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食管癌组织微环境对树突状细胞的影响医学论文发表创新医学网/作者：路静, 刘康栋, 赵明耀, 杨洪艳, 黄幼田, 秦珍珠, 白睿华, 董子明* 作者单位：(郑州大学基础医学院病理生理学教研室, 河南 郑州 450052)【摘要】 目的: 探讨食管癌组织匀浆上清液体外模拟肿瘤微环境对人树突状细胞(DC)分化发育的影响, 揭示肿瘤免疫逃逸机制, 为DC疫苗的应用提供理论基础。方法: 制备新鲜食管癌及癌旁组织匀浆上清液, ELISA检测其VEGFA含量。密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞, 含rhGMCSF和rhIL4 RPMI1640培养液诱导DC, 第2天在继续诱导DC基础上设食管癌匀浆上清组、 癌旁匀浆上清组、 VEGFA组, 均隔天半量换液, 第4天加入食管癌细胞株EC9706抗原, 第6天加入脂多糖, 第8天收集各组细胞。观察DC形态, 流式细胞术(FCM)检测免疫表型, RTPCR检测CD1a表达, CCK8检测T细胞增殖率及杀伤率。结果: 食管癌组织匀浆上清VEGFA含量(0.9870.319) g/L明显高于癌旁(0.1520.105) g/L, P0.05; 食管癌匀浆上清组细胞形态明显受到抑制, CD86分子阳性率(%)与正常DC相比由698降为4211、 CD1a由5612降为2712、 CD11c由2113降为1813(P0.01), CD1a基因几乎无表达, 刺激T细胞增殖率(%)由112.57.2降为70.23.5(P0.01), 杀伤率(%)由62.40.6 降为46.81.6(P0.01); 癌旁匀浆上清液组、 VEGFA组结果与正常DC组无统计学意义。结论: 食管癌组织匀浆上清液所模拟的微环境对DC的诱导分化及其功能有明显的抑制作用, 在该抑制作用中VEGFA并不起主要作用。【关键词】 食管肿瘤; 树突状细胞; 匀浆上清; 混合淋巴细胞反应; 细胞毒性T细胞我国是食管癌高发区, 食管癌死亡率仅次于胃癌居第2位, 食管癌的发生以及防治成为研究的热点。树突状细胞(dendritic cell, DC)是专职抗原提呈细胞, 对于免疫反应的启动、 进展以及免疫耐受的诱导起至关重要的作用1, 2。然而在大多数肿瘤患者中, 往往并不能产生DC介导的有效抗原提呈3。本研究小组及国内外其他学者应用体外大量扩增DC, 然后用肿瘤抗原冲击后回输患者治疗肿瘤, 取得一定效果4-6。研究肿瘤微环境下DC的功能, 可更好地反映宿主的抗瘤免疫状态, 了解其免疫逃逸机制。我们在体外以食管癌组织匀浆上清液模拟肿瘤微环境, 探讨其对DC形态、 表型及功能的影响及VEGFA在其中的作用, 为研究DC介导的肿瘤免疫治疗在食管癌患者中应用提供一定的理论基础。1 材料和方法1.1 材料 重组人白细胞介素4(rhIL4)、 重组人白介素2(rhIL2)购自Peprotech公司; 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)购自厦门特宝生物公司; 淋巴细胞分离液(Ficoll400, 1 077 g/L)和胰蛋白酶购自天津TBD公司; 完全培养基包括: RPMI1640购自美国Gibco公司, 人血清来自健康捐献者自体血清, 青链霉素各10万U/L; FITC标记的CD1a、 CD86、 CD11c、 CD80、 CD83及HLADR单克隆抗体(mAb)购自美国BD公司; RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司; TRIzol 购自美国Invitrogen公司; 活细胞计数试剂盒CCK8(cell counting kit8)购自日本同仁化学研究所; 人VEGFA ELISA试剂盒购自Bender MedSystems公司。人食管癌细胞株EC9706由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室馈赠; 外周血来自健康成人献血者, 晨起空腹抽取肘静脉血。1.2 方法1.2.1 食管癌标本采集及匀浆制备 取术前无化疗、 放疗史患者手术切除的食管癌组织及距离癌组织5 cm以外的癌旁组织各15例, 病理组织类型均为鳞癌, 无淋巴结转移。标本存放于液氮罐, 用于肿瘤组织匀浆制备。将食管癌及癌旁组织从液氮罐取出, 缓慢复温。称取癌及癌旁组织各200 mg, 浸于青霉素、 链霉素(浓度均为50万U/L)的生理盐水中20 min, 加入1 mL生理盐水, 调整匀浆浓度为200 g/L, 用组织匀浆研磨器缓慢进行组织研磨, 4 000 r/min, 30 min, 离心2次, 弃去下层沉淀, 留取上清液备用, 保存于-20冰箱。1.2.2 双抗体夹心ELISA法检测食管癌及癌旁组织匀浆上清液VEGFA蛋白水平 按人VEGFA ELISA试剂盒说明书要求进行具体操作。