卵巢上皮性癌组织中激肽释放酶7及14的表达及临床意义.doc

卵巢上皮性癌组织中激肽释放酶7及14的表达及临床意义作者：顾双,王青,张意茗,袁彩霞,张向宁单位：济南市中心医院生殖医学科， 济南【摘要】 目的 研究激肽释放酶（kallikrein, KLK）7及KLK14在卵巢上皮性癌组织中的表达,并探讨其临床意义。方法 采用RTPCR及Westernblot技术测定KLK7及KLK14 在50例不同临床分期、不同组织分级的卵巢上皮性癌中mRNA及蛋白表达。结果 KLK7在卵巢癌中表达明显增高，且低分化组织较高分化组织表达高（P0.01）；KLK14在卵巢癌中表达亦增高（P0.05），且晚期卵巢癌(、期)明显高于早期卵巢癌(、期，P0.01)；G3级卵巢癌高于G1、G2级卵巢癌（P0.05）。结论 KLK7、KLK14在卵巢癌的发生及转移中有潜在促进作用。 【关键词】 激肽释放酶7；激肽释放酶14；卵巢肿瘤GU Shuang, WANG Qing, ZHANG Yiming, YUAN Caixia, ZHANG Xiangning(1. Department of Gynecology and Obstetrics, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China; 2. Department of Obstetrics and Gynecology, People′s Hospital of Shanting District, Zaozhuang 277145, Shandong, China; 3. Department of Reproductive Medicine, Jinan Central Hospital, Jinan 250013, China)To evaluate the expressions of kallikrein 7(KLK7) and 14(KLK14) in human epithelial ovarian cancers and to discuss its clinical significance in malignant tumors. Methods RTPCR and Westernblot were used to determine the expressions of KLK7 and KLK14 mRNA and proteins in 50 epithelial ovarian cancers with different clinical stages and different histological grades. Results The expressions of KLK7 mRNA and protein in ovarian cancers were significantly higher than those in benign tumors（P0.01）and were markedly associated with the histological differentiation （P0.01）, also the expressions of KLK14 mRNA and protein in ovarian cancers were higher than those in benign tumors（P0.05）and were associated with the histological differentiation(P0.05), and the expression of KLK14 in advanced stages ( and stage) was higher than that in early stages (and stage, P 0.01). Conclusion KLK7 and KLK14 play potential roles in the pathogenesis and metastasis of ovarian cancer.Key words: Kallikrein 7; Kallikrein 14; Ovarian neoplasms 卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，发病率在女性生殖道恶性肿瘤中居第三位。且大部分卵巢癌起病隐匿，一旦确诊已有2/3为晚期，给该病的诊治带来极大的困难。激肽释放酶(kallikrein, KLK)家族是近几年逐步被研究且与多种恶性肿瘤相关的基因家族，是一组分泌型丝氨酸蛋白酶，广泛存在于各种组织和体液中,参与多种生理和病理过程1。本研究通过检测卵巢上皮性癌中KLK7和KLK14的表达,探讨其在卵巢肿瘤中的作用。1 资料与方法 1.1 临床资料 选取山东大学齐鲁医院妇科2004年1月2007年3月收治的卵巢上皮性癌标本50例，年龄3179岁，中位年龄56岁，其中浆液性囊腺癌26例，粘液性囊腺癌13例，其他类型11例。按照2000年国际妇产科联盟（FIGO）标准分期，期8例，期6例，期23例，期13例；组织学分级G1 级21例，G2 级16例，G3 级13例；术前均未接受任何化疗和放疗。同时取卵巢良性肿瘤22例，均在术中收集，取材离体30?min内液氮速冻，转存至-80?冰箱备用。所有标本均经病理学确诊。1.2 试剂 Trizol、DNA marker购自TaKaRa公司，逆转录及PCR所用试剂为Promega公司生产。KLK7、KLK14羊抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司，βactin 兔抗人单克隆抗体、HRP标记兔抗羊IgG购自北京中杉生物工程公司。细胞裂解液购自Sigma公司，丙烯酰胺、TMEMD、SDS、NC膜等试剂购自Ameresco公司，发光试剂购自Pierce公司。1.3 方法1.3.1 Westernblot检测KLK7和KLK14蛋白表达 取组织置于冰上研磨碾碎，每100?mg加入0.2?mL细胞裂解液，冰上充分裂解30?min，14?000?rmin离心收集上清，考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。