植物组织培养技术基础实验.doc

实验一 植物组织培养技术基础实验首先介绍本学期共有5个小实验，分为2大类，三项实验，1类是植物组织培养，另1类是动物细胞培养。第一项实验是植物组织培养，包含3个小实验，即实验一：植物组织培养技术基础实验；实验二：MS培养基的配制与灭菌；实验三：愈伤组织的诱导。在动物细胞培养的实验中包含2个小实验，分别第二项实验，是实验四：动物细胞培养液的配制与灭菌；第三项实验，实验五：动物细胞的组织块培养。提出实验要求，注意实验各项内容的安全，包括实验试剂的使用，实验室的使用，实验仪器的使用，实验动物的处理等。下面开始学习实验一。一、实验目的：了解植物组织培养实验室的设置及基本设备，学习基本仪器设备的使用原理与方法，掌握植物组织培养的一些基本技术。二、实验内容：（一）组培实验室的设置一个标准的组织培养实验室应当包括：准备室、接种室、培养室、驯化室等，准备室又称为化学实验室或通用实验室，可由洗涤室、培养基配制室和灭菌室构成。在实际中可结合可行条件，合并一部分。各分室能满足实验准备（器皿的洗涤与存放、培养基制备和无菌操作、用具的灭菌）、无菌操作和控制培养三项基本工作的需要。1、准备室由洗涤室、培养基配制室和灭菌室构成。（1）洗涤室(cleaning room)用于玻璃器皿和实验用具的洗涤、干燥和贮存；培养材料的预处理与清洗；组培苗的出瓶、清洗与整理等。室内应配备大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运输培养器皿。备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。（2）培养基配制室用于培养基的配制。要求房间宽敞明亮、通风、干燥、清洁卫生，便于多人同时操作；有电源、自来水和水槽（池），保证上下水道畅通。有时可将配制室内部间隔为称量分室和配制分室。规模较小时，配制室可与洗涤室合并为准备室。仪器与用具配置：电子分析天平、托盘天平、磁力搅拌器、蒸馏水器、酸度计、恒温水浴锅、电炉（或微波炉、电饭煲、液化气炉灶等）、冰箱等仪器设备；移液管（或微量移液器）、移液管架、培养瓶（包括试管）、棕色或透明试剂瓶、烧杯（带或不带刻度）、量筒、容量瓶、培养皿、吸管、打孔器、玻璃棒、标签纸、记号笔、耐高温高压塑料薄膜等封口材料、周转筐、尼龙绳、脱脂棉、纱布、工作台、蒸馏水桶、医用小推车等用品和用具。此外，配备器械柜和药品柜，分别存放接种用具和分类存放化学试剂（可改为药品）。最好配备防尘设备，以减少灰尘污染。（3）灭菌室用于培养基、器皿、工具和其他物品的消毒灭菌。要求安全、通风、明亮；墙壁和地面防潮、耐高温；配备水源、水槽（池）、电源或煤气加热装置和供排水设施；保证上下水道畅通，通风措施良好。生产规模较小时，可与洗涤室、配制室合并在一起，但灭菌锅的摆放位置要远离天平和冰箱，而且必须设置换气窗或换气扇，以利通风换气。仪器与用具配置：高压灭菌锅、干热消毒柜或烘箱、细菌过滤装置、工作台、培养基存放架或橱柜、周转筐、换气扇、医用小推车等。2、无菌操作室（transfering room）进行植物材料的接种、培养物的转移等无菌操作，因此接种室也称为无菌操作室。其无菌条件的好坏对组织培养的成功与否起着重要作用。在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般78m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置推拉门，以减少开关门时的空气扰动。接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。仪器与用具配置：超净工作台、空调机、解剖镜、接种器具消毒器(或高温焚化炉)、紫外光灯、酒精灯、广口瓶、三角瓶、搪瓷盘、接种工具、手持喷雾器、工作台、搁架、接种用的小平车、不锈钢长方形饭盒(盛放7075%酒精，用于浸泡接种工具)或医院用消毒盒等。配置污物桶，以便存放接种过程中的丢弃物，须每天清洗更换。进入无菌室前，为了防止带菌空气直接进入接种室和工作人员进出接种室时带进杂菌，接种人员在缓冲间更衣、换鞋、洗手、戴上口罩后，才能进入接种室。应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。3、培养室（culturing room） 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般 设5、6层，最低一层离地高约l0-20cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。培养室最重要的因子是温度，一般保持在2027左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在7080为好，可安装加湿器。