VEGFA标准品依次倍比稀释并设复孔, 每份癌及癌旁匀浆上清均设1复孔对照。应用SUNRISE酶标仪在波长450 nm条件下, 测各孔吸光度, 取平均吸光度为该样品的吸光度(A)值。根据VEGFA标准品浓度与吸光度的线性回归关系, 绘制出标准曲线, 由A值计算出每份匀浆上清中VEGFA的浓度。1.2.3 食管癌EC9706全细胞抗原的制备 常规培养并收集EC9706细胞, PBS洗2遍, 调密度为11010/L的细胞悬液, 置入EP管中, 超声破碎法制备抗原: 时间3 min, 脉冲4 s, 振幅1。13 000 r/min, 30 min, 4离心收集上清液, 过滤, 按照Bradford蛋白质定量法制作标准曲线, 测定抗原浓度。-20冻存备用。1.2.4 人外周血T淋巴细胞的分离及DC的诱导 方法参照文献7, 稍作修改: 抽取健康成人新鲜外周血50 mL、 肝素抗凝、 生理盐水稀释后, 与淋巴细胞分离液以21的比例缓慢加入离心管, 1 500 r/min, 25 min离心后, 毛细吸管轻轻吸取白膜层, 生理盐水洗涤3次(1 300 r/min, 8 min), 获得人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell, PBMC)。以含100 mL/L自体血清RPMI1640调密度为2109/L种于24孔板, 37贴壁3 h, 收集悬浮细胞, 尼龙毛柱法纯化后获得T淋巴细胞, 种于50 mL培养瓶中, 含rhIL2因子的RPMI1640培养基培养, 备用。去除悬浮细胞后的贴壁细胞用含rhGMCSF 100 g/L, rhIL4 5 g/L及100 mL/L自体血清RPMI1640培养液诱导培养DC。第2天实验组在上述诱导DC的基础上分组分别添加食管癌匀浆上清200 mL/L、 癌旁匀浆上清200 mL/L、 VEGFA 10 g/L。隔天半量换液。第4天各组加入EC9706抗原, 第6天加入脂多糖5 g/L, 第8天收集细胞, 进行形态观察, 免疫表型分析, RTPCR以及混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)和体外杀伤反应。1.2.5 FCM检测细胞免疫学表型 分别于培养0 d (PBMC贴壁3 h去除悬浮细胞后)、 8 d, 收集细胞PBS洗2遍。10 g/L多聚甲醛固定5 min, PBS洗1遍。用PBS调细胞密度为1109/L, 按20 L/106个细胞加入荧光标记的mAb(0 d细胞检测CD1a、 CD86、 CD11c、 CD80、 CD83及HLADR; 8 d细胞检测CD86、 CD11c及CD1a)4冰箱避光孵育30 min后加入PBS 1 mL, 吹打均匀, 1 000 r/min, 离心5 min, 弃去未结合的多余抗体。每管加入1 mL PBS重悬, 2 h内上机检测。1.2.6 RTPCR 各诱导组细胞总mRNA的提取: 弃掉培养液, 用PBS洗2遍, 在24孔板里加入TRIzol 1 mL, 吹打均匀(呈黏稠状), 室温静置5 min。转入无RNA酶的EP管中, 加225 L氯仿, 盖帽, 剧烈振荡1530 s, 室温静置3 min, 4, 14 000 r/min, 离心15 min。吸取上清移至新EP管, 加异丙醇0.5 mL, 充分混匀, 4, 12 000 r/min, 离心10 min。弃上清, 加DEPC水配制750 mL/L乙醇1 mL, 振荡洗涤沉淀, 4, 7 500 r/min, 离心5 min。得到mRNA, 按照一步法RTPCR试剂盒说明书操作, 获得目的基因DNA片段。CD1a引物: (5primer): 5GCTGCACTCTGGAAAGGTCT3(3primer): 5CCAAAGCGCAAGACCTATCA3(扩增片段长度为601 bp); GAPDH基因作为内参照(5primer): 5AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG3, (3primer): 5CTTGACAAAGTGGTCGTTGAGG3(扩增片段长度为915 bp)。1.2.7 CCK8检测致敏DC诱导MLR及特异性CTL对EC9706细胞杀伤效应 (1)致敏DC的获取: DC培养第4天, 各组加入终浓度为100 mg/L EC9706细胞抗原, 第8天收集DC, 即为负载EC9706抗原的DC。(2)MLR: 各组负载EC9706抗原的致敏DC为刺激细胞, 同种自体T细胞为反应细胞, 两者按120比例混合, 以1104个/孔种于96孔板, 分为对照组(静止T细胞); DC组(正常DC+T细胞); 食管癌匀浆上清组(食管癌匀浆上清诱导DC+T细胞); 癌旁匀浆上清组(癌旁匀浆上清诱导DC+T细胞); VEGFA组(VEGFA诱导DC+T细胞)。每组设6个复孔, 混合培养72 h, CCK8试剂盒检测T细胞增殖率。