新结构香豆素类荧光分子探针研究毕业论文.doc

新结构香豆素类荧光分子探针的研究新结构香豆素类荧光分子探针的研究 目目 录录 摘要 1 关键词 1 一 绪论 2 1 1 荧光的产生原理 3 1 2 荧光分子探针的结构特征 3 1 3 荧光分子探针识别原理 4 1 3 1 光诱导电子转移 PET Photoinduced Electron Transfer 4 1 3 2 分子内电荷转移 ICT Intramolecular Charge Transfer 4 1 4 荧光分子探针的研究进展 5 1 4 1 萘酰亚胺类荧光分子探针 5 1 4 2 荧光素类荧光分子探针 6 1 4 3 氟硼类 BODIPY 荧光分子探针 7 1 4 4 罗丹明类荧光分子探针 7 1 4 5 香豆素类荧光分子探针 8 1 5 本论文研究的主要内容 11 二 实验部分 12 2 1 原料与仪器 12 2 1 1 主要原料及试剂 12 2 1 2 主要仪器 13 2 2 合成原理 14 2 2 1 化合物 a 的合成原理 14 2 2 2 化合物 b 的合成原理 15 2 3 目标化合物的合成及表征 15 2 3 1 化合物 a 的合成与表征 15 2 3 2 化合物 b 的合成与表征 16 2 4 紫外及荧光光谱的测定 16 2 4 1 不同溶剂中的光谱研究 16 2 4 2 摩尔消光系数的测定 16 2 4 3 Stokes 位移计算 17 2 4 4 对金属离子的识别测定 17 三 结果与讨论 18 3 1 化合物A的光谱解析及对金属离子的识别 18 3 1 1 化合物 a 在不同溶剂中的紫外及荧光光谱 18 3 1 2 DMSO 中化合物 a 对金属离子的识别 19 3 2 化合物B的光谱解析及对金属离子的识别 21 3 2 1 化合物 b 在不同溶剂中的紫外及荧光光谱 21 3 2 2 乙腈中化合物 b 对金属离子的识别 23 四 结 论 26 致 谢 27 参考文献 28 附录 28 摘 要 分子识别是广泛存在的自然现象 特别是在生命过程中 分子识别起着极 其重要的作用 荧光分子探针能够将分子识别的信息转换成荧光信号 具有高 灵敏性 选择性 分辨时间短 实时原位检测等突出优点 因而广范地用于对 微量物质进行检测 在生命科学 材料科学和环境科学等领域有许多重要应用 近年来 以香豆素为基础的荧光分子探针已成为一个新兴的研究热点 设计合成了两种新型的香豆素类荧光分子探针 7 N N 二乙氨基香豆素 3 甲酰水杨醛腙 a 7 N N 二乙氨基香豆素 3 甲酰氨基苯硫脲 b 通 过 1HNMR MS 进行了结构表征 并研究了不同溶剂对其光谱性能的影响 离子 识别结果表明 化合物 a 对 Cu2 表现为荧光淬灭识别 效率为 98 9 而化合 物 b 对 Cu2 表现为荧光增强识别 关键词 荧光分子探针 香豆素 阳离子识别 新结构香豆素类荧光分子探针的研究新结构香豆素类荧光分子探针的研究 化学工程与工艺 吴志杰 指导教师 孙小冬 一 一 绪论绪论 自从 20 世纪 60 年代末 Pedersen s 合成并发现冠醚以来 人们对分子识 别的兴趣与日俱增 所谓分子识别是指分子之间 主体与客体或称之为受体与 底物 靠非共价键力的选择性结合并产生某种特定功能的过程 识别是有目标 的结合 它是通过一系列结构确定的分子间相互作用而组成的模式识别过程 结合形成的超分子体系是由它的稳定性和选择性 即形成过程中的能量和信息 量来表征的 1 识别事件的信号可通过分子器件以光的形式表达出来 荧光分 子探针 fluorescent sensor 就是一类能将分子识别事件通过荧光信号有效 表达的分子 是这一领域的研究热点 2 荧光探针是一类重要的检测物质 其广泛应用在冶金 农业 考古学 矿 物学 环境化学 药理学 生理学 分子生物学 细胞生物学 分子遗传学 单个分子检测 信息科学 荧光标记 激光染料等方面 荧光分子探针以其高 灵敏度 极宽的动态响应时间 开 关间可转换性 人 分子间 无线 遥控交 流的可行性以及使用方便等优点而备受关注 近年来得到迅速发展 基于主客 体作用 利用主体对作为客体的待检测物种的特异性作用可改变主体分子所连 接发光体的微环境 通过发光体的荧光强度 荧光寿命 荧光光谱形状和荧光 偏振等变化作为荧光信号输出 实现对客体分子的选择性识别和测定 3 荧光 分子探针在信息科学 药物化学 生理学 环境科学等领域 尤其在对生物分 子的检测中有着十分广泛的应用 荧光团上引入活性基团 如琥珀酰亚胺 异 硫氰酸醋 马来酰亚胺等 可以与生物分子上的胺基等基团通过共价键特异性 结合 从而对生物分子进行荧光标记 通常一个用于检测底物的荧光分子探针必须具备一些优良的物理 化学性 质 如 化学和光稳定性 高选择性及高灵敏度 瞬间响应底物的能力 合适 的溶解度 检测系统的易操作性 荧光激发波长应尽量位于可见光区 4 5 1 11 1 荧光的产生原理荧光的产生原理 分子荧光是指分子在辐射能如紫外 可见光的照射下 电子跃迁至激发单 重态 并以无辐射驰豫方式回到第一激发单重态的最低振动能级 由此再跃回 到基态或基态中的其它能级时所发出的光 6 由 Alexander Jablonski 在 1935 年提出的荧光产生的过程图 常被称为 Jablonski 图 7 见图 1 1 通常情况 下 荧光试剂分子处于基态 