第02章 离心机.ppt

第二章离心机 1 掌握常用的离心方法 专用离心机的临床应用2 熟悉离心机的工作原理及日常维护3 了解离心机的基本结构及离心方法的进展 教学基本要求 离心机发展简介 离心机的发展表现在构造上的不断改进和离心方法的创新 由最初仅有几十转手摇式电动机发展到几十万转变频 变速的超高速离心机 由十九世纪末到二十世纪初 只能生产低速离心机 到20年代开始生产高速离心机 70年代研发了高速变频离心机 80年代将变频电机和微型计算机相结合 使离心机技术更加成熟和完善 现基本满足各行业的研究和医学上的使用 离心机的发展简介放到最后讲述 前言 离心现象是指物体在离心力场中表现的沉降运动现象 应用离心沉降进行物质的分析和分离的技术称为离心技术 centrifugaltechnique 实现离心技术的仪器是离心机 centrifuge 前言 离心技术主要用于各种生物样品的分离 纯化和制备 目前已知的各种生物体组分 细胞 亚细胞器 病毒 生物大分子等 而对离心方法的深入研究又可以利用这些离心设备更快 更纯 更多地分离纯化样品 前言 一 离心机的工作原理 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或悬浮密度的差异进行分离 浓缩和提纯生物样品的一种方法 悬浮液在高速旋转下 由于巨大的离心作用 使悬浮的微小颗粒以一定的速度沉降 从而使溶液得以分离 颗粒的沉降速度取决于离心机的转速 颗粒的质量 大小和密度 第一节离心机的工作原理 离心机是利用离心机的转子高速旋转产生强大的离心力 迫使液体中微粒克服扩散加快沉降速度 把样品中具有不同沉降系数和浮力密度的物质分离开 离心机运转示意图 第一节离心机的工作原理 1 离心力 centrifugalforce fc 当物体所受外力小于运动所需要的向心力时 物体将向远离圆心的方向运动 物体远离圆心运动的现象称为离心现象 也叫离心运动 离心运动是由于向心力消失或不足而造成的 二 离心力与相对离心力 旋转离心力 第一节离心机的工作原理 离心作用是根据在一定角速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的 离心力 fc 的大小等于离心加速度 2r与颗粒质量m的乘积 即 式中 是旋转角速度 是每分钟转头旋转次数 r为离心半径 m是质量 第一节离心机的工作原理 2 相对离心力 relativecentrifugalforce rcf 相对离心力是指在离心力场中 作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数 单位是 g 由于各种离心机转子的半径或离心管至旋转轴中心的距离不同 离心力也不同 因此在文献中常用 相对离心力 或 数字 g 表示离心力 例如25000 g 表示相对离心力为25000 只要rcf值不变 一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果 一般情况下 低速离心时相对离心力常以转速 rpm 来表示 高速离心时则以 g 表示 第一节离心机的工作原理 若想把生物样品中的微粒从液体中分离出来 最简单的方法是将液体静置一段时间 液体中的微粒受重力的作用 较重的微粒下沉与液体分开 这个现象称为重力沉降 微粒在液体介质中的沉降将受到介质的浮力 介质阻力及扩散现象的影响 三 液体中的微粒在重力场中的分离 第一节离心机的工作原理 沉降速度 sedimentationvelocity 指在强大离心力作用下 单位时间内物质运动的距离 即 式中 为介质的密度 为微粒的密度 g为重力加速度 f为阻力系数 由上式可知 微粒的沉降速度与成正比 与阻力系数f成反比 第一节离心机的工作原理 沉降时间 在实际工作中 常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来需用多大转速与多长时间可达到目的的问题 如果转速已知 则需确定分离某粒子所需的时间即沉降时间 k系数 是用来描述在一个转子中 将粒子沉降下来的效率 k系数与离心转速及粒子沉降的路径有关 所以k系数是一个变数 沉降系数 颗粒在单位离心力场作用下的沉降速度 其单位为秒 各种生物样品的沉降系数差别很大 利用它们沉降系数的差别就可以应用离心技术来进行定性和定量的分析及分离制备 第一节离心机工作原理 四 液体中的微粒在离心力场中的沉降 在离心机中 离心管 centrifugetube 放于离心转头里 当离心机开动时 