(3)致敏DC诱导特异性CTL的产生: 同种自体T细胞与各组致敏的DC按201比例混合培养72 h, 激活为CTL。(4)细胞毒性实验: 将各组CTL和静止T细胞, 按效应细胞EC9706为301比例混合, 分为靶细胞对照组(EC9706); 效应对照组(静止T细胞+ EC9706); DC组(DC诱导的CTL+ EC9706); D组: 食管癌匀浆上清组(食管癌匀浆上清组DC诱导的CTL+ EC9706); 癌旁匀浆上清组(癌旁匀浆上清组DC诱导的CTL+ EC9706); VEGFA组(VEGFA组DC诱导的CTL+ EC9706)。设每组6个复孔, 1104个/孔细胞悬液200 L种于96孔板, 培养72 h, CCK8法检测对EC9706细胞杀伤率。(5)CCK8检测: 加入10 L/孔的CCK8试剂, 培养2 h, 于酶标仪450 nm处测各组A值, 计算T细胞增殖率和杀伤率。其计算公式如下: T细胞增殖率=实验组A值/静止T细胞组A值100%; 细胞杀伤率=(效应对照组A值-实验组A值)/靶细胞对照组A值100%。1.2.8 统计学分析 采用SPSS12.0统计软件, 进行两组OneWayANOVA分析, 以xs表示。2 结果2.1 ELISA检测食管癌及癌旁组织匀浆上清VEGFA含量 检测15例食管鳞癌及癌旁组织匀浆上清液, 结果显示癌旁匀浆上清组A值0.2030.089, VEGFA浓度0.1520.105 g/L; 癌上清组A值0.8970.251, VEGFA浓度0.9870.319 g/L, 两组比较P0.05, VEGFA含量有统计学意义。2.2 形态学观察 PBMC去除悬浮细胞后, 镜下观察细胞贴壁, 体积小。诱导2 d, 部分贴壁细胞变形, 伸出小突起; 第4天, 正常DC组细胞表面突起更加明显, 并且交织在一起, VEGFA组与癌旁匀浆上清组细胞形态与正常DC组相似, 而食管癌匀浆上清组细胞形态变化较小, 仅有个别细胞伸出突起, 细胞体积小于正常DC组细胞; 第8天, 正常DC组、 VEGFA组与癌旁匀浆上清组细胞逐渐增大变圆, 高倍镜下细胞周围可见毛刺状突起, 部分细胞悬浮, 呈成熟形态, 而食管癌匀浆上清组大圆细胞少, 呈发育迟缓状态(图1)。2.3 FCM检测细胞相关表面抗原 分离PBMC, 贴壁3 h, 去除非贴壁细胞, 检测DC诱导前PBMC相关抗原阳性率(%)CD80 13.923.60、 CD83 9.563.91、 CD1a 18.862.23、 HLADR 22.623.31、 CD86 38.644.05、 CD11c 7.312.67。第2天各组分别加入食管癌匀浆上清、 癌旁匀浆上清、 VEGFA, 诱导7 d后有关细胞表面抗原表达见表1。2.4 RTPCR检测CD1a基因表达 正常DC组目的基因CD1a(601 bp)的表达较强, 食管癌匀浆上清组该基因基本无表达, VEGFA组与癌旁匀浆上清组CD1a表达与正常DC组无统计学意义, 内参基因GAPDH(915 bp)各组表达较一致(图2)。 表1 诱导后DC的免疫表型2.5 致敏DC诱导T细胞增殖及其特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤效应 食管癌匀浆上清组诱导的DC刺激T细胞增殖率、 CTL杀伤率均明显低于正常DC组、 癌旁匀浆上清组、 VEGFA组诱导的DC; 而VEGFA组与正常DC组无统计学意义(图3、 4)。图3 各组T细胞增殖率(%)的情况3 讨论DC是体内专职的抗原提呈细胞, 成熟DC具有较强的抗原提呈能力8, 肿瘤患者外周血及免疫器官存在一定数量DC, 但肿瘤细胞仍能逃逸机体免疫监视而无限制生长, 这是由于肿瘤组织内的DC基本不成熟或不活跃, 其浸润数量与免疫反应的强弱并无必然相关性, 因此研究的重点转移到了肿瘤局部DC的功能和活性上9。本结果显示, 早期未成熟DC, 在食管癌组织匀浆上清液模拟的肿瘤微环境影响下, 细胞形态方面明显落后于正常DC, 在基因水平也基本不表达CD1a, 并且膜表面低表达CD86、 CD11c等共刺激分子, 而这些表面分子的表达是DC 完成其抗原提呈功能所必需的, CD86高表达是DC分化的转折点, 标志着DC具备足够的共刺激能力。已知机体对肿瘤细胞的免疫排斥主要依赖于体内的T细胞, T细胞的激活需要两类信号: 一类是特异的抗原提呈信号, 另一类是非MHC限制的共刺激信号。若缺乏共刺激信号, 则T细胞处于无能状态或凋亡。本实验中食管癌匀浆上清组细胞表面CD1a、 CD11c、 CD86等活化T细胞的第二信号分子表达低下, 说明其不具备足够的共刺激能力, 是功能低下或无功能的DC, 导致T细胞增殖能力明显降低, 体外杀伤EC9706细胞能力也相应减弱。本研究中, 由于DC尚处于未成熟阶段, 食管癌组织匀浆上清液中可能存在抑制DC成熟的因子, 一些文献报道血管内皮生长因子是起到抑制作用的主要因子之一10, 11。我们通过检测食管癌及癌旁组织匀浆上清液中VEGFA的含量, 以及设立VEGFA对照组进行研究。