




已阅读5页,还剩7页未读, 继续免费阅读
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
蛋白印迹法(Western-blot)一 、 基本原理细胞色素P450是一组含亚铁血红素,结构与功能相关的超家族基因编码的同工酶,因还原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力,且形成的复合物在波长450nm处有一特异吸收峰而得名。已知的细胞色素P450超家族中,主要有CYP1、CYP2、CYP3三个基因家族,是生物体参与内外源性化合物生物转化酶系的主要成员,并与肿瘤的发生密切有关。其中CYP1家族中的CYP1A1与多种前致癌物、致突变物的代谢活化及肿瘤的发展密切相关,所以对CYP1A1的研究有重要的意义。本实验采用蛋白免疫印迹(western blotting , WB)技术分析小鼠肝,肾两个器官中的CYP1A1的含量。WB的原理如下。Western blotting 常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDSPAGE)法分离蛋白质。SDS是一种阴离子去污剂,它能与绝大多数蛋白质结合。无论与SDS结合前蛋白质的等电点是多少,结合后蛋白质将带上等量的负电荷,通常SDS与蛋白质结合的比例为1.4:1g 。同时结合后蛋白质的分子构象发生改变,行成长椭圆棒状,其短轴大约为18nm,其长轴与分子量有关(一定范围内成正比),此时蛋白质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。另外,SDSPAGE过程中还加入了二硫苏糖醇和-巯基乙醇等强还原剂,破坏二硫键使得蛋白质的原有空间结构充分破坏,因此SDSPAGE能将不同分子量的蛋白质分离开。分离后的蛋白质带有负电荷,因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体上(如硝酸纤维素膜)。用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点,它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合,因而结合较为牢固,不易被后续的洗膜等操作洗脱.Western blotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体(简称一抗),通常由于较难大量获得该抗体,使得对其进行标记很困难。为此人们设计了能与一抗结合的抗体,成为第二抗体(简称二抗)。二抗是将一抗的FC段作为抗原的,而每一物种的抗体FC段氨基酸序列都较为保守,这使得二抗能够大量生产,因而对二抗进行标记也就较为容易了。二抗与一抗能通过抗原抗体特异性结合后,以一定的方法对二抗上的标记进行检测便可检出靶蛋白。二、 器材电热水浴箱、玻璃匀浆器、冷冻离心机、滤纸、水平摇床、电转移装置、醋酸纤维素膜(NC膜)、电泳仪、试管、微量移液器、Tip头、Epp管(2ml、5 ml、1.5 ml)三、试剂配制:1)、1.5M TrisHcl, pH8.8:18.16g Tris溶于60 ml ddH2O,用浓盐酸调节PH至8.8,定容至100 ml,4保存。2)、1.0M TrisHcl, pH6.8:12.12g Tris溶于60 ml ddH2O,用浓盐酸调节PH至6.8,定容至100 ml,4保存。3)、10SDS: 10g SDS溶于90 ml ddH2O,轻柔搅拌,溶解后加水至100 ml。4)、10TBS(Tris buffer solution), pH7.6: 24.2g Tris,80g NaCl, 溶于700 ml ddH2O 用1M HCl(约15 ml)调节pH至7.6,加ddH2O至1000 ml。5)、TBS-T,pH7.6:前述TBS-T加Tween-20使浓度为0.1。6)、5电泳缓冲液,pH8.3: 15g Tris, 72g甘氨酸,5g SDS 溶于1000 ml ddH2O,4保存。(若有沉淀出现,用前加热至室温即可)。7)、转移缓冲液(25mM Tris、 192 mM甘氨酸、20甲醇),pH8.3:3.03 g Tris,14.4 g 甘氨酸,200 ml甲醇加ddH2O至1000 ml。(勿用酸碱调节pH)。8)、10mM PMSF液;异丙醇8 ml,PMSF0.01742 g溶解后定容至10 ml。(使用时按照10 ml裂解液:1 ml 10mM PMSF)9)、裂解缓冲掖;包含50mmol/L Tris.HCl(Ph8.0),150mmol/L NaCl,1TritonX:配置100ml的裂解缓冲掖,需称取Tris碱0.61g溶解于60ml双蒸水,用浓盐酸调节Ph8.0,然后加入NaCl0.88g,TritonX100 1ml,加水至总量为100ml。10)、PBS 800ml 蒸馏水中加入NaCl18g,KCl0.2g,Na2HPO4 1.44g和KH2PO4 0.24g,用浓盐酸调节Ph至7.4,定容至1L。高压灭菌。