吸收光后 试剂分子的电子被激发而处于激发态 基态和激发态都有单重态和三重态两种类型 化合物能够产生荧光的最基本的 条件是它发生多重性不变的跃迁时所吸收的能量小于断裂最弱的化学键所需要 的能量 其次 在化合物的结构中必须有荧光基团如 C O N O N N C N C S 等 当这些基团是分子的共扼体系的一部分时 则该化合物可能产 生荧光 图1 1 发光系统的Jablonski 图 Fig 1 1 Jablonski diagram for a photoluminescent system 1 21 2 荧光分子探针的结构特征荧光分子探针的结构特征 典型的荧光分子探针通常由三个部分组成 即 1 接受体 receptor 或 称控制单元部分 它主要用于特异性地结合客体 同时它能够通过外在的参数 来可逆地调控开 关状态 2 荧光团 fluorophore 部分 专管光能的吸收 和荧光的发射 起着信号传导作用 当分析物质与受体作用后 导致荧光团光 物理性质 荧光强度 量子产率和荧光寿命等 变化 8 用以发出信号指示底 物已被捕获 3 连接体或隔离基 spacer 用以连接接受体和荧光团 在荧光分子探针中主体和客体间通过不同的作用方式相结合 它们的形成 主要依赖一些弱相互作用 如分子氢键 芳香 和 Vander Waals 作用等 但也有一些是通过共价键形成的 如硼酸衍生物与糖和羟基化合物的结合即是 其中的一类 荧光分子探针在对客体的分析和检测中有一些突出的优点 通过 荧光强度的变化可以直观地体现客体的存在 它具有高的灵敏度 甚至单个分 子也能被检测到 荧光传感测量法是非侵入性的 对样品不具破坏性 同时具 有高的选择性 能在微米水平上检测离子 1 31 3 荧光分子探针识别原理荧光分子探针识别原理 1 3 11 3 1 光诱导电子转移光诱导电子转移 PET PET PhotoinducedPhotoinduced ElectronElectron Transfer Transfer 典型的光诱导电子转移 Photoinduced Electron Transfer PET 体系是 由包含电子给体的受体部分 R Receptor 通过间隔基 S Spacer 如 CH2 和荧光团 F Fluorophore 相连而构成的 9 11 在 PET 荧光分子探针中 识别 基团与荧光团之间的识别信息与荧光信号之间的转化是靠光诱导电子转移完成 的 PET 荧光分子探针的具体工作过程如下 具有电子给予能力的识别基团能 够将其处于最高能级的电子转入激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道 使被光激发的电子无法直接跃迁回原基态轨道发射荧光 导致荧光团的荧光淬 灭 然而 当识别基团与客体结合后 降低了识别基团的给电子能力 PET 过 程被减弱或不再发生 使荧光团的荧光发射增强 因此在未结合客体之前 分 子不发射荧光或荧光很弱 一旦受体与客体相结合 荧光团就会发射出强荧光 见图 1 2 PET 荧光分子探针的作用机制可由前线轨道能量来进一步说明 12 图 1 3 PET 荧光分子探针中 多数都是以脂肪胺及其衍生物或芳胺及其衍生 物作为识别基团 同时作为 PET 的电子给体 荧光淬灭基团 荧光团和识别基 之间的连接基一般是亚甲基 乙撑基或丙撑基等短链烷基 过长的连接基将使 PET 效果变差 图 1 2 PET 荧光分子探针一般原理图 图 1 3 PET 机制的前线轨道理论示意图 1 3 21 3 2 分子内电荷转移分子内电荷转移 ICT ICT IntramolecularIntramolecular ChargeCharge Transfer Transfer 典型的 ICT 荧光分子探针是荧光团上分别连接有强的推电子基和吸电子基 或是在和离子结合后形成一个强的推 拉电子体系 推电子基 吸电子基和荧光 团共扼相连 在光激发下会产生从电子给体向电子受体的电荷转移 ICT 荧光 分子探针的受体单元往往是推 拉电子体系整体中的一部分 当受体单元与客体 结合时 会对荧光团的推 拉电子作用产生影响 或是减弱了分子内电荷转移 或是强化了电荷转移 从而导致荧光光谱的变化 如荧光发生蓝移或红移 如图 1 4 所示 一般情况下 ICT 荧光分子探针对荧光强度的影响不如 PET 荧光传 感器那么显著 13 图 1 4 ICT 荧光分子探针在金属离子与其电子给体 或电子受体结合作用后荧光光谱移动方向 Fig 1 4 Spectral displacements of ICT probes resulting from interaction of a bound cation with an electron donating or electron withdrawing group 1 41 4 荧光分子探针的研究进展荧光分子探针的研究进展 1 4 11 4 1 萘酰亚胺类荧光分子探针萘酰亚胺类荧光分子探针 萘酰亚胺是一类重要的荧光化合物 特别是4位有强烈供电基团如氨基的衍 生物都能够发射强荧光 光稳定性好 荧光发射波长适中 Stocks位移大 经 常被用作高灵敏度荧光标记物和对某些特定金属离子具有响应的光化学分子探 针 N O O O O O O N C4H9 NHHN OO NN 1 1 2 2 郭祥峰等 14 