控制日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照1016h也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。4、驯化室驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。（二）组培实验室常用仪器设备1、常用仪器设备（1）超净台最常用最普及的无菌操作装置,主要通过风机,送入的空气经过细菌过滤装置,再流过工作台面.因此,超净工作台应放置在空气干净,地面无灰尘的地方,以延长使用期.使用过久,引起堵塞,需要清洗和更换过滤器。本实验室配置的是：苏州净化设备有限公司VS-1300L双人单面净化工作台（2）高压灭菌锅是最基本的设备，用于培养基.器械等的灭菌。本实验室配置的是：上海申安LDZX-4立式自动电热压力蒸汽灭菌锅（3）空调机保证室内温度，一般为252，应安置在室内较高的位置。以便于排热散凉。本实验室配置的是：上海日立家用电器公司KFR-72QW/G3日立空调机（4）光照培养箱用于植物材料的特定培养，可以控制温度、湿度及光照等。本实验室配置的是：常州国华电器有限公司250-D光照培养箱（5）烘箱洗净后的玻璃器皿，如需迅速干燥，可放在烘箱内烘干，温度以80-100为宜若需干热灭菌，温度升高至150-160 ,持续1-3小时即可本实验室配置的是：上海森信实验仪器有限公司DGG-9620A电热鼓风干燥箱（6）冰箱某些试剂药品和母液需低温保存，有些材料需低温处理，需要使用冰箱本实验室配置的是：青岛海尔股份有限公司BCD-219BSV海尔冰箱（7）电子分析天平和托盘天平电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维生素、激素等微量药品精确度为0.0001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和琼脂等，其精确度为0.1g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。本实验室配置的是：上海精密科学仪器有限公司2104N电子天平（8）显微镜及解剖镜，种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜在分离茎尖等较小组织时，便于观察、操作，通常放大5-80倍。放大40倍以上操作需要有相当熟练的技术和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。解剖镜上带有照相装置，根据需要随时对所需材料进行摄影记录。（9）摇床与转床用于改善液体培养材料的通气状况及促进酶解原生质体的解离。一般在液体培养中转速为每分钟100次左右，在解离原生质体时为每分钟80左右。（10）磁力搅拌器磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。本实验室配置的是：常州国华电器有限公司88-1或79-2磁力搅拌器（11）培养架进行固体培养和试管苗大量繁殖时,需要有放置培养瓶的培养架。本实验室配置的是：济南普朗特科技有限公司高效节能培养架（12）酸度计组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也可使用pH试纸进行粗测。本实验室配置的是：上海世仪精密仪器有限公司FSH-3C酸度计（13）离心机用于收集原生质体，转速要求较低。一般为10004000rpm即可。（三）必要的器皿1、玻璃器皿长时间培养和贮存药液用的玻璃器皿，要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，而且能够耐高压灭菌。（1）培养器皿装入培养基进行植物材料的培养，根据培养目的和要求不同，可以采用不同种类和规格的玻璃器皿。试管、三角瓶（或锥形瓶）、培养皿。通常以纱布包被棉花塞，外面再包一层牛皮纸，用线绳或橡皮筋扎好。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。以达到防止培养基干燥和杜绝污染的目的。目前，培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点，如培养容器多为平底方盒形，可提高培养空间利用率的植株数，并能一层层地叠摞起来，从而节约空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高温，可进行高压灭菌。有些产品为一次性消耗品，不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提高效率。一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时比较方便。