.120/1.147=0.976,，从校正因子表中可得F=3.50，则有蛋白质浓度(mg/ml)=F1/dO.D280N=3.502 对实验现象、实验结果的分析及其结论在考马斯亮蓝测定蛋白质含量中需要注意哪些事项？答：要在试剂加入后的520min内测定光吸收值，因为这段时间内颜色最稳定。测定完成后可用乙醇将比色皿洗干净。在双缩脲法测定蛋白质含量中需要注意哪些事项？答：须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色的时间应尽可能一致。样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。比较测定蛋白质含量方法有哪些优缺点？答：双缩脲法：优点：操作简单、显色稳定、重复性好。 缺点：灵敏度较低。考马斯亮蓝法：优点：灵敏度高、测定快速、简洁。 缺点：显色剂的稳定性较差。 紫外吸收法：优点：快速、简便、干扰小。 缺点：样品中有大量吸收紫外线物质会出现较大干扰。3 实验总结此次综合实验让我受益菲浅。在实验圆满完成之时，我对对此次试验进行了结，总结试验中的收获与不足。取之长、补之短，在今后的学习和工作中有所受用。 此次试验学习中，让我受益颇多。一、让我养成了课前预习的好习惯。一直以来就没能养成课前预习的好习惯（虽然一直认为课前预习是很重要的），但经过此次试验，让我深深的懂得课前预习的重要。只有在课前进行了认真的预习，才能在课上更好的学习，收获的更多、掌握的更多。二、培养了我的动手能力。“实验就是为了让你动手做，去探索一些你未知的或是你尚不是深刻理解的东西。”经过不断的学习，让我的动手能力有了明显的提高。三、让我在探索中求得真知。那些伟大的科学家之所以伟大就是他们利用实验证明了他们的伟大。实验是检验理论正确与否的试金石。为了要使你的理论被人接受，你必须用事实（实验）来证明，让那些怀疑的人哑口无言。虽说我们的理实验只是对前人的经典实验的重复，但是对于一个知识尚浅、探索能力还不够的人来说，这些探索也非一件易事。我在探索中学习、在模仿中理解、在实践中掌握。学习就是为了能自我学习，它让我在探索、自我学习中获得知识。四、教会了我处理数据的能力。实验就有数据，有数据就得处理，这些数据处理的是否得当将直接影响你的实验成功与否。经过综合试验，我学会后加强了列表法、图像法等处理数据的方法，让我对其它课程的学习也是得心应手。 此次试验，让我收获多多。但在这中间，我也发现了我存在的很多不足。我的动手能力还不够强，当有些实验需要很强的动手能力时我还不能从容应对；我的探索方式还有待改善，当面对一些复杂的实验时我还不能很快很好的完成；我的数据处理能力还得提高，当眼前摆着一大堆复杂数据时我处理的方式及能力还不足，不能用最佳的处理手段使实验误差减小到最小程度 总而言之，综合试验我收获颇丰，同时也让我发现了自身的不足。在实验中学得的，我将发挥到其它领域中去，也将在今后的学习和工作中不断提高、完善；在此间发现的不足，我将努力改善，通过学习、实践等方式不断提高，克服那些学习、获得知识的障碍。在今后的学习、工作中有更大的收获。在此次试验中，我学到了很多在平时的学习中学习不到的东西。基本每次实验都达到了实验目的要求。每次上实验课，老师都给我们认真的讲解实验原理，轮到我们自己动手的时候，老师还常常给予我们帮助，我真心地感谢你对我们的付出。在大实验结束之时，我对此次试验进行了总结，总结其中的收获与不足。取之长、补之短，在今后的学习和工作中有所受用。通过实验的学习，我认识到了实验是学习的基础，许多理论直接来自于实验。而要设计一个实验去验证某个理论或者利用某个理论去测量某个物理，更是十分有学问的，是非常复杂的。我们学理科的同学，尤其要重视实验课，注重理论与实践相结合。总的来说对本次实验还是很大程度上开阔了我们的视野，也和科技前沿的一些东西开始有了亲密的接触。基本上和我们的实验初衷吻合，完成了实验任务，达到了我们实验目的。在实验中需要注意的事情很多，但也是因为这些事情让我们能体会到，实验需要的是严谨的思维，需要认真的去想，每一步都要做的很严谨，不然就会产生不该产生的误差影响最终的数据结果，导致实验失败。通过本次试验的学习与了解，我学到了很多关于大学实验的方法与要求，更重要的是，在自己亲自尝试与接触各种实验操作过程中，我了解到要作为一个合格的实验者，必须具备很多综合素质：1、科学的严谨性；2、解决问