设计合成了N 丁基 4 氮杂 15 冠 5 1 8 萘酰亚胺 即化合 物1在二氯甲烷溶液中可选择性识别Li 和Na 在Li 和Na 加入后 无论是荧 光光谱还是吸收光谱都出现了显著蓝移 而K 和Mg2 对其的光谱没有明显影响 化合物2 15 是对Cu2 具有选择性识别的荧光分子探针 1 4 21 4 2 荧光素类荧光分子探针荧光素类荧光分子探针 Elizabeth M Nolan 等 16 合成了含 8 氨基喹啉的荧光素染料荧光传感器 3 3 和 4 4 它们与 Zn2 的配合物分别地实现从 42 到 150 倍范围的荧光增强 与 Zn2 结合的配体荧光强度优于与 Mn2 Fe2 Co2 Cd2 和 Hg2 的结合 且在 4 3 时 kon可达 3 4 106 M 1 s 1 脱离 Zn2 瞬间使 koff至 150 160 s 1 在毫秒内实现了可逆性 1 1 在过量的 EDTA 中 提取任意一种潜在的干扰离子 量子效率为 0 024 524 nm 而加入 Zn2 后则使量子效率增大 33 倍至 0 78 524 nm 光谱蓝移 激光共焦与光子显微镜显示 4 4 是细胞能透过的 而由于它与 Zn2 弱的结合力 使 Zn2 在体内可以作出响应 从而可以用于细胞 内专门性的识别 Zn2 O N HN HO Cl CO2H O O N HN HO CO2H O N NH 3 3 4 4 2006 年 Elizabeth M Nolan 工作小组又 17 合成了两种不对称的荧光素 类染料传感器 5 5 和 6 6 对 Hg2 具有选择性识别作用 与 Hg2 1 1 结合都形成 包含一个单吡啶基 胺 硫醇金属配合物 显示出优越的亮度 在中性 pH 值溶液 中 荧光随着吸收率的增加而增强 当 pH 值增大时 光诱导电子转移使染料体 淬灭增强 而 Hg2 的结合则减缓这种趋势 6 6 可以检测水溶液中 Hg2 达到 ppb 水平 从而可以用来检测环境中相关的 Hg2 浓度 O N NH HO Cl O CO2H H H SH O N NH HO Cl O CO2H CH3 H3C SH 5 5 6 6 1 4 31 4 3 氟硼类 氟硼类 BODIPYBODIPY 荧光分子探针 荧光分子探针 BODIPY染料母体结构周围一般不直接连接对酸碱较敏感的氨基 羟基等 所 以一般对酸碱不敏感 且荧光量子产率一般都比较高 具有相对较好的光稳定 性 荧光光谱半峰宽较窄 作为荧光标识的时候有很好的灵敏度摩尔吸光系数 很大 吸光效率比较高因此被广泛的应用于各种金属离子的检测测定pH值 识别 中性分子及阴离子 进行DNA标记及测序 作为发光材料 18 Wu等 19 设计并合成了生物用Zn2 荧光分子探针7 7 尽管分子中存在脂肪族 叔氮原子 但是 7 7对pH并不敏感 其pKa被降为2 1 其原因可能由于BODIPY荧光 团的缺电子性减少了DPA叔氮原子的碱性 另外 识别体的结构导致明显的原子 之间的空间排斥 结构进一步扭曲 氢质子难以靠近叔氮原子 化合物7对Zn2 的检出限达10 9 mol L 7 7的细胞渗透性很好 在细胞内Zn2 的荧光成像研究获 得了满意的结果 化合物8 20 是单氮杂冠醚为受体的K 离子ICT荧光分子探针 N B N N N N F F N B N O F N O O OO O F 7 7 8 8 1 4 41 4 4 罗丹明类荧光分子探针罗丹明类荧光分子探针 罗丹明类化合物是以氧杂蒽为母体染料 基于它们优秀的光学性质如光稳 定性好 对pH不敏感 较宽的波长范围和较高的荧光量子产率等优点广泛被用 作分子探针和传感器应用于复杂的生物体系的研究 21 罗丹明类传感器不仅具 有高的吸光率和对某些金属离子有荧光增强效应 还具有颜色效应 Hong Zheng 等 22 合成的化合物 9 9 在水溶液中由可见光 400nm 照射 时无吸收峰 当加入 Hg2 9 9 在波长 561 nm 处显示一个新的最大吸收峰 1 25 105 M 1cm 1 这归因于 9 9 上的 N S 与 Hg2 调节打开了螺环 它还 显示出强烈的红紫色 高灵敏性的指示出水中的 Hg2 在 561 nm 处 B 的吸光 率随着 Hg2 浓度升高而直线性上升 当 9 9 浓度为 1 0 10 5 M 时 Hg2 最低可以 被检测到 1 0 10 7 M 达到 ppb 水平 O N Et2N S NEt2 NH2 9 9 O N Et2N O NEt2 O N Et2N O NEt2 N H 1010 Yu Xiang 23 设计合成了一个新型的罗丹明类荧光分子探针 1010 研究显示 在乙醇和水溶液中对 Fe3 的选择性高于其它同类金属离子 化合物 1010 在缓冲 液 Tris Hcl pH 7 15 或纯乙醇中均无颜色 当加入 Fe3 时 迅速产生紫色和 橙色荧光 当加入其它离子如 Co2 Ni2 Zn2 等时并无颜色变化或只有轻 微变化 即 1010 能够选择性识别 Fe3 且可以检测至 Fe3 达 10 5 M 而在乙醇 中 则会新增一个 max 557 nm 的吸收峰 主要是由于 1010 的螺环被打开 在 500 600 nm 范围内有增强的荧光效应 1 4 51 4 5 香豆素类荧光分子探针香豆素类荧光分子探针 香豆素及其衍生物在溶液中具有高的量子效率和大的 Stokes