蛋白质印迹法.doc

蛋白印迹法（Western-blot）一 、 基本原理细胞色素P450是一组含亚铁血红素，结构与功能相关的超家族基因编码的同工酶，因还原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450nm处有一特异吸收峰而得名。已知的细胞色素P450超家族中，主要有CYP1、CYP2、CYP3三个基因家族，是生物体参与内外源性化合物生物转化酶系的主要成员，并与肿瘤的发生密切有关。其中CYP1家族中的CYP1A1与多种前致癌物、致突变物的代谢活化及肿瘤的发展密切相关，所以对CYP1A1的研究有重要的意义。本实验采用蛋白免疫印迹（western blotting , WB）技术分析小鼠肝，肾两个器官中的CYP1A1的含量。WB的原理如下。Western blotting 常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDSPAGE）法分离蛋白质。SDS是一种阴离子去污剂，它能与绝大多数蛋白质结合。无论与SDS结合前蛋白质的等电点是多少，结合后蛋白质将带上等量的负电荷，通常SDS与蛋白质结合的比例为1.4：1g 。同时结合后蛋白质的分子构象发生改变，行成长椭圆棒状，其短轴大约为18nm,其长轴与分子量有关（一定范围内成正比），此时蛋白质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。另外，SDSPAGE过程中还加入了二硫苏糖醇和-巯基乙醇等强还原剂，破坏二硫键使得蛋白质的原有空间结构充分破坏，因此SDSPAGE能将不同分子量的蛋白质分离开。分离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体上（如硝酸纤维素膜）。用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为牢固，不易被后续的洗膜等操作洗脱.Western blotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体（简称一抗），通常由于较难大量获得该抗体，使得对其进行标记很困难。为此人们设计了能与一抗结合的抗体，成为第二抗体（简称二抗）。二抗是将一抗的FC段作为抗原的，而每一物种的抗体FC段氨基酸序列都较为保守，这使得二抗能够大量生产，因而对二抗进行标记也就较为容易了。二抗与一抗能通过抗原抗体特异性结合后，以一定的方法对二抗上的标记进行检测便可检出靶蛋白。二、 器材电热水浴箱、玻璃匀浆器、冷冻离心机、滤纸、水平摇床、电转移装置、醋酸纤维素膜（NC膜）、电泳仪、试管、微量移液器、Tip头、Epp管（2ml、5 ml、1.5 ml）三、试剂配制：1）、1.5M TrisHcl, pH8.8：18.16g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至8.8，定容至100 ml，4保存。2）、1.0M TrisHcl, pH6.8：12.12g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至6.8，定容至100 ml，4保存。3)、10SDS： 10g SDS溶于90 ml ddH2O，轻柔搅拌，溶解后加水至100 ml。4）、10TBS（Tris buffer solution）, pH7.6： 24.2g Tris，80g NaCl, 溶于700 ml ddH2O 用1M HCl（约15 ml）调节pH至7.6，加ddH2O至1000 ml。5）、TBS-T，pH7.6：前述TBS-T加Tween-20使浓度为0.1。6）、5电泳缓冲液，pH8.3： 15g Tris, 72g甘氨酸，5g SDS 溶于1000 ml ddH2O，4保存。（若有沉淀出现，用前加热至室温即可）。7）、转移缓冲液（25mM Tris、 192 mM甘氨酸、20甲醇），pH8.3：3.03 g Tris，14.4 g 甘氨酸，200 ml甲醇加ddH2O至1000 ml。（勿用酸碱调节pH）。8）、10mM PMSF液；异丙醇8 ml，PMSF0.01742 g溶解后定容至10 ml。（使用时按照10 ml裂解液：1 ml 10mM PMSF）9）、裂解缓冲掖；包含50mmol/L Tris.HCl(Ph8.0),150mmol/L NaCl,1TritonX:配置100ml的裂解缓冲掖，需称取Tris碱0.61g溶解于60ml双蒸水，用浓盐酸调节Ph8.0，然后加入NaCl0.88g,TritonX100 1ml,加水至总量为100ml。