（2）盛装器皿配制培养基时，各种药品的溶解，储备均需要各种规格的烧杯、试剂瓶等。大烧杯用于培养基的熔化，成本高，易破，可以用搪瓷盆代替。2计量器皿母液的配制、药液的分装、吸取需要玻璃计量器皿，如10ml、25 ml、50 ml、100 ml、200 ml、500 ml、1000 ml的量筒，25 ml、50 ml、100 ml、200 ml、500 ml、1000 ml、2000 ml的容量瓶，以及0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1 ml、2 ml 、5 ml的移液管，用于配制培养基时吸取不同种类的母液。应多准备几支，分开使用。3.其他器皿：如滴瓶、称量瓶、玻璃棒、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿应具备。2、金属器械组织培养常用的金属器械，可选用医疗器械或微生物实验所用的器械。（1）镊子类常应用医疗上的镊子。根据操作需要有各种类型，若用l00ml的三角瓶作为培养瓶，可用20em长的镊子。镊子过短容易使手接触瓶口，造成污染。镊子太长，使用起来不灵活。（2）剪刀类可采用医疗五官科用的中型剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。也可以用弯形剪刀，由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪切。（3）解剖刀切割较小材料和分离茎尖分生组织时，可用解剖刀。刀片要经常调换，使之保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养效果。（4）接种针用来转移细胞和愈伤组织。（四）实验用具的洗涤和灭菌1、器皿的清洗植物组织培养最重要的，也是最基本的要求，就是各项操作都应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养过程中最经常、最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其它常用器皿。在清洗器皿处应有较大的水池，水池应用水泥制作，白瓷砖砌内外表面，池底另放一张橡胶垫，以减少器皿破损。自来水龙头宜采用三孔鹅颈式的，用水方便，并在需要时可加装抽滤器。下水道应畅通，以免妨碍工作。除水池外，还需辅助以若干盆与桶。最常用的洗涤助剂就是家庭用的洗衣粉及肥皂两种，备一点去污粉也有些用处。如果冷的洗衣粉水效力欠佳，可以增加浓度或适当加热。这已可以处理许多清洗中的问题。没必要使用铬酸-硫酸洗液，因为使用这种洗液要十分小心，而且效率也不高。洗瓶时先将瓶子在清水中泡一会儿，然后在水龙头下涮去瓶内污物，沥干水，泡入浓洗衣粉水中，再用瓶刷沿瓶壁上下刷动和呈圆周旋转两个方向刷洗。瓶外也要刷到，不要留下未刷到之处。刷后放到水龙头下用流水冲刷4次，以彻底冲去洗衣粉残留物。洗好的瓶子应透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠，即表示无污迹存在。通常无须乎再用蒸馏水涮一遍，直接置于搁架上沥晾水汽。也可制作晾洗架，瓶子倒放在孔格中或挂在小木棍上，这样洗后要摆一遍瓶子，用时再收一次瓶子。急等使用的瓶子可以用烘箱烘干。烘时缓慢升温，温度也无须太高。新买进的瓶子亦可按上述方法处理。移液管之类的仪器，可用橡皮吸球(洗耳球)和热洗衣粉水吸洗，再放水龙头下流水冲净，垂直放置晾干。带刻度的计量仪器不宜烘烤，以免玻璃变形，影响计量的准确度。如洗后急等使用，只要用要吸量的液体吸弃数次，或用95%酒精吸弃数次后，即可使用。2、灭菌（1）器皿和用具常用灭菌方法：1.热压灭菌法（学习操作）将洗净的培养器皿，用具，用牛皮纸包好，放入高压消毒锅中，1.1压力下灭菌2030分钟。2.干热灭菌法洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中，15040分钟或120两小时，待冷却后使用。（二）无菌室灭菌（接种室、培养室）1、用新洁尔灭擦抺工作台，70%酒精擦拭超净工作台。2、薰蒸（学习操作）用甲醛、高锰酸钾提前13天薰蒸密封房间方法1：甲醛倒入蒸发皿加热，用量10ml/m2。方法2：甲醛（HCHO）与高锰酸钾（KMn4）以10：1比例混合。3、接种前用7075%酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。4、用紫外光灯进行照射灭菌（波长26502660A最好）接种箱及用具3040分钟。（三）培养基灭菌（略）（四）培养材料灭菌（略）（五）工作人员无菌操作（略）三、作业1、参观我系组培实验室，分组讨论，提出问题及改进意见。2、每人刷洗三个组培瓶和两套培养皿，为后续实验做准备。实验二 MS培养基的配制与灭菌一、实验目的：通过MS培养基各种母液的配制和保存，掌握植物组织细胞培养时配制与保存各种培养基母液的方法。