shift 70 100 nm 通过对其母体进行化学修饰 可实现可见光区域连续的波长变化 科 学家们常常用它们设计荧光分子探针的材料 Valeur B 小组 24 以杯 4 冠醚为受体设计合成了可选择识别 Cs 的化合 物 11 在水中产生强荧光 f 0 4 11 与 Cs 络合后荧光增强并导致吸收光 谱红移 10 nm 这可解释为在 11 Cs 络合物中 Cs 与两个磺酸根的近距离作用 导致香豆素 6 7 位氧原子附近形成负电荷笼罩 提高了氧原子的供电能力使 ICT 效应增强 O O O O O OO O O O O O O O OO O3S SO3 SO3 O3S 1111 Suzuki K 等 25 开发的 Mg2 荧光传感器是在香豆素的 3 位连接乙酰氧甲基 而成化合物 12 13 它们与 Mg2 形成 1 1 络合物并使吸收光谱红移 20 nm 荧 光光谱红移 10 nm 相对 Ca2 而言 它们对 Mg2 有较高的选择性 将它们在 PC12 活细胞中进行 Mg2 荧光成像 结果表明 Mg2 主要分布在细胞质部分 强荧光 而 不是细胞核部分 弱荧光 这些均是 Mg2 与香豆素 二酮部分强烈结合的结 果 26 O O N OO OO O O N OO OO 1212 1313 由 Suzuki K 等 27 合成的化合物 14 是第一个针对 Ca2 Mg2 多分析物的单分 子荧光传感器 在 14 中位于香豆素供电位置 6 7 位的 O O 双 2 氨苯基 乙 二醇 N N N N 四乙酸 BAPTA 是 Ca2 的选择性受体 而位于吸电位置的 二酮却是 Mg2 的良好受体 14 Ca2 引起吸收光谱蓝移 45 nm 荧光光谱蓝 移 5 nm 而 14 Mg2 却引起吸收光谱红移 21 nm 荧光光谱红移 5 nm O HOOC N COOH COOH O O N HOOC HOOC F O ON H N NH2 NH2O CH3 1414 1515 Katerinopoulos H E 研究组 28 将 7 氨基 4 甲基香豆素与三 2 氨乙基 胺 TREN 相连合成比率 Zn2 荧光传感器 15 在 HEPES 缓冲溶液中 15 与 Zn2 络 合后激发波长从 359 nm 蓝移至 337 nm 在 359 nm 激发 15 Zn2 时荧光强度呈 下降趋势 而在 337 nm 处激发随 Zn2 浓度增加荧光强度略有提高 最大荧光波 长保持在 450 nm 体系中其它离子 Cd2 Mg2 Fe2 的存在并未明显影响 15 对 Zn2 的识别选择性 2004 年 Heder R C 等 29 分别以 3 羟基吡啶 4 酮和 3 羟基吡喃 4 酮为 受体合成了两个系列 23 个香豆素类 Fe2 荧光传感器 16 它们是以 6 种类型的 香豆素衍生物为荧光团 分别通过氨基 碳碳单键 碳碳双键与两个受体的不 同部位连接而成 Fe3 对吡啶酮类为受体的传感器产生明显的荧光淬灭效果 而对吡喃酮类传感器淬灭适当 主要原因是前者对 Fe3 有更高的结合常数 约比 后者大 104倍 此外两种受体对 Fe3 有较高的结合力 从而利于 Fe2 在需氧条 件下的氧化 所以这些传感器适于监测 Fe2 和 Fe3 的混合水平 X O OH R2 R1R3 R4 X O N R1 R2 R3 R4 H CH3 coumarin derivatives O NN N HO HN OH HN OH O O O O N S O N HO Hg2 1616 1717 图 1 5 17 Hg2 络合结构预测 2006 年 Qian X H 小组 30 报道了基于 ICT 机理的新型比率 Hg2 荧光传感 器 1717 它是在香豆素的 6 7 位连接四酰胺受体而成 在 1717 中形成了以苯胺两 个富电子 N 原子为电子供体而羰基和苯并噻唑为电子受体的 ICT 体系 在 Hg2 40 equiv 存在时可使荧光光谱从 567 nm 蓝移至 475 nm 约 100 nm 荧光 由橙色变为蓝绿色 在考察的过渡金属离子中 只有 Hg2 在中性缓冲水溶液中 可调节 1717 的荧光性质 在 1717 Hg2 络合结构中 两个去质子酰胺的 N 原子和 邻苯二胺的两个 N 原子对 Hg2 形成四面体配位 而另两个未络合的酰胺臂产生 空间位阻限制了其自由旋转 图 1 5 从而利于 1717 Hg2 的形成 1 51 5 本论文研究的主要内容本论文研究的主要内容 近年来 以香豆素类为基础的荧光分子探针逐渐成为一个新兴的研究热点 从分子结构上看 香豆素类化合物是结构较为特殊的肉桂酸内酯 其功能很大 程度上取决于香豆素环上取代基的性质 尤其是 3 4 位有吸电子基 6 7 位有供电子基的衍生物都能发射强的荧光 光稳定性好 荧光量子产率高 荧光 发射波长范围较大 Stokes 位移大 更有益于研究应用 尽管荧光分子探针的 设计已有一些指导原理 但分子结构的差异对探针的影响还是难以预测的 因 此需要合理的思考和设计 并通过大量的试验和测试来验证 本论文依据荧光分子探针的基本原理 以 7 二乙胺基香豆素 3 甲酸乙酯 为原料 合成了两个香豆素类荧光分子探针 用 1HNMR MS 手段对目标分子进 行了结构表征 利用紫外 可见分光度计 荧光分光光度计对目标分子进行不同 类型金属离子的识别评价 二 二 