10）、PBS 800ml 蒸馏水中加入NaCl18g，KCl0.2g,Na2HPO4 1.44g和KH2PO4 0.24g,用浓盐酸调节Ph至7.4，定容至1L。高压灭菌。11）、10过硫酸胺（APS）：称取APS 0.5g溶解于5ml ddH2O中，分装保存于20。12）、1溴酚蓝: 称取0.1 g溴酚蓝溶解于10 ml ddH2O中,分装保存于4。13）30%丙烯酰胺（Acr:Bis=29:1）:称取丙烯酰胺（Acr）29g,甲叉丙烯酰胺（Bis）1g,用去离子水溶解并稀释至100ml,储存在棕色瓶中于4保存，可用1个月13）、Sample Buffer:总体积 8.0 mlddH2O 3 .8 ml0.5M TrisHcl 1.0 ml甘油 0.8 ml10SDS 1.6 ml-巯基乙醇 0.4 ml1溴酚蓝 0.4 ml实验步骤：1、 样品制备： 小鼠禁食过夜，断头处死，迅速剖开腹腔，取出肝、肾分别称重按1g组织中加入冰预冷的10 ml裂解液，10mM PMSF 1ml 冰上制成10的组织匀浆取1ml匀浆20000g，4、离心30分钟小心吸取上清液取少量上清液进行蛋白定量，余下的-20保存备用2、 蛋白质定量（考马斯亮蓝染色法）考马斯亮蓝G250 是一种蛋白质染料，最大吸收峰在465nm,当它与蛋白质以范德华力结合形成考马斯亮蓝G250蛋白质复合物，其最大吸收峰改变为595 nm，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。按下表操作。表1加入物 空白管 测定管PBS 150l 145l考马斯亮蓝染液 2.85ml 2.85ml蛋白质提取液 5l摇匀，室温放置5分钟，空白调零，于595nm处比色绘制标准曲线，计算测定管的浓度3、制胶：装配好制胶玻璃板按下列配方配制12的分离胶：12的凝胶溶液成分 体积（总体积10 ml）ddH2O 3.3 ml30丙烯酰胺溶液 4 ml1.5M Tris （Ph8.8） 2.5 ml10SDS 100l10过硫酸胺（APS） 100lTEMED 4l将表中的前四项组分混匀后，再加入APS和TEMED。将上述溶液缓慢注入制胶玻璃片至梳齿下1cm,操作中注意防止产生气泡，聚胶30分钟后用ddH2O完全洗净封闭液。按下列配方配制5的聚集胶： 5的凝胶溶液成分 体积（总体积5 ml）ddH2O 3.4 ml30丙烯酰胺溶液 0.83 ml1.0M Tris （Ph6.8） 0.63 ml10SDS 50l10过硫酸胺（APS） 50lTEMED 5l将表中的前四项组分混匀后，再加入APS和TEMED。注入聚集胶前，用滤纸吸干分离胶上的水。缓慢注入聚集胶，过程中注意防止产生气泡。插入梳齿，聚胶30分钟后小心拔除梳齿。用ddH2O清洗梳孔，放入电泳槽备用。4、 样品处理：用Sample Buffer 按1：1稀释样品95加热变性5分钟5、 上样及电泳：将电泳槽内注满1电泳缓冲液，彻底除去点样孔中和胶底的气泡。两边空白的泳道点上等量的 Sample Buffer ，上样量（20l含40g蛋白）向电泳外槽内注入1电泳缓冲液，盖上盖子，电泳开始时电压为80V，染料进入分离胶后，将电压增加到120V，稳压，当染料抵达分离胶底部约80分钟，断开电源。6、 转膜：剪6块滤纸和一块NC膜，其大小与胶相同将滤纸预先在转移缓冲液中浸泡5分钟，除去气泡。凝胶电泳完成后取出。按照海绵3块滤纸凝胶NC膜另外3块滤纸海绵的顺序依次放，应避免气泡。用塑料支架夹紧上述各层，放入转移内槽及外槽，注入冰预冷的转移缓冲液。注意NC膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。转移200mA稳流，4，1.5小时。7、 封闭NC膜： 转移完成后，取出膜放在滤纸上，用铅笔标好正面，室温干燥数分钟。用western blotting封闭液封闭NC膜，室温下振荡1小时后4过夜（NC膜正面向上）8、 一抗结合:一抗用封闭液配制（按1：20（CYP1A1）及1:200(-actin)配制）室温振摇2小时（NC膜正面向上）以TBS-T洗膜3次，每次5-10分钟9、 二抗结合：二抗以TBS-T稀释（按1：600配制）室温振摇孵育1.5小时（NC膜正面向上）以TBS-T洗膜3次，每次5-10分钟10、 显色：辣根过氧化物酶显色1） 在试管中先加入1mlHRP反应缓冲液，然后依次加入试剂A500l、试剂B500l、C500l混匀即可。2） 配制好的溶液应避光存放，30min内使用，染色为褐色。3） 室温下染色时间为530