离心管绕离心转头的轴旋转 作圆周运动 在离心管内的样品颗粒将同样运动 第一节离心机的工作原理 假如颗粒处于真空中 颗粒会沿切线方向飞去 也就是当离心管由图中的0位转到1位时 颗粒到达离心管底部a位 对于离心管而言 样品颗粒由顶位移到了a位 也就是由离心管顶部移到了底部 这与重力场中的由高处落到低处相似 这种颗粒在圆周运动时的切线运动称为离心沉降 第一节离心机的工作原理 离心沉降示意 实际上颗粒是在介质中运动的 颗粒作切线运动时将由于介质的摩擦阻力 使其在离心管中依图中虚线所示的曲线运动 当离心管由0位转到2位时 颗粒由顶位移到b位 介质的阻力越大 颗粒的沉降速度越小 沉降的距离也越短 旋转速度越大 颗粒在离心管中沉降越快 离心沉降示意图 第一节离心机的工作原理 一 离心机的分类 按用途分 按转速分 按结构分 可分为制备型 分析型和制备分析两用型 可分为低速 高速 超速等离心机 可分为台式 多管微量式 细胞涂片式 血液洗涤式 高速冷冻式 大容量低速冷冻式 台式低速自动平衡离心机等 第二节离心机的分类及基本结构 一 低速离心机 二 离心机的基本结构 第二节离心机的分类及基本结构 离心机驱动系统结构 其最大转速10000r min以内 相对离心力15000 g以内 容量为几十毫升至几升 分离形式是固液沉降分离 临床实验室主要用作血浆 血清的分离以及脑脊液 胸腹水 尿液等有形成分的分离 其结构较简单 由电动机 离心转盘 转头 调速器 定时器 离心套管与底座等主要部件构成 第二节离心机的分类及基本结构 1 电动机是离心机的主件 一般多为串激式电动机 它包括定子和转子两部分 串激式电动机有很大的启动转矩 随着负载的增加 转速急剧下降 空载时转速很高 使用时如无特殊需要 不要将离心机的转盘卸掉 第二节离心机的分类及基本结构 2 离心转盘 转头 常用铸铝制成 是平顶锥形 中间有一圆孔 套在电动机上端的转轴上 然后用螺帽旋紧固定 转盘上有6 12个对称的45 角的斜孔 以放试管 转子 转盘 第二节离心机的分类及基本结构 3 调速装置电动机调速装置在电源与电动机之间串联一只可变电阻器 改变电动机的电流和电压 通过旋转或触摸面板自动控制系统 达到转速调节 第二节离心机的分类及基本结构 4 离心套管主要用塑料和不锈钢制成 塑料离心管常用性能较好的材料 如聚丙乙烯 pp 塑料离心管透明 或不透明 硬度小 但易变形 抗有机溶剂腐蚀性差 使用寿命短 不锈钢离心管强度大 不变形 能抗热 抗冻 抗化学腐蚀 第二节离心机的分类及基本结构 二 高速 冷冻 离心机其最大转速为20000 25000r min 最大相对离心力为89000 g 最大容量可达3升 分离形式是固液沉降分离 高速冷冻离心机 第二节离心机的分类及基本结构 临床实验室主要用作分子生物学中的dna rna的分离和基础实验室对各种生物细胞 无机物溶液 悬浮液及胶体溶液的分离 浓缩 提纯样品等 结构由转动装置 速度控制系统 温度控制系统 真空系统 离心室 离心转头及安全保护装置等 第二节离心机的分类及基本结构 1 转动装置主要由电动机 转头轴以及它们之间连接的部分构成 2 速度控制系统由标准电压 速度调节器 电流调节器 功率放大器 电动机 速度传感器等部分构成 第二节离心机的分类及基本结构 3 真空系统由于转速高 当超过40000r min时 空气的摩擦生热就会产生严重后果 因此 高速离心机都配有真空系统 将离心腔密封并抽成真空 以克服空气的摩擦生热 保证离心机达到正常所需要的转速 第二节离心机的分类及基本结构 4 温度控制系统由压缩机 冷凝器 毛细管和蒸发器四个部分组成 采用全封闭式制冷压缩机 压缩机 冷凝器 蒸发器 毛细管 第二节离心机的分类及基本结构 电源过电流保护装置 驱动回路超速保护 冷冻机超负荷保护 操作安全保护 5 安全保护装置 第二节离心机的分类及基本结构 三 超速 冷冻 离心机 超速冷冻离心机 最大转速可达50000 80000r min 相对离心力可达510000 g 离心容量由几十毫升至2升 分离形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离 第二节离心机的分类及基本结构 主要用于科研部门及生物制药领域测定生物大分子 细胞器和病毒等的分离纯化 能使亚细胞器分级分离 并可用于测定蛋白质及核酸的分子量 还可以检测生物大分子的构象变化等 结构主要由一个椭圆形转子 一套真空系统和一套光学系统所组成 第二节离心机的分类及基本结构 基本结构1 椭圆形的转子该转子通过一个柔性的轴连接成一个高速的驱动装置 