二、实验内容：MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。可分为大量元素母液、微量元素母液、有机物质母液（维生素、氨基酸等）、铁盐母液和激素类母液五种。配制母液有2点好处：一是可减少每次配制称量药品的麻烦，二是减少极微量药品在每次称量时造成的误差。这样每次使用时，取其总量的1/20（50 mL）或1/200（5 mL），加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。（一）MS基本培养基配方 成分 分子量 使用浓度 (mg/L) 大量元素 硝酸钾 KNO3 101.11 1900 硝酸铵 NH4NO3 80.04 1650 磷酸二氢钾 KH2PO4 136.09 170 硫酸镁 MgSO4.7H2O 246.47 370 氯化钙 CaCl2.2H2O 147.02 440 微量元素 碘化钾 KI 166.01 0.83 硼酸 H3BO3 61.83 6.2 硫酸锰 MnSO4.4H2O 223.01 22.3 硫酸锌 ZnSO4.7 H2O 287.54 8.6 钼酸钠 Na2MoO4.2 H2O 241.95 0.25 硫酸铜 CuSO4.5 H2O 249.68 0.025 氯化钴 CoCl2.62 237.93 0.025 铁盐 乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA 372.25 37.3 硫酸亚铁 FeSO24.7H2O 278.03 27.8 有机成分 肌醇 100 甘氨酸 2 盐酸硫胺素 VB1 0.1 盐酸吡哆醇 VB6 0.5 烟酸 VB5 或 VPP 0.5 蔗糖 sucrose 342.31 30g /L 琼脂 agar 7 g /L （二）配制方法1、大量元素(母液) mgL （指浓度大于0.5mmolL的元素，N、P、K、Ca、S、Mg。配时要注意以下几点：a.各化合物必须充分溶解后才能混合。b.混合时注意先后顺序，特别要将钙离子与硫酸根离子，磷酸根离子错开，以免产生硫酸钙、磷酸钙等不溶性化合物沉淀，钙离子最后加入。c.混合时要慢，边搅拌边混合。）NH4NO3 33 000 KNO3 38 000 CaCl22H2O 8 800 MgSO47H2O 7 400KH2PO4 3 4002、微量元素(母液) （指小于0.5mmolL的元素即含除Fe以外的B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等盐类的混合溶液。配时也要注意顺次溶解后再混合，以免沉淀。硫酸根可用一个烧杯。）KI 166 H3BO3 1 240 MnSO44H2O 4 460ZnSO47H2O 1 720Na2MoO42H2O 50CuSO45H2O 5CoCl26H2O 5 3、铁盐(母液) （铁盐必须单独配制：将称好的FeSO47H2O和Na2-EDTA2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，混合时可置于加热搅拌器上不断搅拌混合直至溶液呈金黄色（约20-30分钟），将pH调至5.5，最后定容到1 L，室温放置冷却后，保存在棕色玻璃瓶中。注意：如果加热搅拌时间过短，会造成螯合不彻底，放置冰箱冷藏后FeSO4易结晶析出。）FeSO47H2O 5 560 Na2-EDTA2H2O 7 460 4、有机成分(母液) （易配，依次加入即可。）A 肌醇 20 000 B烟酸 100 盐酸吡哆醇(维生素B6) 100 盐酸硫胺素(维生素B1) 100 甘氨酸 400 以上各种营养成分的用量，除了母液为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。 上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。其中，母液、母液及母液的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。5、激素MS培养基中还需要加入吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、6-苄基嘌呤（6BA）等植物生长调节物质，并且分别配成母液（1 mg/mL）。其配制方法是：分别称取这3种物质各50 mg，将IBA用少量（1 mL）95%乙醇预溶，用蒸馏水定容至50ml；将6BA用少量（1 mL）1 mol/L的HCL溶液溶解（不好融，约30分钟），用蒸馏水定容至50ml；NAA用少量（1 mL）1 mol/L的NaOH溶液溶解，用蒸馏水定容至50ml。消毒剂：0.1%HgCl2。（三）母液的保存1、装瓶将配制好的各母液分别倒入瓶中，贴上标签，注明母液号、配制倍数、配制日期等。