动脉粥样硬化斑块的声动力治疗.doc

动脉粥样硬化斑块的声动力治疗动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）导致的急性血管事件是心脑血管疾病致死致残的主要原因。AS是一种炎症性疾病，而目前尚缺乏针对AS炎症机理的有效治疗措施。声动力治疗（Sonodynamic therapy, SDT）是利用超声的物理能量激活特定药物（声敏剂）发生化学反应，产生活性氧，从而发挥生物学效应的一种无创治疗技术。我们首次将其应用于AS斑块的治疗，探讨了5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）作为声敏剂介导的SDT对AS斑块的治疗作用。1、 声动力治疗动脉粥样硬化斑块的疗效1.1 声动力治疗减小动脉粥样硬化斑块病理结果显示，ALA-SDT抑制兔股动脉AS斑块的进展，这在apoE-/-小鼠主动脉AS斑块模型中也被证实，而利用高频超声实时监测兔股动脉狭窄率，证实ALA-SDT治疗后1及4周动脉狭窄率明显下降，表明ALA-SDT可减小AS斑块。而在治疗后8周，动脉狭窄率发生反弹，可能由于兔子血中胆固醇水平仍处于较高的水平，导致斑块继续进展，因此，在临床应用ALA-SDT治疗AS斑块时，需配合使用降脂药物。值得注意的是，在对兔子进行二次ALA-SDT 治疗后1周及4周，动脉狭窄率仍然减小，表明ALA-SDT可进行重复治疗，且不影响治疗效果。1.2 声动力治疗稳定动脉粥样硬化斑块临床中，引起急性血管事件主要原因是AS易损斑块的破裂形成血栓阻塞血管。有学者提出通过计算AS斑块易损系数来评价AS斑块的稳定性，其公式为 (巨噬细胞+脂质含量)/(平滑肌细胞+胶原含量)。ALA-SDT治疗兔股动脉AS斑块后1周及4周，斑块中巨噬细胞及脂质含量明显降低，平滑肌细胞及胶原含量明显，表明ALA-SDT通过改变斑块成分使斑块趋于稳定，与之相符，通过药物诱导斑块破裂证实ALA-SDT治疗可减小斑块破裂及血栓形成的发生率，为ALA-SDT稳定AS斑块提供了更为直接的证据。在ALA-SDT治疗后8周及12周，同样观察到巨噬细胞含量的减小及平滑肌细胞和胶原含量的增加，ALA-SDT稳定斑块的长期效果得到证实。2、 声动力治疗动脉粥样硬化斑块的机理2.1 5-氨基酮戊酸来源的原卟啉IX选择性的聚集在斑块巨噬细胞的线粒体已有研究显示，给予肿瘤动物ALA，经代谢后其产生的代谢产物原卟啉IX（Protoporphyrin IX, PpIX）可选择性的聚集在肿瘤细胞中，这是因为肿瘤细胞缺乏将PpIX转化为血红素的亚铁螯合酶。因此，将ALA作为临床诊断、手术术区评估及光声动力治疗的靶向药物。我们在动物模型中证实，静脉注射ALA 2小时后，PpIX选择性的在兔颈动脉AS斑块中聚集，其浓度为周围正常血管组织的12倍。巨噬细胞免疫荧光染色显示，ALA-PpIX阳性区域与巨噬细胞表达阳性区域吻合，表明ALA-PpIX主要聚集在AS斑块的巨噬细胞中。ALA在细胞线粒体中转化为PpIX，体外实验证实，PpIX在巨噬细胞中主要蓄积在线粒体中。2.2 声动力治疗促进动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞凋亡及清除ALA-SDT诱导AS斑块巨噬细胞经线粒体-caspase途径的凋亡。这与ALA-PpIX聚集在细胞线粒体有关。巨噬细胞作为主要的固有免疫细胞，在AS斑块形成、发展、不稳定及斑块破裂过程中均发挥关键作用。已有研究证实，一些试剂如氯膦酸盐、二氧化硅、一氧化氮、mTOR抑制剂、蛋白质合成抑制剂和他汀类药物，以及光动力治疗（Photodynamic therapy, PDT）等，可选择性的清除AS斑块中巨噬细胞，从而有效的抑制斑块进展并促进其稳定。本研究在兔及小鼠两种AS斑块模型中，均证实ALA-SDT可明显的减少斑块中的巨噬细胞含量，且在治疗后3天即有明显的改变。这与之前MV0611介导PDT治疗AS斑块的结果相符，而MV0611介导PDT还会引起平滑肌细胞的减少，这是由于MV0611广泛分布在斑块各种细胞中。由于ALA-PpIX更多的聚集在斑块巨噬细胞，ALA-SDT可清除巨噬细胞而对平滑肌细胞及内皮细胞无明显影响，选择性的巨噬细胞清除作用，使得ALA-SDT更为的有效及安全。大多数清除巨噬细胞的治疗方法，如氯膦酸盐、二氧化硅、一氧化氮、mTOR抑制剂等，会引起血液中单核细胞减小从而影响机体免疫功能的副作用。如何选择性的清除斑块中单核细胞而不影响血液单核细胞，是学者们关注的焦点。