实验部分实验部分 2 12 1 原料与仪器原料与仪器 2 1 12 1 1 主要原料及试剂主要原料及试剂 实验所用主要原料及试剂见表 2 1 药品名称规格生产单位 4 N N 二乙氨基 水杨醛 A R 北京成宇化工有限公司 丙二酸二乙酯 CP 国药集团上海化学试剂厂 甲苯 A R 沈阳市新化试剂厂 乙腈 A R 天津市科密欧化学试剂有限公司 六氢吡啶 A R 国药集团化学试剂有限公司 石油醚 A R 天津市科密欧化学试剂有限公司 二氯甲烷 A R 天津市科密欧化学试剂有限公司 甲醇 A R 天津市科密欧化学试剂有限 公司 丙酮 A R 天津市科密欧化学试剂有限公司 乙酸乙酯 A R 天津市凯通化学试剂有限公司 无水乙醇 A R 天津市凯通化学试剂有限公司 水合肼 80 A R 天津市东丽区天大化学试剂厂 水杨醛 CP 天津市科密欧化学试剂有限公司 二甲基亚砜 A R 天津市凯通化学试剂有限公司 三氯甲烷 A R 天津市凯通化学试剂有限公司 四氢呋喃 A R 天津纵横兴工贸有限公司 盐酸 CP 齐齐哈尔市永强合成化工厂 氢氧化钠 A R 天津市东丽区天大化学试剂厂 石英砂40 70 目天津市石英钟厂霸州市化工分厂 表 2 1 主要原料及试剂 2 1 22 1 2 主要仪器主要仪器 实验所用主要仪器见表 2 2 表 2 2 主要设备及仪器 仪器名称型号生产单位 电子天平 BS124S 北京赛多利斯仪器系统有限公司 循环水式真空泵 SHZ D 河南巩义市英峪予华仪器厂 旋转蒸发器 RE 52AA 上海嘉鹏科技有限公司 手提紫外检测灯 ZF 7A 上海顾村电光仪器厂 暗箱式紫外检测灯 ZF 20D 上海顾村电光仪器厂 磁力加热搅拌电热套 DHT 山东鄄城华鲁电热仪器有限公司 控温磁力搅拌器SZCL 型河南巩义市英峪予华仪器厂 电热鼓风干燥箱 WG 43 天津市泰斯特仪器有限公司 真空干燥箱DZ 1BC 型天津市泰斯特仪器有限公司 精密 pH 计 PHS 25C 上海康仪仪器有限公司 双光束紫外可见分光光度计 TU 1901 北京普析通用仪器有限责任公司 荧光分光光度计 LS55 美国 perkin elmer 公司 超导核磁共振仪 Brucker 400 瑞士 Brucker 公司 Ion Trap LC MS6310Agilent Technologies 2 22 2 合成原理合成原理 2 2 12 2 1 化合物化合物 a a 的合成原理的合成原理 N CHO OH O O OC2H5 OC2H5 N H ONO O OC2H5 NH2NH2H2O CH3CH2OH ONO O NHNH2 CHO OH CH3CH2OH 1 2 ONO O N H N HO 3 a 2 2 22 2 2 化合物化合物 b b 的合成原理的合成原理 N CHO OH O O OC2H5 OC2H5 N H ONO O OC2H5 NH2NH2H2O CH3CH2OH ONO O NHNH2 CH3CH2OH NCS 1 2 ONO C O N H H N C H N S 3 b 2 32 3 目标化合物的合成及表征目标化合物的合成及表征 2 3 12 3 1 化合物化合物 a a 的合成与表征的合成与表征 在 500mL 三颈烧瓶中 依次加入 2 27g 11 78mmol 4 氮氮二乙胺基水杨 醛 2 84g 17 76mmol 丙二酸二乙酯 3 01g 35 4mmol 六氢吡啶 45mL 甲苯 90mL 乙腈 氩气保护下回流反应 12h 粗产物经硅胶柱分离 洗脱剂为二氯甲 烷 乙酸乙酯 12 1 V V 得黄色固体 1 产率 1 92g 56 3 H 400MHz CDCl3 8 43 s 1H 7 36 d J 8 8Hz 1H 6 61 q 1H 6 47 d J 2 4Hz 1H 4 38 q 2H 3 45 q 4H 1 24 t 6H 在 100mL 三颈烧瓶中 加入 0 511g7 二乙氨基香豆素 3 甲酸乙酯 然后滴 加 0 5ml 水合肼 在室温 氩气保护下反应 1 小时 10 分钟 减压抽滤 用无水 乙醇洗涤 3 4 次 得黄绿色固体 2 真空干燥 产率 0 197g 40 5 1H NMR 400 MHz CDCl3 H 9 73 s 1H 8 68 s 1H 7 42 d J 9 2Hz 1H 6 67 q J 3 7Hz 1H 6 499 d J 2 4Hz 1H 4 176 br 2H 3 48 q J 7 0Hz 4H 1 26 t J 7 0 Hz 6H API ES MS positive m z M H 276 2 M Na 298 1 在 100mL 三颈烧瓶中 加入黄色固体 2 0 101g 然后加入 15ml 无水乙醇 使其溶解 滴加 5 滴水杨醛 在室温 氩气保护下搅拌回流反应 5h 减压抽滤 用无水乙醇洗涤 3 4 次 得桔黄色固体 3 真空干燥 产率 0 077g 55 4 1H NMR 400 MHz CDCl3 H 11 82 s 1H 11 20 s 1H 8 77 s 1H 8 32 s 1H 7 45 d J 9 2Hz 1H 7 26 t J 9 2 Hz 2H 7 00 d J 8 4Hz 1H 6 87 d J 7 6Hz 1H 6 70 q J 3 8Hz 1H 6 49 d J 2Hz 1H 