2、储藏：将各母液瓶放入冰箱内低温保藏。（四）培养基的配制1、配制培养液用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液为50 mL，母液、A和B各5 mL。再取6BA2 mL，NAA1 ml与各种母液一起放入烧杯中。配制培养液时应注意：在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。2溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂7 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。3调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸（5.47.0）测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止（培养基的pH必须严格控制在5.8）。4、分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 mL或100 mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/51/4。每1 000 mL培养基，可分装2530瓶。培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。用2块硫酸纸(每块大小约为9 cm9 cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。（五）培养基的灭菌培养基分装完成后，应在24h内灭菌。灭菌过程如下：（1）加水；（2）装锅；（3）盖盖；（4）加热；（5）排放冷空气；（6）升压保温；（7）降压排气；（8）出锅冷却。三、作业1、分组配制培养基。2、灭菌时注意将培养基、无菌水、实验用的器材都灭菌四、注意事项1、在1套培养皿里加上滤纸，以吸干植物材料的水分。2、用专用于组培的镊子、解剖刀。实验三 愈伤组织的诱导一、实验目的：掌握植物组织培养时外植体无菌体系建立的方法。二、实验内容：1、外植体预处理：剪取三叶草的幼嫩茎段23cm，去掉外面的老叶，在自来水下流水清洗10分钟；2、外植体的消毒在：超净台上，用70%酒精浸泡30S，用0.1%升汞浸泡5min左右，最后用无菌水清洗35次，吸干水分后备用；3、外植体的接种：将材料置于无菌培养皿内，用经过灭菌的解剖刀切取1cm左右带有一个腋芽的茎段，打开培养瓶盖子用经过灭菌的镊子将外植体置于培养容器内，接种到培养基上。接种时动作尽量要快，应使形态学上端向上，防止倒置。然后盖上盖子并拧紧(或塞上塞子)写上接种日期和学生姓名即转入培养室内培养，室内温度25，光强为2000LUX,每天光照约14小时。三、作业：观察并记录现象。实验四 动物细胞培养液的配制与灭菌一、 实验目的：掌握动物细胞培养的方法，二、 实验内容：（一）细胞培养室的设置和无菌操作细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。培养室内要完全密闭，保持恒定稳定，在设计上要：培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直射，防止室内温度增高。天花板高度不超过2米，保证紫外灯有效杀菌。常用拉门，以防止空气流动。天花板、地板、墙壁光滑无死角，可镶瓷砖或涂油漆，不易在墙角堆灰尘。（二）设备双蒸水蒸馏器，酸缸，干燥箱，高压锅，储藏柜，天平，pH计，磁力搅拌器，超净工作台，冰箱，CO2培养箱，离心机，CO2钢瓶，液氮罐，紫外灯，倒置显微镜（三）仪器0.22微米微孔滤膜，75%乙醇，0.1%新洁尔灭。(四)清洗（1）玻璃器皿的清洗步骤：按浸泡刷洗浸酸冲洗等四步程序进行。浸泡：新购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、碑等有害物质，故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%5%盐酸浸泡过夜或煮沸30min，水洗。要领：培养用后的玻璃器皿要立即泡入清水中，使下道刷洗工作能顺利进行。用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。要领：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂去器皿上的杂质、刷洗次太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。禁止用去污粉。因其中含有砂粒。会严重破坏玻璃器皿的光洁度。特别注意刷洗瓶角部位。酸浸之前要把洗涤剂冲干净。