ELISA检测食管癌组织匀浆上清液中VEGFA的含量明显高于癌旁组, 似乎VEGFA是导致DC抑制的可能因素, 然而, VEGFA (10 g/L)组与正常DC组相比细胞形态以及表面标志的表达、 以及功能检测均无明显区别, 表明, 单独VEGFA并没有起到明显抑制DC成熟的作用; 在食管癌组织匀浆上清液中VEGFA含量为(0.990.32)g/L, 远低于VEGFA组含量10 g/L, 说明食管癌组织匀浆上清液抑制DC过程中VEGFA也不起主要作用, 可能通过IL10等其他因子、 或多因子联合作用而下调DC的有效提呈功能。这些肿瘤相关性DC成熟障碍、 功能受抑, 为肿瘤细胞逃避机体的免疫监视诱导机体对肿瘤的免疫耐受提供了直接的依据。【参考文献】1 Lipscomb MF, Masten BJ. Dendritic cells: Immune regulators in health and diseaseJ. Physiol Rev, 2002, 82(1): 97-110.2 Casas R, Skarsvik S, Lindstrm A, et al. Impaired maturation of monocytederived dendritic cells from birch allergic individuals in association with birchspecific immune responsesJ. Scand J Immunol, 2007, 66(5): 591-598.3 Smyth MJ, Godfrey DI, Trapani JA. A fresh look at tumor immuno surveillance and immunotherapyJ. Nat lmmunol, 2002, 2(4): 293-299.4 买 玲, 杨洪艳, 董子明, 等. 肿瘤抗原脉冲致敏的小鼠树突状细胞疫苗的制备及抗肿瘤作用的实验研究J. 中华消化杂志, 2000, 20(4): 285-286.5 张书峰, 马长路, 董子明, 等. 血源性树突状细胞融合疫苗抗恶性黑色素瘤的应用研究J. 中国医刊, 2004, 39(5): 35-37.6 He XZ, Wang L, Zhang YY, et al. An effective vaccine against colon cancer in mice: Use of recombinant adenovirus interleukin12 transduced dendritic cellsJ. World J Gastroenterol, 2008, 14(4): 532-540.7 路 静, 赵 军, 董子明, 等. 人B72瘤苗与DC瘤苗体外联合诱导抗食管癌的作用J. 世界华人消化杂志, 2005, 13(12): 1382-1385.8 Eichler H, Nguyen XD, Roelen D, et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cellsJ. 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Magy Onkol, 2004, 48(1): 49-56.10 杨文锋, 李道堂, 李 静, 等. 食管癌组织中血管内皮生长因子的表达对树突状细胞的影响J. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23(1): 46-47.11 张 频, 阎 钧, 汪 昱. 内分泌腺源性血管内皮生长因子与肿瘤相关性的研究进展J. 中国癌症杂志, 2006, 16(2): 151-153.急性移植物抗宿主病病人血清IL-2、IL-8、IL-10及TNF-水平变化的研究医学论文发表创新医学网/作者：王书红，达万明，靳海杰，靖域，颜光涛 作者单位：解放军总医院血液科，1生物化学研究所放射免疫室，北京 100853【摘要】为了探讨细胞因子IL-2、TNF-、IL-10、IL-8在异基因造血干细胞移植后aGVHD发病中的作用，观察33例Allo-HSCT患者aGVHD的发病情况。aGVHD的诊断主要依据临床表现，部分病例还依据皮肤、肠粘膜活检的病理学变化。移植前后定期采集患者血清，采用放射免疫法检测细胞因子IL-2、TNF-、IL-10、IL-8的浓度的变化。结果发现，异基因造血干细胞移植后33例患者均获得造血功能重建，13例发生aGVHD，其中8例度aGVHD，5例-度aGVHD。IL-2、TNF-水平在aGVHD阳性组明显高于aGVHD阴性组，而IL-10的水平在aGVHD阳性组明显低于aGVHD阴性组，IL-8水平的变化无统计学意义。结论： 细胞因子IL-2、TNF-在临床aGVHD的发病中起重要的正向调节作用，定期检测患者血清的IL-2、TNF-水平有助于预测aGVHD的发生。