GUS染色整理版.doc

此文档收集于网络，如有侵权，请 联系网站删除1GUS报告基因的定性检测GUS（- 葡萄糖苷酸酶）能与显色底物X-gluc 反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。GUS 染色的稳定性好，组织定位精确，成为在植物中运用很广的报道基因。gus基因是目前常用的一种报告基因，是D 葡萄糖苷酸酶(gus)基因，其表达产物-葡萄糖苷酸酶 (GUS)能催化裂解一系列的葡萄糖苷酸 ，它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖苷酸酯（XGluc）分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。 其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。1.1 GUS染色底物的配制试剂名称母液浓度母液配制方法工作液浓度工作液配制方法磷酸缓冲液（pH 7.2）0.5M将0.5M Na2HPO4和0.5M NaH2PO4混合*50mM1 mlTriton X-10010%取10ml Triton X-100溶于水，定容至100ml。0.1%0.1 ml铁氰化钾K3Fe(CN)6100mM将3.2924g铁氰化钾溶于水，定容至100ml。2 mM0.2 ml亚铁氰化钾K4Fe(CN)63 H2O100mM将4.2239g亚铁氰化钾溶于水，定容至100ml。2 mM0.2 mlEDTA0.5M将18.61gNa2EDTA2H20溶于水，调pH为8.0，定容至100ml水。10 mM0.2 mlX-Gluc/2 mM10.4mgddH2O/定容至10ml* 0.5M Na2HPO4配制方法：将17.907g Na2HPO4溶于水，定容至100ml。0.5M NaH2PO4的配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml。实验步骤：1. 将准备好的拟南芥植株放入小EP管中，加入染色液浸没试材，封好盖子；可用抽真空，5min，200mbr。2. 37培养箱中温育12h，或有蓝色出现，水中洗涤一次；3. 将浸染过的试材转入70%（或95%乙醇）中脱色2-3次（除去叶绿素），每隔1小时更换一次脱色液，至阴性对照材料呈白色为止。（漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。）4. 立体显微镜观察拍照。2GUS报导基因的定量检测GUS 能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferyl-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。MU的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。2.1 试剂配制1) 1mol/L Na2HPO4溶液：35.814g Na2HPO4溶于100ml水。2) 1mol/L NaH2PO4 溶液：15.601g NaH2PO4 溶于100ml水。3) 0.1M 磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/L Na2HPO4取5.77ml，1mol/L NaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。4) 10 SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。5) 0.5 M EDTA (PH8.0)：在80ml水中加入18.61g Na2EDTA2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。6) GUS酶提取液：0.1M 磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10% SDS取1ml； 0.5M EDTA(PH8.0)取2ml；Triton X-100取100ul；-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。7) MUG底物：称8.8mg MUG，溶于10ml GUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。8) 反应终止液（0.2 mol/L Na2CO3 ）：称2.12Na2CO3 ，用水定容到100ml。9) 考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250 10mg, 95%乙醇5m1, H3PO4 10ml，定容至l00ml，过滤后4保存。10) mg/ml BSA：20mg BSA，用GUS提取缓冲液定容至20ml。2.2 植物总蛋白的提取1) 取新鲜的植物组织100mg左右，用液氮将生物材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里磨碎组织。如果不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80冰箱。2) 将研磨破碎的组织转到Ep管里，并立即加入1ml的GUS提取缓冲液，充分混匀。3) 12,000rpm, 4离心5min，将上清转至另一洁净的Ep管，冰上放置待用。3蛋白浓度的测定（Bradford法）1) 取7个Ep管，分别加入0l、2l、4l、8l、12l、16l、20l的BSA标准液，用水补至相同体积20l。加入980l的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。以蛋白浓度（mg/ml）对吸收值A595做标准曲线。2) 取待测蛋白样品10l，加10l水，加入980l的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。代入公式，求出蛋白样品的浓度。2.4 GUS表达水平的定量测定1) 取100l蛋白上清，加入400l 37预热的GUS提取缓冲液里，再加入500l MUG底物，37温浴。在0min、15min、30min、45min和60min分别取混合反应物200u1加入到800u1反应终止液，室温避光保存。2) 用荧光分光光度计