浸酸：将器皿浸泡于清洁液24h，如急用也不得少于4h。清洁液由重铬酸钾、浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的末刷洗掉的微量杂质可被完全清除。冲洗：先用自来水充分冲洗，吸管等冲流10min，瓶皿需每瓶灌满、倒掉，反复10次以上。然后再经蒸馏水漂洗3次,不留死角。晾干或烘干备用。对已用过的器皿，凡污染者必先经煮沸30min或放3%盐酸中浸泡过夜，未污染者可不需灭菌处理，但仍要刷洗、清洁液浸酸过夜，冲洗等。（2）塑料器皿清洗自来水充分浸泡冲洗2%NaOH浸泡过夜自来水冲洗2%5%盐酸浸泡30min自来水冲洗蒸馏水漂洗3次晾干紫外线照射30min(或先用75%酒精浸泡、擦拭，再用紫外线照射30min)。凡能耐热的塑料器皿，最好经101.3kPa(121.3)高压灭菌。（3）胶塞等橡胶类处理新购置者先经自来水冲洗2%NaOH煮沸15min自来水冲洗2%5%HCl煮沸15min自来水冲洗5次以上蒸馏水冲洗5次以上蒸馏水煮沸10min，倒掉沸水让余热烘干瓶塞等。或蒸馏水冲洗晾干，整齐摆放于小型金属盒内经101.3kPa高压灭菌。（4）金属器械的清洗新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用过的金属器械应先以清水煮沸消毒，再擦拭干净。使用前以蒸馏水煮沸10min，或包装好以101.3kPa高压15min。（5）除菌滤器的处理用过的滤器将滤膜去除，用三蒸水充分洗净残余液体，置干燥箱中烘干备用。2包装包装的目的是防止消毒灭菌后再次遭受污染，所以经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再行消毒灭菌处理。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。包装分为局部包装和全包装两类，前者用于较大瓶皿，一般用硫酸纸和牛皮纸将瓶口包扎好；后者适于较小培养瓶皿、吸管、注射器、金属器械和胶塞等，以下为常用瓶皿、吸管、无菌衣帽等的包装方法，其它物品可参照处理。瓶类：硫酸纸罩以瓶口,外罩二层牛皮纸用绳扎紧。小瓶皿、胶塞、刀剪等器械可装人饭盒，饭盒再以牛皮纸包好，绳扎好。吸管、滴管口用脱脂棉塞上(不要太紧或太松)装人消毒筒内，滤器、滤瓶、橡皮管等都要用牛皮纸包好瓶口等，外罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。无菌衣、帽、口罩，均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。3消毒灭菌严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的，其方法分为物理法和化学法两类。前者包括干热、湿热、滤过、紫外线及射线等，后者主要指使用化学消毒剂等。热灭菌：玻璃器皿，160170，90120min或1804560min。蒸气灭菌：用于玻璃器皿、滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品其有效灭菌压力和时间不同，如培养用液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa(115)高压灭菌10min；布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa(121.3)高压灭菌1520min。滤过除菌：适于含有不耐热成分的培养基和试剂的除菌，用孔径为0.22m微孔滤膜可除去细菌和霉菌等，用此滤膜过滤两次，可使支原体达到某种程度的去除，但不能除去病毒。紫外线：紫外线的波长为200300nm，最强是在254 nm，615平方米最少一只紫外灯，高度要在2.5m以下，湿度45%60%，杆菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，实验前应不低于30分钟的照射时间。熏蒸消毒：当遇有细胞培养出现多次污染，或实验室两个月一次的常规消毒，均可用高锰酸钾5-7.5g，加甲醛（40%）10-15ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24h，至少4h以上。煮沸消毒：紧密情况时使用，金属器械和胶蹇在水中煮2030分钟，趁热倾去水分即可使用。化学消毒：化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制进行消毒灭菌的方法。实验室桌面、用具及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒杀菌。常用的有：2%煤酚皂溶液（来苏尔）、0.25%新洁尔灭、1%升汞、35%甲醛溶液、75%酒精。