【关键词】 IL-2; TNF-; IL-10; IL-8; 急性移植物抗宿主病; 异基因造血干细胞移植Changes of IL-2，IL-8，IL-10 and TNF- levels in Sera of Patients with Acute Graft-Versus-Host DiseaseWANG Shu-Hong，DA Wan-Ming，JIN Hai-Jie，JING Yu，YAN Guang-TaoDepartment of Hematology，1Department of Immunology，Institute of Biochemistry，General Hospital of Chinese PLA，Beijing 100853，ChinaAbstract The purpose of this study was to explore the roles of cytokines IL-2，TNF-，IL-10 and IL-8 in the pathogenesis of acute graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The incidence of aGVHD was observed in 33 patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The aGVHD was clinically diagnosed. Sera from the 33 patients were taken before and after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The IL-2，TNF-，IL-8，IL-10 levels in serum of 33 patients were measured serially by using radioimmuno-assay(RIA). aGVHD occured in 13 patients including 8 patients with aGVHD I and 5 patients with aGVHD -. The results showed that the circulating levels of IL-2 and TNF- were markedly elevated during aGVHD and strongly correlated with the severity of aGVHD as compared with patients without aGVHD. However，the level of the IL-10 in patients with aGVHD was significantly lower than that in patients without aGVHD. The change of IL-8 level was not significant statistically. It is concluded that IL-2 and TNF- may play important roles in the pathogenesis of aGVHD，and measurement of serum IL-2 and TNF- levels after allo-HSCT can provide predictive indicator for acute GVHD.Key words IL-2; TNF-; IL-10; IL-8; aGVHD; allo-HSCT异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是治疗恶性血液病和非恶性遗传性缺陷的有效手段，移植后涉及一系列移植相关并发症，如急性、慢性移植物抗宿主病、肝静脉闭塞综合症、严重感染、间质性肺炎等。其中，急性移植物抗宿主病(aGVHD)是异基因造血干细胞移植的主要并发症之一，发生率高达30%-60%，并造成约20%的移植相关死亡率，严重影响患者的生存时间和生存质量1。因此，aGVHD的发病机理研究是当今移植免疫的重点课题。aGVHD发生的中心环节是供者来源的T细胞识别受者的异体抗原而被激活，由于过量释放细胞因子引起受者多器官损伤的免疫病理过程2。本研究探讨可能引发aGVHD的细胞因子的作用，以期对aGVHD更好的早期防治提供实验依据。材料和方法临床资料及研究对象以33例异基因造血干细胞移植患者作为研究对象。所有33例病例均来自我院及307医院，研究时间为2002年2月至 2005年 2月，其中男性17例，女性16例，年龄 17-48岁 (中位年龄为31岁 )。33例中慢性粒细胞白血病 8例(慢性期 6例、加速期2例)，急性非淋巴细胞白血病 15例，(完全缓解12例，M5原发耐药未缓解 2例，M6复发1例)，骨髓增生异常综合征 4例(RA 3例、RAEB-T 1例)，急性淋巴细胞白血病完全缓解3例，淋巴瘤(NHL/ALL)中枢受累1例，急性再生障碍性贫血1例，左乳低分化腺癌术后肺转移1例。