此轴可使转子在旋转时形成自己的轴 2 真空系统将离心腔密封并抽成真空 转子在一个冷冻的真空腔中旋转 以克服空气的摩擦生热 3 光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质 通过对紫外光的吸收或折射率的不同对沉降物进行监视 第二节离心机的分类及基本结构 第三节离心机的主要技术参数及性能指标 一 主要技术参数及性能指标 1 最大转速离心机转头可达到的最大转速 单位是r min 2 最大离心力离心机可产生的最大相对离心力场rcf 单位是g 3 最大容量离心机一次可分离样品的最大体积 通常表示为mxn m为一次可容纳的最多离心管数 n为一个离心管可容纳分离样品的最大体积 单位是ml 第三节离心机的主要技术参数及性能指标 4 调速范围 转速设置范围 离心机转头转速可调整的范围 5 温度控制范围离心机工作时可控制的样品温度范围 6 工作电压一般指离心机电极工作所需的电压 7 电源功率通常指离心机电机的额定功率 第三节离心机的主要技术参数及性能指标 转头 rotor 是离心机分离样品的核心部件 它的转速与转头的材料及强度有关 低速离心机一般采用强度好 重量轻的超硬铝合金 超速离心机采用钛合金 一般来说 对同一类型离心机重量轻 容量小的转头转速要高 反之转速要低 离心机常有多种不同形状的转头 其各自所反映的离心力场的大小和离心沉降距离也不一样 在实际工作中应根据分离要求正确选择使用 第三节离心机的主要技术参数及性能指标 注 离心机转头的常用标记由三部分组成第一部分为英文字母符号 表示离心转头的类型 第二部分为数字 表示该转头的最高转速 第三部分如标注ti表示由钛或钛合金为材料制成的转头 如sw65ti 指该转头为水平转头 最高转速为65000r min 转头由钛金属制成 第三节离心机的主要技术参数及性能指标 二 离心机转头常用标记及意义 ti钛或钛合金制成的转头 第三节离心机的主要技术参数及性能指标 第三节离心机的主要技术参数及性能指标 各种转头 各种转头 各种转头 一 离心机的日常维护各类离心机因其转速不同 产生的离心力也不一样 如果使用不当或缺乏定期保养与维护 都可造成离心机发生故障影响使用 因此使用离心机时必须定期对其维护 以保证正常使用 1 离心机的安放必须选择坚固的台面 放置平稳 底座橡皮四脚要紧贴台面 防止工作时发生震动 第四节离心机的日常维护 常见故障分析及排除 2 对离心机管套要定期检查 是否管套内有异物和污垢 橡胶垫脱落 随时发现立即处理 以保持平衡 3 离心机转子 套管要保持清洁 每周要用2 戊二醛消毒一次 最后用蒸馏水冲洗 软布擦干装好备用 4 离心机较长时间不用时将转子取出 用干净的沙布擦干 在离心室内放入吸潮剂 硅胶袋 吸收潮气 防止驱动轴生锈 第四节离心机的日常维护 常见故障分析及排除 5 离心机每天使用后 要打开门盖 使潮气去掉 避免长期使用造成部件腐蚀 6 对于大容量冷冻离心机的转子座不能磕碰 不能损伤锥面 要定期用软布将转子座及转子锥孔擦干净 并涂少许凡士林润滑脂 避免摩擦造成损坏 7 离心机台面禁止放其它物品 以防板面造成划伤 离心机部件 转子 离心套管 杯等 定期消毒时禁止使用腐蚀性强的84消毒液 最好使用2 的戊二醛消毒液 第四节离心机的日常维护 常见故障分析及排除 二 离心机常见故障及排除 一 电机不转1 主电源指示灯不亮检查保险丝是否熔断 电源线 插头 插座是否接触良好 2 主电源指示灯亮而电机不能启动检查波段开关 瓷盘变阻器是否损坏或其连接线是否断脱 检查磁场线圈的连接线是否断脱或线圈内部短路 第四节离心机的日常维护 常见故障及排除 二 转头的损坏转头可因金属疲劳 超速 过应力 化学腐蚀 选择不当 使用转头不平衡及温度失控等原因而导致离心管破裂 样品渗漏转头损坏 电动机有上 下轴承 应定期 半年或一年 加油 第四节离心机的日常维护 常见故障及排除 三 机体震动剧烈 响声异常1 离心管重量不平衡 放置不对称 2 转头孔内有异物 负荷不平衡或使用了不合格的试管套 3 转轴上端固定螺帽松动 转轴摩擦或弯曲 4 电机转子不在磁场中心会产生噪音 5 机座上减震弹簧的固定螺丝松动或其中一根弹簧断裂 6 转子本身损伤 第四节离心机的日常维护 常见故障分析及排除 四 高速冷冻离心机不制冷1 冷凝器散热片是否被灰尘阻塞或冷风机不运转 2 制冷系统有泄漏 多数是由制冷管道有断裂 有许多故障为不正确操作所致 正确操作可减少或消除故障 在工作中 如出现任何异常现象均应立即停机 检查原因 