最近的研究取得了一些进展，如通过药物涂层支架局部释放药物达到清除巨噬细胞而不影响血液单核细胞作用，然而支架植入同样也带来了在狭窄、晚期血栓形成等副作用。ALA-SDT清除斑块巨噬细胞而不影响血液中的单核细胞，这主要是由于ALA-SDT的靶向给药及局部治疗的特性，使得血液中的单核细胞未受治疗的影响。因此，ALA-SDT通过选择性清除AS斑块中巨噬细胞，抑制斑块进展及促进其稳定。2.3 声动力治疗促进动脉粥样硬化斑块炎症消退炎症消退过程包括炎症细胞凋亡及其被吞噬细胞清除。在AS进展期斑块，凋亡细胞清除功能障碍，斑块内的凋亡细胞不能被及时的清除，发生继发坏死，释放大量的炎症细胞及细胞内容物，引起剧烈的炎症反应，使得斑块炎症环境进一步恶化，从而导致斑块进展及不稳定，最终斑块破裂发生急性血管事件。目前的研究对于导致进展期斑块细胞凋亡清除功能障碍的原因有很多解释，如生长因子缺失、毒性细胞因子及氧化脂蛋白作用等。越来越多的证据显示，内质网应激在其中发挥关键作用。在AS斑块中，内质网应激可由多种原因引起，如氧化低密度脂蛋白、缺氧、钙离子平衡失调、自由基等。这些刺激引起从内质网到胞浆和胞核的信号传导 ，最终导致对存活的适应或凋亡。内质网应激通过激活非折叠蛋白反应途径，使得促凋亡蛋白CEBP-homologous protein（CHOP）表达增加，CHOP的表达促进内质网释放钙离子（Ca2+），从而导致细胞凋亡。研究表明，在内质网应激诱导细胞凋亡的过程中，激活一些炎症通路，导致促炎因子如IL-6及TNF-a等大量释放。这些促炎因子可抑制斑块内有效吞噬，并抑制有效吞噬相关的抗议因子释放，从而导致斑块炎症环境恶化，进一步抑制有效吞噬，使得斑块进入恶性循环，最终导致斑块破裂。ALA-SDT诱导AS斑块巨噬细胞经线粒体-caspase途径的凋亡。该细胞凋亡途径与内质网应激凋亡途径不同。本研究体外证实，ALA-SDT作用于THP-1巨噬细胞可抑制其促炎因子IL-6及TNF-a的表达，其机制可能是ALA-SDT抑制炎症因子表达通路，这需要在下一步的研究中证实。已有研究报道，caspase的激活可促进凋亡细胞释放“find-me”信号，如磷脂、ATP等，趋化吞噬细胞，从而促进有效吞噬。这在本研究中也得到证实，ALA-SDT诱导的巨噬细胞凋亡通过caspase依赖的ATP释放，促进单核细胞趋化及凋亡细胞的清除，增加斑块炎症消退，最终改善斑块炎症环境。3、声动力治疗安全性ALA-SDT具有较高的安全性。首先，ALA-SDT中使用的1 MHz超声为低频超声，对人体组织的损伤较小；且使用的超声强度不超过2 W/cm2，为超声理疗仪物理治疗的强度范围已在临床证实对组织无明显损伤；在治疗过程中，通过检测温度变化发现1.5 W/cm2超声作用20分钟，组织温度不超过40，不会引起组织损伤；其次，ALA-SDT中使用的ALA已被临床应用于肿瘤的诊断，所用剂量已通过临床检验证实了其安全性。由于声动力治疗为无创治疗手段，且针对局部进行干预，所以其可能的副作用为治疗部位皮肤肌肉的损伤、血液细胞减少及其对斑块本身的影响。为验证其安全性，我们进行了相关动物实验。结果表明，ALA-SDT对兔血液细胞无明显影响，SDT通过超声激活声敏剂发挥生物学效应，虽然血液细胞中有大量的ALA-PpIX，由于血液流速较快，血液细胞接受超声能量的时间很短，因此不能激活ALA-PpIX发挥作用。ALA-SDT引起一过性的肌酶的升高，表明ALA-SDT对治疗部位肌肉有一定的损伤，但病理检测表明肌肉无病理性改变，这可能得益于肌肉组织较强的修复能力。4、声动力治疗动脉粥样硬化斑块的展望ALA-SDT可能是一种有效治疗临床AS病人的新方法。超声能够很容易实现移动，而且可在一次给药后同时使用多个超声探头治疗，因此ALA-SDT能够治疗这些复杂病变。由于1 MHz超声具有很强的穿透性，ALA-SDT能在体表完成治疗，实现无创治疗。从安全角度来说，ALA-SDT能避免有创治疗的典型副作用，如手术创伤、延期愈合及再内皮化障碍等，ALA-SDT为不能耐受手术治疗的年老体弱患者提供另一种安全的治疗选择。ALA-SDT能在很短的时间（1周内）里减小及稳定AS斑块，因此ALA-SDT适合用于临床AS斑块的急性治疗。同时，目前临床有创治疗方法都难以进行重复治疗，由于机体缺乏清除1O2的自然机制，不会对ALA-SDT治疗耐受，因而ALA-SDT可进行重复治疗而不会影响其疗效，且也能很好的与其他治疗方法联合使用。综上所述，ALA-SDT作为一种无创治疗手段，能针对AS斑块炎症机理，有效的减小及稳定AS斑块，而不