供者情况同胞供者30例，非亲缘供者2例(台湾慈济骨髓库)，非亲缘脐血1例(山东脐血库)。HLA配型及ABO血型33例供受者HLA配型的结果均完全相同，ABO血型相合22例，不合11例(主要不合5例，次要不合6例)。移植类型24例异基因外周血干细胞移植，供者为HLA完全相合的同胞，另9例为异基因骨髓移植。预处理方案对白血病患者采用经典Cy+TBI： 环磷酰胺60 mg/ (kgd)，连用2天，给美司钠拮抗出血性膀胱炎，全身照射6-10 Gy，分2天进行，肺受照剂量8 Gy;1例急性再生障碍性贫血患者采用ATG+环磷酰胺;2例无血缘关系供者骨髓移植采用马利兰+阿糖胞苷+环磷酰胺;1例左乳低分化腺癌术后肺转移的患者采用氟达拉宾+环磷酰胺。供者造血干细胞采集allo-PBSCT供者应用G-CSF 300 g/d，皮下注射，连用3天，第4天始行造血干细胞采集。干细胞均经中心静脉回输给患者。对供者为O型或者受者为AB型的次要血型不和者，回输过程中注意慢输或稀释后输。对主要血型不合者为防止移植后溶血，用羟乙基淀粉沉降并且除去移植物中的红细胞。全部患者接受全环境保护、血制品与细胞因子(G-CSF)应用及营养支持治疗。aGVHD的诊断及预防、治疗方案aGVHD的诊断及分级参照美国西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心Thomas等于1975年提出的分级诊断方法。7例患者还进行皮肤活检取得病理学证据，5例出现肠道aGVHD的患者，均经结肠镜检查及肠粘膜活检取得病理学证据。预防方案采用环孢霉素(CsA)以及短疗程氨甲喋呤(MTX)方案。MTX的用法为移植后1天15 mg/m2静脉滴注，移植后第 3、6、11天剂量为10 mg/m2 ; CsA用法为1.5-2 mg/ (kgd)持续静脉滴注24小时，时间为移植前1天到移植后30天。对环孢霉素A应每周查浓度，最好根据血药浓度调整用药剂量，直至患者无严重胃肠症状后改为口服(3 mg/kg)，依据情况维持、减量。治疗aGVHD多用甲基强的松龙40 mg，2次/日，静脉滴注，好转后改口服强的松，并逐渐减量。或者用他可莫司(FK-506)，剂量为0.03 mg/kg。样品(血清标本)收集按照静脉采血的常规，定期地采集所有allo-HSCT的患者的外周血约3 ml，离心后分离血清，所有血清标本置于1.5 ml Eppendorf管中，编号之后储存于-80冰箱内。采血时间分别为： 移植前(7天左右); 移植后每周抽取1次外周血，连续6-12周。细胞因子检测本次实验采用放射免疫分析技术检测33例患者移植前后血清的细胞因子( IL-2、TNF-、IL-8、IL-10)的浓度，所采用的IL-2、TNF-、IL-8、IL-10放射免疫试剂盒为人细胞因子检测试剂盒，试剂盒来自解放军总医院生物化学研究所放射免疫室(原北京东亚免疫技术研究所)。取聚苯乙烯试管编号，按放射免疫药盒加样程序操作，加入分离剂后充分混匀，室温放置20分钟，4 500g离心25分钟，吸弃上清液，在自动计数器上测放射性。本实验采用SN-682型放射免疫计数器，自动计数，结果由SN-695型 gamma计数放射免疫自动分析程序直接给出有关技术参数、标准曲线及待测样品浓度ng/ml，并由相连的计算机打印出结果。植入证据供受者性别不同，采用性染色体观察法;供受者ABO血型不同，观察血型变化;供受者性别及血型均相同，采用PCR检测DNA可变串重复序列。统计学处理本实验数据采用STATA计算机统计处理系统进行分析，所有数据采用均数标准差(XSD)表示，进行计量资料t检验。结果造血功能重建33例患者异基因移植后经性染色体、ABO血型、DNA可变串重复序列检查证实，均为供者型完全植入，均获得造血功能重建。中性粒细胞恢复到0.5109/L及血小板恢复到20109/L的中位时间分别为移植后15(10-23)天及20(10-66)天。aGVHD观察33例患者中发生aGVHD共13例，其中8例度aGVHD，2例度aGVHD，3例度aGVHD，没有度aGVHD，20例未发生aGVHD。因此aGVHD发生率为39.39%，其中度aGVHD 8例，发生率为24.24%，-度5例，发生率为15.15%。aGVHD发生中位时间为移植后26天(11-39)。我们发现，严重的aGVHD发生早，程度较轻的aGVHD发生较晚; aGVHD患者的临床表现主要有皮疹、肝功能损害、腹泻腹痛以及发热等症状。大部分aGVHD患者经用甲基强的松龙或(和)FK-506等药物治疗，病情得到良好控制，皮疹、肝功能损害、腹泻等症状明显减轻、好转。预后情况目前已知预后差的有5例： 1例CML加速期患者进行非亲缘供者(台湾慈济)骨髓移植后116天白血病复发，因多脏器衰竭而死亡;1例慢性粒细胞白血病慢性期女性患者移植后出现超急性GVHD，第11天出现严重腹泻、腹痛，经肠镜检查为乙状结肠度aGVHD，治疗后曾一度好转，但终因病情较重救治无效而死亡; 2例AML-M5原发耐药未缓解及1例M6复发患者均发生aGVHD，因本病不缓解，病情重，预后差。