(五) 配置培养液组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其它辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清（10%）。 1仪器：蠕动泵1套，滤器1套，蒸馏器，高压蒸汽灭菌锅，磁力搅拌器，pH计。 2材料：500mL、250mL盐水瓶，250mL或500mL培养液瓶，0.22mm的微孔滤膜。 3试剂：双蒸水，小牛血清，合成培养基（DMEM），NaHCO3。（1）操作1过滤器的准备和安装清洗好过滤器，干燥，放入一张0.22mm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20min进行高压蒸汽灭菌处理。在超净工作台内安装好过滤装置，准备过滤。2合成培养基的配制将干粉型培养基溶于总量1/3的三蒸水中，再用1/3水冲洗包装内面两次，倒入培养液中，以保证所有干粉都溶解成培养液。搅拌使其溶解。将干粉溶于450毫升水中，充分搅拌使其溶解，用水冲洗包装内面，确保干粉都溶解成培养液。根据产品说明的要求和实验补加3.7g NaHCO3。加抗生素：最终浓度青霉素为100U/ml，链霉素100g/ml。一般市售青霉素为80万U/瓶，将其溶解在4ml体积内，每1000ml培养液中加0.5ml，即成最终浓度为100U/ml。市售链霉素为100万U/瓶，将其溶解5ml体积内，也是每1000ml加0.5ml，使其最终浓度为100g/ml。调节培养液的pH值为7.27.4。1000毫升容量瓶定容。过滤法除菌。分装于玻璃瓶中，4冰箱保存备用。使用时加血清。 3小牛血清的处理市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体。 将血清放入56水浴中30min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。 4生长培养基的配制除无清培养之外，各种合成培养基在使用前需要加入一定量的小牛血清（约10%）。5Hanks液称取Hanks液试剂：Nacl 8.00g ，Kcl 0.40g ，Cacl20.14g，NaHCO30.35g，KH2PO40.06g，MgSO47H2O 0.20g，Na2HPO42H2O 0.06g，葡萄糖1.00g，0.1%酚红1ml。配置Hanks液时，需将Cacl2另溶于100ml的蒸馏水中，溶解后再加入Cacl2溶液。依次加入上述试剂至700ml蒸馏水中，溶解后再加入CaCl2溶液。用NaHCO3调节pH至7.07.2，三蒸水定容至1000mL。121，30min高压灭菌后于4保存。也可以按上述方法配制成10倍浓度的母液，4保存，使用时按倍数稀释成工作液。6 DMEM培养液在室温下（2030）用700ml三蒸水溶解培养基干粉，轻轻搅拌，不要加热。三蒸水冲洗包装袋的内部，转移全部的痕迹干粉到容器内。加2.0gNaHCO3到培养液中，加入青霉素与链霉素双抗。通过缓慢搅拌加入1mol/LNaOH或1mol/L HCl调节pH（7.07.2），由于pH在抽滤时会上升0.10.3，因而调节pH至7.07.1最佳。用三蒸水定容后，搅拌溶解，注意不要过分搅拌。于4静置完全溶解后，在超净台内抽滤分装，短期使用保存在28，若超过15d应保存于-20。使用前按比例加入血清（10%20%）。（六）灭菌1、配置好的Hanks液需要121度灭菌30min2、试验用的工具（镊子、解剖刀、手术剪、直剪）、培养皿每人2套、青霉素小瓶，其中1组青霉素小瓶中加装滤纸片，吸管、过滤器放入滤膜用布包好，灭菌3、试剂瓶（2）注意事项1培养液配好后，要先抽取少许放入培养瓶内在37温箱内置2448h，以检测培养液是否有污染。然后再用于实验。2配制培养液所需血清的质量要合格并保持稳定。一个批号试用效果良好后，就可一次购入较多同一批号的血清，这样实验条件稳定，配液时调整pH值较易。3每次配液量以使用两周左右的量为宜。一次配液不要太多，一是营养成分有损失，二是容易污染。实验五 动物细胞的组织块培养一、实验目的掌握动物细胞培养方法二、实验原理组织块培养是常用的、简便并且成功率较高的原代培养方法，即将组织剪切成小块后，直接接种于培养瓶。培养瓶可根据不同细胞生长的需要作相应处理。例如为了利于上皮样细胞等细胞的生长，可以在生长面预先涂上胶原薄层。如果原代细胞准备做组织染色以及电镜等进一步检查，可在原代培养之前先在培养瓶内放置清洗干净的盖玻片。并在放入组织块前预先用1-2滴培养液湿润瓶底，使盖玻片固定在瓶底。组织块培养法操作简单，部分种类的组织细胞在小块贴壁培养24h后，就有细胞从组织块四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中组织块的损伤，并不是每个组织块都能长出细胞，只适合于组织量少的原代培养，如牙髓细胞培养等。三