3 47 q J 7 0Hz 4H 1 24 t J 7 2 Hz 6H API ES MS positive m z M H 380 3 M Na 402 2 2 3 22 3 2 化合物化合物 b b 的合成与表征的合成与表征 在 500mL 三颈烧瓶中 依次加入 2 27g 11 78mmol 4 氮氮二乙胺基水杨 醛 2 84g 17 76mmol 丙二酸二乙酯 3 01g 35 4mmol 六氢吡啶 45mL 甲苯 90mL 乙腈 氩气保护下回流反应 12h 粗产物经硅胶柱分离 洗脱剂为二氯甲 烷 乙酸乙酯 12 1 V V 得黄色固体 1 产率 1 92g 56 3 H 400MHz CDCl3 Me4Si 6 61 q 1H 6 47 d J 2 4Hz 1H 4 38 q 2H 3 45 q 4H 1 39 t J 5 3Hz 3H 1 24 t 6H 在 100mL 三颈烧瓶中 加入 0 511g7 二乙氨基香豆素 3 甲酸乙酯 然后加 入 15ml 无水乙醇使其溶解 滴加 0 5ml 水合肼 在氩气保护下反应 4 小时 减 压抽滤 用无水乙醇洗涤 3 4 次 得黄绿色固体 2 真空干燥 产率 0 197g 40 5 1H NMR 400 MHz CDCl3 H 9 73 s 1H 8 68 s 1H 7 42 d J 9 2Hz 1H 6 67 q J 3 7Hz 1H 6 499 d J 2 4Hz 1H 4 176 br 2H 3 48 q J 7 0Hz 4H 1 26 t J 7 0 Hz 6H API ES MS positive m z M H 276 2 M Na 298 2 在 50mL 三颈烧瓶中 加入黄色固体 2 0 046g 然后加入 0 08ml 异硫氰酸 苯酯 在室温 氩气保护下反应十分钟 减压抽滤 用无水乙醇洗涤 3 4 次 得黄绿色颗粒状固体 3 产率 0 060g 87 5 1H NMR 400 MHz DMSO d6 H 9 778 br 1H 8 71 s 1H 7 74 d J 8 8Hz 1H 7 51 br 2H 7 34 t J 7 8Hz 2H 7 15 t J 2 6Hz 1H 6 85 q J 3 8Hz 1H 6 66 d J 2 0Hz 1H 3 52 q J 7 0Hz 4H 1 16 t J 7 0Hz 6H API ES MS positive m z M H 411 1 M Na 433 1 2 42 4 紫外及荧光光谱的测定紫外及荧光光谱的测定 2 4 12 4 1 不同溶剂中的光谱研究不同溶剂中的光谱研究 准确称取待测化合物 将其移入 5 mL 容量瓶中 用二氯甲烷定容 配成 1 0 10 3mol L 的母液 分别移取 50 L 溶液于 5 mL 容量瓶中 用氮气吹干二 氯甲烷 再分别用选定的溶剂定容 待样品完全溶解得浓度 1 0 10 5 mol L 溶 液 测定其紫外光谱 利用不同溶剂中紫外光谱的最大吸收波长作为荧光光谱 的激发波长 测定荧光光谱 2 4 22 4 2 摩尔消光系数的测定摩尔消光系数的测定 利用紫外可见吸收光谱测定化合物的摩尔消光系数 计算式如下 A cl 其中 A 代表吸收强度 为摩尔消光系数 c 是化合物的浓度 l 为检测用 的石英池的厚度 2 4 32 4 3 StokesStokes 位移计算位移计算 Stokes位移是荧光化合物重要的物理常数之一 它可以表明荧光化合物在 基态和激发态之间性能和结构的差异 Stokes位移按照式计算 A F 1 A 1 F 107 cm 1 其中 A F 分别表示最大吸收频率和最大发射频率 用波数表示 A F分别表示最大吸收波长和最大发射波长 用 nm 表示 2 4 42 4 4 对金属离子的识别测定对金属离子的识别测定 在乙腈中进行金属离子的识别测定 化合物分子的浓度为 1 0 10 5 mol L 和 5 10 6mol L 分别加入设计量的 NaNO3 KNO3 Mg NO3 2 Ca NO3 2 Co NO3 2 Zn NO3 2 Ni NO3 2 Cd NO3 2 Cu NO3 2 FeCl2 Fe NO3 3 Cr NO3 3 Pb NO3 2 HgCl2 AgNO3测定其紫外及荧光光谱 三 三 结果与讨论结果与讨论 3 13 1 化合物化合物 a a 的光谱解析及对金属离子的识别的光谱解析及对金属离子的识别 3 1 13 1 1 化合物化合物 a a 在不同溶剂中的紫外及荧光光谱在不同溶剂中的紫外及荧光光谱 图 3 1 图 3 2 分别为化合物 a 在不同溶剂中的紫外 可见吸收光谱和荧光光谱 表 3 1 为相应的光谱数据表 350400450500550 0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 Abs Wavelength nm acetonitrile acetone THF methanol DMSO 图 3 1 化合物 a 在不同溶剂中的紫外光谱 350400450500550600650 0 50 100 150 200 250 300 350 400 IF a u Wavelength nm acetone THF acetonitrile DMSO methanol 图 3 2 化合物 a 