不得强行运转 以免产生不必要的损失 第四节离心机的日常维护 常见故障分析及排除 根据离心原理 对不同样品的分离选择不同的离心方法 临床实验室常用的离心方法大致可分为平衡离心法 等密度离心法 经典式沉降平衡离心法等三类 平衡离心法是根据粒子大小 形状不同进行分离的方法 包括差速离心法和速率区带离心法 等密度离心法 又称等比重离心法 是以粒子密度差进行分离的方法 等密度离心法和上述速率区带离心法合称为密度梯度离心法 经典式沉降平衡离心法主要用于对生物大分子分子量的测定 纯度估计 构象变化等 第五节常用的离心方法及临床使用 一 差速离心法 又称为分步离心法 根据被分离物的沉降速度不同 采用不同的离心速度和时间进行分步离心 该法主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒 差速离心法原理示意图 第五节常用的离心方法及临床使用 实验室用该方法提取组织或细胞中成分 将破碎的组织或细胞加入离心管中 先低速离心将上清液取出 把大的组织碎片及沉淀物弃掉 然后将上清液放入离心机后 加高转速离心 将小的颗粒分离出来 直至达到所需要的分离纯度为止 第五节常用的离心方法及临床使用 差速离心法 优点 缺点 1 操作简单 离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开2 可使用容量较大的角式转子 分离时间短 重复性高3 样品处理量大 1 分辨率有限 分离效果差 沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开 不能一次得到纯颗粒2 壁效应严重 特别是当颗粒很大或浓度很高时 在离心管一侧会出现沉淀 颗粒被挤压 离心力过大 离心时间过长会使颗粒变形 聚集而失活 第五节常用的离心方法及临床使用 又称为区带离心法 该法又分为速率区带离心法和等密度区带离心法 该方法主要用于沉降速度差别不大的微粒 将样品放在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡 在一定离心力下把颗粒分配到梯度液中某些特定位置上 形成不同区带的分离方法 二 密度梯度离心法 第五节常用的离心方法及临床使用 密度梯度离心法 优点 缺点 1 分辨率高 分离效果好 可一次获得较纯颗粒2 适用范围广 既能分离沉淀系数差的颗粒 又能分离有一定浮力密度的颗粒 3 颗粒不会积压变形 能保持其活性 并可防止已形成的区带由于对流而引起混合 1 离心时间较长2 需要制备成梯度液 3 操作严格 不易掌握 第五节常用的离心方法及临床使用 根据样品中不同组分粒子所具有的不同体积大小和不同的沉降系数将混合样品进行离心分离提纯 混合样品中不同的组分将在梯度液柱的不同位置分别形成各自的区带 然后将区带取出 只需通过一次离心就可以把混合样品中的各组分分离提纯 其纯度和回收率可达100 一 速率区带离心法 速率区带离心示意图 第五节常用的离心方法及临床使用 其优点是一次分离纯化 组分的沉降系数相差20 以上的即可选用此法 分辨力高 缺点是由于梯度材料的条件限制 样品液浓度不能太高 否则操作条件很难控制 临床实验室常用percoll ficoll及蔗糖分离液对静脉血中的单个核粒细胞的分离 将分离到的淋巴细胞用做t淋巴细胞及b淋巴细胞的免疫功能测定 第五节常用的离心方法及临床使用 离心前预先制备密度梯度液 包括被分离样品中所有粒子的密度 待分离的样品铺在梯度液或和梯度液先混合 离心开始后 当梯度液由于离心力的作用逐渐形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度 与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分布 二 等密度区带离心法 第五节常用的离心方法及临床使用 当管底介质的密度大于粒子的密度 粒子上浮 在弯顶处粒子密度大于介质密度时 则粒子沉降 最后粒子进入到一个它本身的密度位置 即粒子密度等于介质密度 粒子形成纯组分区带 与样品粒子的密度有关 而与粒子的大小和其他参数无关 因此只要转速 温度不变 即使延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置 第五节常用的离心方法及临床使用 差速离心和速率区带离心法主要是根据样品组分的沉降系数不同而进行分离的 而等密度区带离心法则根据样品组分的密度不同来进行分离 许多生物样品的沉降系数和密度有差别 