蛋白质纯化与结晶的原理

蛋白质纯化与结晶的原理蛋白质纯化与结晶的原理 获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈 就是制备大量纯化的蛋白质 10 mg 其浓度通常在 10 mg ml 以上 并以此为基础进行结晶条件的筛选 运用重组基因的技术 将特定基因以选殖 clone 的方式嵌入表现载体 expression vector 内 此一载体通常具有易于调控的特性 之后再将 带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中 如大肠杆菌 Escherichia coli 在菌体快速生长 的同时 也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质 一般而言纯度越高的蛋白质比较有 机会形成晶体 因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素 在取得高纯度的蛋白质溶液后 接下来就是晶体的培养 蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成 类似 是在饱和溶液中慢慢产生的 每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异 影响晶体形成的变 量很多 包含化学上的变量 如酸碱度 沈淀剂种类 离子浓度 蛋白质浓度等 物理上的变 数 如溶液达成过饱和状态的速率 温度等 及生化上的变数 如蛋白质所需的金属离子或抑 制剂 蛋白质的聚合状态 等电点等 皆是养晶时的测试条件 截至目前为止 并无一套理论 可以预测结晶的条件 所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后 才可能得到一颗完美的单一 晶体 图一 蛋白质晶体的培养 通常是利用气相扩散法 Vapor Diffusion Method 的原理来达成 也就是将 含有高浓度的蛋白质 10 50 mg ml 溶液加入适当的溶剂 慢慢降低蛋白质的溶解度 使其接近 自发性的沈淀状态时 蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体 举例来说 我们将蛋白质溶于 低浓度 1 0 M 的硫酸铵溶液中 将它放置于一密闭含有高浓度 2 0 M 硫酸铵溶液的容器中 由气相平衡 可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度 进而达成结晶的目的 图二 蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处 但在晶体的内部 却有很大的差异 一般 而言 蛋白质晶体除了蛋白质分子外 其他的空间则充满约 40 至 60 之间的水溶液 其液 态的成分不仅使晶体易碎 也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现 造成晶体 处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点 但也由于高含水量的特性 让蛋白质分子在晶 体内与水溶液中的状态 极为相似 所以由晶体所解出的蛋白质结构 基本上可视为自然状态 下的结构 蛋白质结构解析的方法简介 到目前为止 蛋白质结构解析的方法主要是两种 x 射线衍射和 NMR 近年来还出现了一种新 的方法 叫做 Electron Microscopy 其中 X 射线的方法产生的更早 也更加的成熟 解析的数 量也更多 我们知道 第一个解析的蛋白的结构 就是用 x 晶体衍射的方法解析的 而 NMR 方法则是在 90 年代才成熟并发展起来的 这两种方法各有优点和缺点 首先来说一下 这两种方法的一般的步骤和各自的优点和缺点 电子显微镜 electron microsco py 作为一种新型的技术 目前的应用还是非常少 并且比较狭窄 我可能等到最后在给它作 些介绍 而且相信绝大多数人也没有听说过 也不会有很大的兴趣 首先是 X 晶体衍射 首先要得到蛋白质的晶体 通常 都是将表达蛋白的基因 PCR 之后克隆到一种表达载体中 然后在大肠杆菌中诱导表达 提纯之后摸索结晶条件 等拿到晶体之后 工作便完成的 80 将晶体进行 x 射线衍射 收集 衍射图谱 通过一系列的计算 很快就能得到蛋白质的原子结构 用 x 射线的优点是 速度快 通常只要拿到晶体 甚至当天就能得到结构 另外不受大小限制 无论是多大的蛋白 或者复合体 无论是蛋白质还是 RNA DNA 还是结合了什么小分子 只要能够结晶就能够得到其原子结构 所以 x 射线方法解析蛋白的瓶颈是摸索蛋白结晶的条件 这个时候运气就显的特别重要 关于 这个有好多有趣的离子 据说国外一个同学在摸索两个月无果之后 毅然去度假 就将蛋白扔 在一个很随便的地方 等度假回来之后 却发现已经结晶了 然后 来说一下 NMR NMR nuclear magnetic resonance 现象早已发现了很久 然后将这种方法用来解析蛋白结构 却是近一二十年的事情 不过到今天为止 用 nmr 方法来解析结构已经十非常成熟的方法 原理暂且放在一边 先说常规步骤 首先通过基因工程的方法 表达出目的蛋白 提纯之后 摸索一下蛋白稳定的条件 如果蛋白 没有聚合 而且折叠良好 便将蛋白样品 通常是 1mM 3mM 500ul Ph6 7 的 PBS 装入 核磁管中 放入核磁谱仪中 然后用一系列写好的程序控制谱仪 发出一系列的电磁波 激发 蛋白中的 H N13 C13 原子 等电磁波发射完毕 在收集受激发的原子所放出的 能量 其实 也是小磁场 通过收集数据 谱图处理 电脑计算从而得到蛋白的原子结构 它的优点就是 蛋白在液体中得到结构 是一个动态的结构 事实上所有在 pdb 中或者文献中 发表的 NMR 结构都是十个或者二十个结构的 ensemble 集合 这就是因为这些结构都是进 行能量优化后符合条件的结构 或者说就是溶液中的蛋白结构 因为是动态就很容易的研究蛋 白与其他蛋白或者配基的相互作用 缺点是 受大小的限制 到目前为止 NMR 解析蛋白结构 的上限是 50kd 无论是晶体还是 NMR 蛋白都要符合下面的条件 首先表达量要大 象 NMR 要求 1 个 mM50 0UL 这就要求十几个毫克 结晶要摸索很多的条件也需要大量的蛋白 所以蛋白一定要在胞 质中表达才行 其次 蛋白要折叠 我们知道许多蛋白 尤其是真核蛋白在大肠杆菌中是以包 含体的形式存在 这种情况下是不行的 除非复性 如果你的蛋白在胞质中表达 如果你不确 定是不是表达 可以从分子筛上的位置 或者扫 CD 确定一下 当然最简单的是做一个 NMR 一维谱 只需要几分钟 小于 20Kd 的蛋白可以考虑 NMR 因为 NMR 研究功能核相互作用方面是更加擅长的 而且不 需要结晶 现在速度也不慢 如果比较大 可以考虑晶体解析 对于用 NMR 来解析结构 最重要的条件就是非常昂贵的核磁谱仪 以及同位素标记蛋白 只 要采集了谱之后就算的得到