预后相对较好的有3例：1例AML-M2患者移植后2个月发现肺结核，经三联抗结核治疗后，发热、咳嗽症状消失，血象、骨髓象恢复正常; 1例急性再生障碍性贫血患者移植后18天开始造血重建，顺利康复;1例左乳低分化腺癌术后肺转移患者移植后肺部病变消失，复查血象、骨髓正常。病情平稳的有25例：随访2至6个月未复发。IL-2、TNF-、IL-10和IL-8水平的变化结果根据aGVHD的严重程度将患者分为3组：无aGVHD组;度aGVHD组;-度aGVHD组。然后，比较移植前后各组的IL-2、TNF-、IL-10、IL-8水平的变化。IL-2水平的变化比较各组发生aGVHD前后的IL-2水平显示： aGVHD时，-度aGVHD患者的IL-2水平(8.851.91)高于度aGVHD患者 (7281.60)(P0.05)，而度aGVHD患者IL-2值高于无aGVHD患者 ( 5.021.49)(P 0.05)(表1)。Table 1. IL-2 level in patient serum during aGVHD(略)TNF-水平的变化分析各组TNF-水平结果显示： aGVHD时，-度aGVHD患者TNF-(2.120.25) 水平高于度aGVHD患者 (1.460.41)(P0.05)，而度aGVHD患者TNF-值高于无aGVHD患者 (1.040.37)(P0.05)(表3)。Table 3. IL-8 level in patient serum during aGVHD(略)血清IL-10水平的变化分析各组IL-10水平显示：移植后发生-度aGVHD患者的IL-10水平(16.322.64)明显低于度aGVHD患者 (22.733.63)(P0.05)，而度aGVHD患者的IL-10值低于未发生aGVHD的患者(26.253.18) (P 005)(表4)。Table 4. IL-10 level in patient serum during aGVHD(略)讨论放射免疫技术测定是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。其优点是灵敏度高，可测出ng级到pg级含量的物质，特异性强，精确性好，样品用量少，测定方法易规范化和自动化3。因此本研究采用放射免疫分析法检测细胞因子IL-2、TNF-、IL-10、IL-8的浓度。检测结果提示，IL-2、TNF-在人类aGVHD的发病中起重要的正向调节作用，-度aGVHD患者IL-2、TNF-浓度高于度aGVHD患者，而度aGVHD患者IL-2、TNF-值高于无aGVHD患者。而且，allo-HSCT患者发生aGVHD前1周左右，患者血清中IL-2、TNF-浓度均明显高于移植前水平，因此我们认为，移植前、后定期(移植后每周1次，连续8周左右) 检测患者的IL-2、TNF-水平有助于预测aGVHD的发生，并且对aGVHD严重程度的预测也有一定的作用。在用药物控制aGVHD后，IL-2、TNF-浓度随症状的缓解而明显下降。临床上已经有成功应用IL-2受体抗体(赛尼哌)的报道4。动物实验证明，抗TNF-单克隆抗体可防止aGVHD引起的肠道损害，因此可以设想注射人TNF-的单克隆抗体是否也能降低aGVHD的发生，若有研究证实，则为今后临床应用TNF-抗体防治aGVHD打下基础。IL-8是一种重要的白细胞趋化因子，属于一类典型的炎症介质，对病原微生物的杀伤有促进作用。我们的实验结果尚未发现IL-8与aGVHD有相关性。IL-10主要由 Th2细胞产生，它能有效地抑制Th1细胞和B细胞合成的细胞因子，如IL-2、TNF-等的产生，故IL-10是典型的抑制aGVHD应答的因子6。我们的实验结果提示，移植前IL-10水平高的患者移植后并发症少，预后良好;IL-10的水平降低与移植后重度aGVHD的发生相关。在比较同一患者移植前后IL-10浓度时，我们发现移植后发生aGVHD患者IL-10水平明显下降，在用药物控制aGVHD后，IL-10随症状的缓解而升高; 而未发生的aGVHD的患者IL-10水平较稳定。故IL-10对aGVHD的发生起重要的负向调节作用5。