在不同溶剂中的荧光光谱 激发波长 430nm sensor 浓度 1 10 5mol L 表 3 1 化合物 a 在不同溶剂中的光谱数据 溶剂 abs max nm em max nm 105 L mol 1 cm 1 max cm 1 IF DMSO4364840 4082274 62179 381 methanol4364800 4352102 44114 075 acetonitrile4324760 5882139 74219 982 acetone4304740 5482158 77380 359 THF4264700 4932197 58337 661 由表 3 1 数据可知 化合物 a 在不同有机溶剂中的紫外及荧光光谱明显不 同 随溶剂极性的减弱 荧光呈增强趋势 在 THF 溶剂中与在 DMSO 溶剂中相比 较 化合物 a 的紫外吸收波长蓝移约 10 nm 而荧光明显增强 增强 88 2 化 合物 a 在丙酮中较在其它溶剂中的荧光光谱增强最为明显 增强 112 0 3 1 23 1 2 DMSODMSO 中化合物中化合物 a a 对金属离子的识别对金属离子的识别 图 3 3 为在 DMSO 中化合物 a 对常见的金属离子 Na K Mg2 Ca2 Co2 Zn2 Ni2 Cd2 Cu2 Fe2 Fe3 Cr3 Pb2 H g2 Ag 识别的荧光光谱 表 3 2 为相应的光谱数据表 350400450500550600650 0 50 100 150 200 250 IF a u Wavelength nm no cation other cations Fe3 Fe2 Co2 Ni2 Cu2 图 3 3 化合物 a 对不同金属离子响应的荧光光谱 在 DMSO Tris HCl 缓冲溶液 pH 7 4 8 2 体系中 sensor 浓度 5 10 6mol L 加入 20 倍离子 激发波长 443nm 表 3 2DMSO 中化合物 a 对不同金属离子识别的光谱数据 em max nm IF a491246 689 a Ag 490 5205 114 a Ca2 490 5224 547 a Cd2 490 5218 221 a Co2 497 513 941 a Cr3 490 5203 999 a Cu2 4922 648 a Fe2 49320 407 a Fe3 491 535 668 a Hg2 491204 881 a K 490223 907 a Mg2 491212 017 a Na 490209 711 a Ni2 498 56 651 a Pb2 490200 456 a Zn2 492197 96 由 DMSO 中化合物 a 对不同金属离子响应的荧光光谱及表中数据可知 化合 物 a 加入 Ni2 后 荧光最大发射波长红移 7 5 nm 荧光淬灭 97 3 加入 K Na Pb2 后 荧光最大发射波长蓝移 1 nm 荧光淬灭 9 2 15 0 和 18 7 而其他离子加入化合物 a 溶液中 荧光最大发射波长没有明显变化 但 加入 Cu2 后 荧光淬灭 98 9 加入 Co2 后 荧光淬灭 94 3 对于 Ni2 Co2 使化合物 a 发生最大荧光发射波长的红移 并伴随着荧光的 部分淬灭 而这两种离子在荧光分子探针领域中的识别现在还是个难点 说明 它们的结构及对探针影响的方式是相似的 对于化合物 a 来说 一方面 它是 推拉 电子体系 其中 N N 二乙基作为电子给体 香豆素是电子受体 这导 致了整个探针分子具有一定的偶极性质 当化合物 a 未与 Ni2 Co2 络合时 整 个体系具有一定的偶极距 当荧光团被一定波长的光激发后 会进一步增加分 子内从电子给体到电子受体的电荷转移 这时在荧光光谱上表现出一定的最大 发射波长和荧光强度 当受体上杂原子上的孤对电子与 Ni2 Co2 络合上之后 对荧光团的推拉电子体系产生了影响 也就是对分子内从电子给体到电子受体 的电荷转移产生了影响 进而使荧光光谱发生了红移 另一方面 可能由于 Ni2 Co2 的存在 与香豆素荧光团之间还存在着电子和能量的转移 因此使荧 光发生了淬灭 对于 Cu2 使化合物 a 发生的荧光强烈淬灭 因为没有伴随着最大荧光发 射波长的明显移动 有可能是因为金属离子与荧光团之间存在着电子或能量转 移引起荧光团的荧光淬灭 综上所述 化合物 a 对金属离子分别表示出一定的敏感性 但是要成为具 有应用价值的荧光分子传感器 还需要进一步进行修饰 3 23 2 化合物化合物 b b 的光谱解析及对金属离子的识别的光谱解析及对金属离子的识别 3 2 13 2 1 化合物化合物 b b 在不同溶剂中的紫外及荧光光谱在不同溶剂中的紫外及荧光光谱 图 3 4 图 3 5 分别为化合物 b 在不同溶剂中的紫外 可见吸收光谱和荧光光谱 表 3 3 为相应的光谱数据表 400500 0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 Abs Wavelength nm acetonitrile methanol acetone DMSO THF 图 3 4 化合物 b 在不同溶剂中的紫外光谱 sensor 浓度 1 10 5mol L 350400450500550600650 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 