分取各组蛋白于15%聚丙烯酰胺电泳分离，分离后将蛋白转移至NC膜，室温封闭1?h，KLK7羊抗人多克隆抗体1100、KLK14羊抗人多克隆抗体1500、βactin兔抗人单克隆抗体1500稀释，4?孵育过夜，漂洗，加二抗13?000，室温孵育1?h，漂洗，滴加发光试剂暗室曝光显示条带。1.3.2 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测KLK7和KLK14mRNA表达 按照Trizol说明书抽提总RNA，紫外分光光度仪定量。取2?μg总RNA按MMLV逆转录酶步骤逆转录为cDNA，PCR经优化反应条件，总体系20?μL。引物序列均由上海英骏生化公司合成，内参的βactin引物序列为:上游5′GTTGCGTTACACCCTTTCTTG3′，下游5′GACTGCTGTCACCTTCACCGT3′,扩增片断157bp。KLK7基因引物序列为上游5′GACGCCGATGACCTATGA3′,下游5′GAGGCTGAAGCACGAGAA3′,扩增片断541?bp，PCR反应条件为95?预变性5?min,95?变性1?min,52?退火1?min，72?延伸1.5?min，进行35个循环，最后72?延伸10?min。KLK14基因上游引物：5′GGCTGGGGAACTATATCCAG3′，下游引物：5′TTTCCTCAATCCAGCTTCTG 3′，扩增片断300?bp，PCR反应条件: 94?预变性2?min，94? 50?s，58? 40?s，72? 50?s，35个循环，72?延伸10?min。PCR产物经1.5琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察拍照。Touching凝胶成像系统分析癌灶及良性组织中KLK7（KLK14）mRNA /βactin mRNA相对表达比A.1.4 统计学处理 所有统计处理均由SPSS10.0分析软件完成，实验结果率的比较采用χ2检验或Fisher精确概率法,表达比A以±s表示，组内比较采用单因素方差分析，P0.05为差异具有统计学意义。2 结 果2.1 RTPCR检测结果 KLK7在卵巢恶性肿瘤的阳性表达率为82.0% (41/50)显著高于良性肿瘤的22.7%(5/22)，两者比较差异有统计学意义(P0.01)，且低分化（G3）组织较高分化（G1、G2）组织表达明显增高(P0.01)，但不同临床分期、不同组织类型卵巢癌组织中阳性表达率差异无统计学意义（P0.05）。KLK14在恶性肿瘤中的阳性表达率78.0%(39/50)高于良性肿瘤组的45.5%(10/22，P0.05)，晚期卵巢癌(、期)与早期卵巢癌(、期)的表达强度比较差异有统计学意义(P0.01)，高分化（G1、G2）与低分化（G3）肿瘤组织中表达强度差异亦有统计学意义(P0.05)。见图1，图2，表1。 3 讨 论 人类激肽释放酶基因家族主要位于染色体19q13.319q13.4,是人类基因中最大的丝氨酸蛋白酶基因簇。近几年,已克隆出15个成员，即KLK1KLK15，分别编码相应的分泌型蛋白hK1hK152。KLK受类固醇激素的调节,研究表明3,类固醇激素水平的高低影响了卵巢癌的抑制及发展，因此本研究对卵巢上皮性癌组织KLK7和KLK14的表达进行检测，以期阐明其在卵巢上皮性癌中的作用。 KLK7基因最初发现主要在上皮角化层细胞中表达,参与皮肤脱屑过程4,且研究认为KLK7与多种皮肤疾病有关5。近来发现在其他组织、器官中也有表达, 并与肿瘤细胞的生长、浸润、转移相关6。因而检测KLK7在卵巢肿瘤中的表达具有一定的意义，本研究结果显示，KLK7在卵巢癌的表达明显高于良性组织，且低分化（G3级）组织中高表达。KLK7在卵巢癌中过表达，提示其可能是导致肿瘤细胞生长，扩散和转移的一个重要潜在因素，结合KLK7在皮肤中的作用是促进角质层细胞脱落,推测卵巢癌中KLK7作用可能与丝氨酸蛋白酶参与细胞间质的溶解和肿瘤进展中早期瘤细胞脱落有关，从而促进肿瘤转移。本研究虽显示KLK7表达与临床分期无明显相关，但有研究表明7，对不同分期卵巢癌中KLK7检测，低表达的患者比高表达的患者具有更长的无病生存期，因而可作为预后的一个指标。 KLK14在很多正常组织中有表达，如：乳腺、甲状腺、子宫等器官8，且表达受甾体类激素调节，不同组织的表达水平差异, 可能与其在不同组织行使不同生物学功能有关。KLK14在多种肿瘤组织中也有表达, 尤其在激素相关性组织, 如乳腺、卵巢、前列腺等器官的肿瘤组织9，可能通过激素的介导对肿瘤发挥作用。在卵巢肿瘤方面，Yousef等10先后多次在卵巢肿瘤中检测KLK14表达,发现其mRNA水平在正常组织、良性肿瘤组织和恶性肿瘤组织中呈阶梯式递减表达11；Borgono等12研究则显示在肿瘤组织中hk14含量比正常组织约高40%；Obiezu等13检测60例卵巢癌患者, 其中50例KLK14高表达。以上研究成果各有矛盾，而本结果与后两位学者相同，即KLK14在卵巢癌组织中的表达较良性组织高，且与临床分期及组织分级有关，晚期卵巢癌(、期)及G3级卵巢癌组织中表达明显增高，提示KLK14的高表达可能与卵巢癌侵袭相关，在体内KLK14可能以前体形式存在, 以级联反应的方式进行活化, 如hk14能激活hk5前体,hk5又能激活hk14前体；同时hk14又可能通过作用于细胞外基质, 降低细胞间黏附，提高细胞运动性和增殖，促进新生血管形成，参与肿瘤细胞的生长、转移和浸润等14。通过以上观察推测, 多个KLK基因可能参与一种共同的酶学途径, 在卵巢的正常生理过程中发挥作用，这一途径在卵巢肿瘤的发生过程中可能失调节。 总之, KLK7和KLK14在卵巢癌中存在高表达,其表达可能反映患者肿瘤活跃状态,并成为判断肿瘤预后,是否早期转移的指标。因其编码的分泌性蛋白存在于多种体液中, 应用ELISA 法对循环中的KLK7、KLK14进行定量分析将具有很大的临床意义，同时KLK7、14可能成为基因治疗的新靶点。随着研究不断深入, KLK7、KLK14在肿瘤的诊断与治疗领域将拥有广阔的前景。【参考文献】 1张淑群，张淑慧，姜建涛. 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