11)、10过硫酸胺(APS):称取APS 0.5g溶解于5ml ddH2O中,分装保存于20。12)、1溴酚蓝: 称取0.1 g溴酚蓝溶解于10 ml ddH2O中,分装保存于4。13)30%丙烯酰胺(Acr:Bis=29:1):称取丙烯酰胺(Acr)29g,甲叉丙烯酰胺(Bis)1g,用去离子水溶解并稀释至100ml,储存在棕色瓶中于4保存,可用1个月13)、Sample Buffer:总体积 8.0 mlddH2O 3 .8 ml0.5M TrisHcl 1.0 ml甘油 0.8 ml10SDS 1.6 ml-巯基乙醇 0.4 ml1溴酚蓝 0.4 ml实验步骤:1、 样品制备: 小鼠禁食过夜,断头处死,迅速剖开腹腔,取出肝、肾分别称重按1g组织中加入冰预冷的10 ml裂解液,10mM PMSF 1ml 冰上制成10的组织匀浆取1ml匀浆20000g,4、离心30分钟小心吸取上清液取少量上清液进行蛋白定量,余下的-20保存备用2、 蛋白质定量(考马斯亮蓝染色法)考马斯亮蓝G250 是一种蛋白质染料,最大吸收峰在465nm,当它与蛋白质以范德华力结合形成考马斯亮蓝G250蛋白质复合物,其最大吸收峰改变为595 nm,其吸光度与蛋白质含量呈线性关系,故可以用于蛋白质含量的测定。按下表操作。表1加入物 空白管 测定管PBS 150l 145l考马斯亮蓝染液 2.85ml 2.85ml蛋白质提取液 5l摇匀,室温放置5分钟,空白调零,于595nm处比色绘制标准曲线,计算测定管的浓度3、制胶:装配好制胶玻璃板按下列配方配制12的分离胶:12的凝胶溶液成分 体积(总体积10 ml)ddH2O 3.3 ml30丙烯酰胺溶液 4 ml1.5M Tris (Ph8.8) 2.5 ml10SDS 100l10过硫酸胺(APS) 100lTEMED 4l将表中的前四项组分混匀后,再加入APS和TEMED。将上述溶液缓慢注入制胶玻璃片至梳齿下1cm,操作中注意防止产生气泡,聚胶30分钟后用ddH2O完全洗净封闭液。按下列配方配制5的聚集胶: 5的凝胶溶液成分 体积(总体积5 ml)ddH2O 3.4 ml30丙烯酰胺溶液 0.83 ml1.0M Tris (Ph6.8) 0.63 ml10SDS 50l10过硫酸胺(APS) 50lTEMED 5l将表中的前四项组分混匀后,再加入APS和TEMED。注入聚集胶前,用滤纸吸干分离胶上的水。缓慢注入聚集胶,过程中注意防止产生气泡。插入梳齿,聚胶30分钟后小心拔除梳齿。用ddH2O清洗梳孔,放入电泳槽备用。4、 样品处理:用Sample Buffer 按1:1稀释样品95加热变性5分钟5、 上样及电泳:将电泳槽内注满1电泳缓冲液,彻底除去点样孔中和胶底的气泡。两边空白的泳道点上等量的 Sample Buffer ,上样量(20l含40g蛋白)向电泳外槽内注入1电泳缓冲液,盖上盖子,电泳开始时电压为80V,染料进入分离胶后,将电压增加到120V,稳压,当染料抵达分离胶底部约80分钟,断开电源。6、 转膜:剪6块滤纸和一块NC膜,其大小与胶相同将滤纸预先在转移缓冲液中浸泡5分钟,除去气泡。凝胶电泳完成后取出。按照海绵3块滤纸凝胶NC膜另外3块滤纸海绵的顺序依次放,应避免气泡。用塑料支架夹紧上述各层,放入转移内槽及外槽,注入冰预冷的转移缓冲液。注意NC膜一侧靠正极,胶一侧靠负极。转移200mA稳流,4,1.5小时。7、 封闭NC膜: 转移完成后,取出膜放在滤纸上,用铅笔标好正面,室温干燥数分钟。用western blotting封闭液封闭NC膜,室温下振荡1小时后4过夜(NC膜正面向上)8、 一抗结合:一抗用封闭液配制(按1:20(CYP1A1)及1:200(-actin)配制)室温振摇2小时(NC膜正面向上)以TBS-T洗膜3次,每次5-10分钟9、 二抗结合:二抗以TBS-T稀释(按1:600配制)室温振摇孵育1.5小时(NC膜正面向上)以TBS-T洗膜3次,每次5-10分钟10、 显色:辣根过氧化物酶显色1) 在试管中先加入1mlHRP反应缓冲液,然后依次加入试剂A500l、试剂B500l、C500l混匀即可。2) 配制好的溶液应避光存放,30min内使用,染色为褐色。3) 室温下染色时间为530
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 土路基施工方案
- 园区人员安全培训心得课件
- 因特网面面观课件
- 噪声病防治知识培训课件
- 喜爱自己的家乡
- 安全GB培训心得课件
- 安全B本考前培训课件
- 安全a证培训内容科目课件
- 湖南会计从业考试数据库及答案解析
- 安全法律知识竞赛题库及答案解析
- (2025)安全知识竞赛试题(附完整答案)
- 2025年辅警招聘考试(行政职业能力测验)复习题及答案
- 2025年海南事业单位联考笔试历年典型考题及考点剖析附带答案详解
- 2025年水发集团有限公司招聘(216人)备考练习试题及答案解析
- 试验检测资金管理办法
- 护理时政面试题库及答案
- 知识产权系列主题培训课件
- 2025年工勤行政事务高级技师技术等级考试试题及答案
- 给我个机会为班级出力大学生班干部班委竞选模板
- 小儿抽搐课件
- 锻压机床行业分析报告
评论
0/150
提交评论