IF a u Wavelength nm THF acetone acetonitrile DMSO methaonl 图 3 5 化合物 b 在不同溶剂中的荧光光谱 sensor 浓度 1 10 5mol L 1 激发波长 425nm 表 3 3 化合物 b 在不同溶剂中的光谱数据 溶剂 abs max nm em max nm 105 L mol 1 cm 1 max cm 1 IF DMSO4294820 5462563 14151 984 methanol426478 50 5912575 53109 716 acetonitrile4254790 6042652 59165 533 acetone4234750 5822588 03192 12 THF4214740 5832655 92248 312 由表中数据可知 化合物 b 在不同有机溶剂中的紫外及荧光光谱明显不同 随着溶剂极性的减弱 荧光呈增强趋势 在 THF 溶剂中与在 DMSO 溶剂中相比较 化合物 b 的紫外吸收波长蓝移约 8 nm 荧光光谱变化也比较明显 荧光强度随 溶剂极性减弱呈增强现象 增强 63 4 化合物 b 在甲醇溶剂中较在其它溶剂 中的荧光光谱有淬灭现象 3 2 23 2 2 乙腈中化合物乙腈中化合物 b b 对金属离子的识别对金属离子的识别 图 3 6 图 3 7 分别为化合物 b 在乙腈中对常见的金属离子 Na K Mg2 Ca2 Co2 Zn2 Ni2 Cd2 Cu2 Fe2 Fe3 Cr3 Pb2 H g2 Ag 识别的荧光光谱 表 3 4 为相应的光谱数据表 450500550600 0 100 200 IF a u Wavelength nm Cu2 Hg2 Co2 no cation other cations 图 3 6 乙腈中化合物 b 对不同金属离子响应的荧光光谱 在乙腈中 Tris HCl pH 7 0 7 3 体系中 sensor 浓度 1 10 5mol L 1 加 入 20 倍金属阳离子 激发波长 425nm 表 3 4 乙腈中化合物 b 对不同金属离子识别的光谱数据 em max nm IF a48296 025 a Na 482 584 335 a K 483 586 364 a Ca2 48187 047 a Cd2 48367 895 a Fe3 48467 474 a Hg2 501 5156 949 a Zn2 48457 235 a Cu2 502182 674 a Fe2 484 542 69 a Ni2 48514 138 a Ag 48278 698 a Pb2 487 592 135 a Cr3 482 580 029 a Mg2 48283 756 a Co2 505 547 143 由乙腈中化合物 b 对不同金属离子响应的荧光光谱及表中数据可知 当加 入 Co2 后 最大荧光发射波长红移 23 5 nm 并且荧光淬灭 50 9 加入 Na K Ca2 Cd2 Fe3 Zn2 Fe2 Ni2 Ag Cr3 Mg2 后 最大荧光发 射波长没有明显变化 但荧光有不同程度的淬灭 加入 Cd2 Fe3 Zn2 Fe2 Ni2 Co2 后 荧光淬灭分别为 29 3 29 7 40 4 55 5 85 3 50 9 特别是加入 Ni2 后 荧光淬灭 85 3 而加入 Hg2 Cu2 后 最大荧光发射波长分别红移 19 5 nm 和 20 nm 荧光分别增强为 63 4 倍和 90 2 倍 对于 Hg2 Cu2 使化合物 b 产生的荧光增强 是由于化合物 b 没有与金属离 子络合时 当受到一定波长的光激发时 香豆素将其处于高能级的电子转入激 发态 荧光团因电子激发而空出电子轨道 而此时受体上杂原子上的孤对电子 经由连接臂转入荧光团因电子激发而空出的电子轨道 这样使被激发的电子无 法直接跃迁回原基态轨道 导致荧光团淬灭 因此 化合物 b 在与金属离子络 合之前是处于荧光淬灭状态 当化合物 b 与 Hg2 Cu2 络合后 也就是受体上的 杂原子的孤对电子被 Hg2 Cu2 俘获 这时受体就不能够提供电子转入荧光团因 电子激发而空出的电子轨道 因此被激发的电子又可以直接跃迁回原基态轨道 从而荧光发生增强 对于 Na K Cd2 Fe3 Zn2 Fe2 Ni2 Ag Cr3 Mg2 对化合物 b 最 大发射波长影响及荧光淬灭 一方面 化合物 b 是推拉 电子体系 其中 N N 二乙基作为电子给体 香豆素是电子受体 这导致了整个探针分子具有一 定的偶极性质 当化合物 b 未与金属离子络合时 整个体系具有一定的偶极距 当荧光团被一定波长的光激发后 会进一步增加分子内从电子给体到电子受体 的电荷转移 这时在荧光光谱上表现出一定的最大发射波长和荧光强度 当受 体上杂原子上的孤对电子与这些离子络合上之后 对荧光团的推拉电子体系产 生了影响 也就是对分子内从电子给体到电子受体的电荷转移产生了影响 进 而使荧光光谱发生了变化 另一方面 可能由于这些离子的存在 与香豆素荧 光团之间还存在着电子和能量的转移 因此使荧光发生了淬灭 对于 Cu2 对化合物 b 最大发射波长影响及荧光增强 一方面 化合物 b 是 推拉 电子体系 当受体上杂原子上的孤对电子与 Cu2 络合之后 对香豆素荧 光团的推拉电