【参考文献】1 Slavin S，Nagler A，Naparstek E，et al. Nonmyeloablative stem cell transplantation and cell therapy as an alternative to conventional bone marrow transplantation with lethal cytoreduction for the treatment of malignant and nonmalignant hematologic diseases. Blood，1998; 91: 756-7582 Murphy WJ，Welniak LA，Taub DD，et al. Differential effects of the absence of interferon-gamma and IL-4 in acute graft-versus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation in mice. J Clin Invest，1998; 102:1742-17483 Ferrara JL，Krenger W. Graft-versus-host disease: the influence of type1 and type 2 T cell cytokines. Transfus Med Rer，1998;12:1-174 Grimm J，Zeller W，Zander AR，et al. Soluble interleukin-2 recetor serum levels after allogeneic bone marrow transplantation as a marker for GVHD. Bone Marrow Transplant，1998; 21:29-325 Holler E，Roncarolo MG，Hintermeler-Knabe R，et al. Prognostic significance of increased IL-10 production in patients prior to allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant，2000; 25:237-2416 李新，孙万军，原野等. 小鼠H-2单倍相合非清髓骨髓移植后细胞因子表达的动态研究. 中国实验血液学杂志，2005;13：687-691重视基础理论与临床实习不断提高教学质量的研究医学论文发表创新医学网/作者：杨立明， 赵华， 马岩， 吴珊* 作者单位：吉林大学第一医院，吉林 长春 130021; 吉林大学基础医学院，吉林 长春 130021【摘要】随着医学教育全球化的发展，教学质量已成为医学教育的生命线。通过重视职业道德与人文教育、重视基础理论与临床实习、应用多媒体于基础医学和临床医学教学、通过基础理论与实践结合、通过病例分析、提高教学质量与效率，有助于学生准确掌握课程的知识点、难点与要求。【关键词】 基础理论 临床实习 教学质量Research on Paying Great Attention to Basic Theory and Clinic Practice in Enhancing Teaching QualityYANG Liming ， ZHAO Hua ，MA Yan ， WU Shan*(First Hospital， Jilin University， Changchun 130021,China; School of Basic Medical Sciences， Jilin University， Changchun 130021,China)AbstractWith the development of global medical education， teaching quality has been the lifeline of medical education.By paying great attention to professional morals and humanistic education ,basic theory and clinic practice，using multimedia for basic and clinic medicine teaching，combining the basic theory with practice，case analysis，the quality and efficiency of teaching have been improved， which help students accurately master the knowledge points,difficult points and requirements of the course.Key wordsBasic theory; Clinic practice ; Enhancing educational quality当前，我们面临着一个科学技术飞速发展变化，国际竞争日趋激烈的时代。国家的综合国力和国防竞争力越来越取决于教育发展、科技进步和知识创新，教育在经济和社会发展过程中发挥越来越突出的作用。百年大计，教育为本，教育直接关系到国家的前途与发展。教育大计，教师为本，教师不仅需无私奉献的精神，丰富的教学经验、渊博的学识，科学严谨的工作作风，还应掌握学生的特点以及所用的教学策略和教学方法。教师的水平直接关系到人才培养的质量。下面介绍重视基础理论与临床实习教学