因此可以用这些离心方法进行分离和分析 主要用于科研及基础实验室特殊方面的样品组分的分离和纯化 如提取核酸 亚细胞器及质粒等 第五节常用的离心方法及临床使用 一 工作原理分析型超速离心机主要由一个椭圆形的转子 一套真空系统和一套光学系统所组成 该转子通过一个柔性的轴联接成一个高速的驱动装置 此轴可使转子在旋转时形成自己的轴 三 分析性超速离心法 第五节常用的离心方法及临床使用 转子在一个冷冻的真空腔中旋转 其容纳了两个小室 分析室和配衡室 配衡室是一个经过精密加工的金属块 作为分析室的平衡用 第五节常用的离心方法及临床使用 分析室的容量一般为1ml 呈扇形排列在转子中 其工作原理与一个普通水平转子相同 分析室有上下两个平面的石英窗 离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质 可以通过对紫外光的吸收 如对蛋白质和dna 或折射率的不同对沉降物进行监测 第五节常用的离心方法及临床使用 在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就像一个折射的透镜 在检测系统的照相底板上产出一个 峰 由于沉降不断进行 界面向前推进 峰 也在移动 从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标 分析型超速离心系统的示意图 第五节常用的离心方法及临床使用 二 临床应用范围 分析型超速离心机最大转速40000r min检测波长范围200nm 800nm制备型超速离心机最大转速100000r min最大离心力802400 g 第五节常用的离心方法及临床使用 应用最广的是沉降速度法采用照相记录 即可求出粒子的沉降系数 生物大分子的纯度估计 分析型超速离心机目前广泛应用于研究dna制剂 病毒和蛋白质的纯度 分析生物大分子中的构象变化 可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实 临床实验室基本不用 制备型超速离心机主要用于生物学研究方面 是分离纯化细胞的主要工具 第五节常用的离心方法及临床使用 四 低速离心机的应用是临床实验室常规使用的一类离心机 最大转速在4000r min以内 相对离心力在2810 g 分离形式是固液沉降分离 临床实验室主要用于全血中的血浆 血清的分离及尿液 胸腹水 脑脊液等有形成分的分离 第五节常用的离心方法及临床使用 五 高速离心机的应用最大转速为20000r min 最大相对离心力为17000 g 分离形式是固液沉降分离 主要用于pcr分子生物学检测项目如对乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒患者血清标本中dna及rna的提取 基础实验室对各种生物细胞 无机物溶液 悬浮液及胶体溶液的分离 浓缩和提纯等 为了防止高速离心过程中温度升高而使酶类物质破坏 以及生物分子变性失活 有的高速离心机还装设了制冷系统 又称为高速冷冻离心机 高速离心机 第五节常用的离心方法及临床使用 六 超速离心机的应用最大转速为50000 80000r min 最大相对离心力510000 g 分离形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离 主要用于科研 对样本中亚细胞器的分离 病毒 核酸 蛋白质及多糖的分离 第五节常用的离心方法及临床使用 七 专用离心机离心机的发展逐渐走向专业性专用离心机 目前生产的有输血用的交叉配血离心机 微量毛细管离心机 尿沉渣分离离心机 细胞涂片染色离心机等 第五节常用的离心方法及临床使用 1 输血专用离心机一种带有标准化操作规程 设定限制的专用离心机 转速设定为900r min 最大转速为1500r min 最大相对离心力为182 g 离心2min 用于患者输血前的血型 正 反定型 的鉴定 交叉配血试验 coombs不完全抗体的检查以及对输注血小板的患者进行血小板血型鉴定 血小板抗体的检查等 输血专用离心机 第五节常用的离心方法及临床使用 2 微量毛细管离心机最大转速为12000r min 最大相对离心力为14800 g 为临床实验室专用离心机 操作程序为自动化控制 最大容量一次可离心24根毛细管 专用于血比溶容试验 微量血细胞比积值的测定及同位素微量标记物的测定等 微量毛细管离心机 第五节常用的离心方法及临床使用 3 尿沉渣分离离心机最大转速为4000r min 最大相对离心力为2810 g 在低速离心机