紫外吸收法测蛋白质含量.doc

紫外吸收法测蛋白质含量姓名：张弛 学号：201100140157 班级：生院2011级生物基地 时间：2013年4月22日实验目的1、 了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理2、 熟悉紫外分光光度计的使用实验原理蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质含量。由于核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质测定有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处。同时测定260nm的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。实验器材及试剂分光光度计、试管、吸管、血清蛋白、标准酪蛋白。实验步骤1、 取9支干净试管，编号，按下表顺序加入试剂。试剂号编号12345678标准蛋白/ml01234500血清/ml0000002.52.5水/ml5432102.52.52、 在280nm波长处测每个管中液体的吸光度3、 在260nm波长处测7、8号样品的吸光度4、 以前6支试管所测吸光度值作标准曲线5、 计算样品浓度实验结果编 号12345678OD(280nm)0.0000.1700.3420.5140.6860.8540.4180.418OD(260nm)-0.3140.3160.480.418 1、 标准曲线法：因为血清稀释了200倍，所以血清蛋白浓度=0.48200=96mg/ml2、 直接测定法：蛋白质浓度=1.45A280nm-0.74A260nm=0.6061-0.2331=0.373mg/ml因为血清稀释了200倍，所以血清蛋白浓度=0.373200=74.6mg/ml注意事项1、 使用移液管时要用食指按住上方，不能用大拇指按。2、 使用分光光度计时，比色杯要拿粗糙面，不可拿光面，擦拭时要用擦镜纸。添加液体前要用蒸馏水和待测液润洗。测量过程中第一个用于调零的比色杯在后面测量中都不拿出来，每次更换液体都要重新调零。3、 注意待测蛋白的稀释倍数，不可使吸光值超过标准曲线的最大值，否则要重新稀释4、 实验室的水龙头接口质量不好，开关水龙头时要轻，否则会把水龙头掰断。实验讨论1、 实验中测样品吸光值时发现样品吸光值大于标准曲线中最大的吸光值，经检查发现是样品提供错了，测量的样品看上去明显比其他组的浑浊。更换样品后重新测量，吸光值在正常范围内。2、 该实验的最终结果运用了两种方法来计算蛋白质浓度，一种是标准曲线法，另一种是直接测量法。标准曲线法先测出标准蛋白的280nm吸光值曲线，将样品测量的280nm吸光值与标准曲线对比，找出蛋白质浓度。直接称量法是测出样品的280nm吸光值和260nm吸光值，代入公式计算。3、 计算结果发现，使用标准曲线法得出的蛋白质浓度高于用直接测量法得出的蛋白质浓度。因为血清蛋白中可能含有核酸，核酸在280nm也有吸光值，所以会影响标准曲线法的测量结果，导致浓度偏高。而直接测量法考虑到了核酸的干扰作用，故280nm和260nm都测量，消除了核酸的干扰作用。4、 血清蛋白样品的280nm吸光值除以260nm吸光值，结果小于1.5，说明血清蛋白样品并不纯，其中含有核酸杂质，所以会使标准曲线法的测量结果偏高。5、 用folin-酚试剂法测蛋白质浓度的准确性比紫外吸收法测量高，其原因是，folin-酚试剂法测量