纳米药物 9、天然药物纳米制.doc

第9章 纳米中药91 概述中药为中华民族的生存和繁衍做出了不可磨灭的贡献。在人类回归大自然的国际潮流中，人们对自身的保健意识不断提高，世界各国对包括中药在内的天然药物日益重视。统计数据表明全球约有80的人以天然药物作为基本医疗保健手段，全球含中药在内的植物药销售额正以每年10%的速度递增，西方发达国家植物药市场的年增长率达到2O以上，大大超过了化学药品的增长速度1。 1997年，中共中央国务院关于卫生改革与发展的决定明确提出了“实现中医药现代化” 的战略目标，在传统中药产业中引入与应用纳米技术，将能有效地改善中药制备技术及剂型的不足，使传统中药向产业化、现代化、国际化方向发展。随着纳米技术对药物研究领域的不断渗透和影响，纳米中药、天然药物的研究开发已经具有了理论上的可能性和实践中的可行性。在国外，纳米技术已经应用到植物药的开发上，美国FDA登记的有关紫杉醇的11个在研制剂中，涉及纳米制剂的就有7个。在国内，作为天然药物资源丰富的国家，我国政府和科技人员十分重视将纳米技术引入中药领域，从而带来全新的中药加工方法和工艺，加速传统中药向产业化、现代化、国际化发展。国家科技部将“纳米药物新剂型的研究及产业化”列为“十五”科技攻关计划，目的就是以中药药物的有效部位为切入点，利用纳米技术给药系统和纳米剂型的优势，研究药物有效部位纳米化技术、药物纳米粒子的贮存技术、纳米技术控释剂的制备技术，建立一套与纳米给药系统相匹配、能最大限度发挥药物制剂“纳米效应”的制剂技术，研究相应的质量标准，开发纳米药物新剂型2。目前，纳米中药研究的对象主要在黄酮、皂苷、萜类、挥发油和甾体类等这些药理作用明确，现有产品的市场占有率较高药物上，适应症主要集中在心脑血管疾病、癌症、风湿性疾病、骨质疏松等这些未来医药市场的发展重心上。在我国，尽管中药纳米制剂的研究和应用尚处于初始阶段，但也已取得了一些令人瞩目的成绩。目前已有注射用紫杉醇脂质体、益肝灵纳米粒口服液（灯盏花素）、注射用熊果酸纳米脂质体、灯盏花素滴丸、康莱特注射液（薏苡仁油脂肪乳）等多个采用纳米技术研制的新药上市或进入临床。中药纳米制剂也逐渐成为专利申请的热点，从2002年开始的连续3年内，纳米技术应用于中药领域的申请每年约有40项左右，并且呈稳态的上升趋势。本章将对中药纳米制剂的特点、制备方法、有待解决的问题等方面加以阐述。92中药纳米化的目的纳米中药是指运用纳米技术制造的有效成分、有效部位、原药及其复方制剂3，它是中药制成纳米粒子后的产物。纳米技术在中药的研究与开发中的应用具有广阔的前景，纳米中药也是中药实现现代化乃至迈出国门的重要途径。中药纳米化的主要目的如下：1 增加药物溶解度，提高生物利用度，减少用药，节约中药资源药物产生的药理效应除与药物特有的化学组成相关外，与该药物制剂的物理状态同样密切相关。对于固体药物尤其是难溶性的固体药物而言，粒子的超细化对提高药物的生物利用度具有重要意义。药物制成纳米粒子后，大大增加了其暴露于介质中的表面积，促进了药物的溶解。由于载药纳米粒的粘附性及小的粒径，既有利于局部用药时滞留性的增加，也有利于提高药物与肠壁的接触时间和接触面积，且更容易穿透组织间隙，可大大提高有效成分的吸收速度和程度，从而增加生物利用度。把中药粉末或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中，其渗透性或溶解度将大大提高。杨祥良等4 利用惰性气氛的高能球磨装置，成功地制备了粒径小于100nm的纳米石决明。石决明平肝潜阳，清肝明目，其药用活性成分主要是Ca、Zn、Si等元素5。灌服纳米石决明粒子的动物，其血清中Ca、Zn、Si等元素的含量高于其它各非纳米组，说明石决明在纳米化后，机体对其吸收利用的程度增高，疗效可能增强。见图9-1、9-2、9-3。在纳米石决明组中上述3种元素在血清的时间含量曲线中均有一峰值，而非纳米的各组均无峰值,说明纳米石决明的生物利用度大大超过非纳米石决明，这正体现了纳米粒子的特性。图9-1 不同状态石决明各时点血清锌元素变化图9-2 不同状态石决明各时点血清钙元素变化图9-3 不同状态石决明各时点血清硅元素变化一般植物药的细胞壁是完整的，其有效成分中只有很小的一部分穿透细胞壁被人体吸收利用。通过对物料的冲击、碰撞、剪切、研磨、摩擦、分散等手段能把原料加工成微米甚至纳米级的微粉，在该细度下，细胞破壁率95，细胞破壁后，细胞内的有效成分充分地暴露出来，有利于溶出。例如，将黄连原料经不同方法粉碎后分别得到粒径D50分别为83.52m、3.23m、480.2nm的黄连常规粉体、超微粉体和纳米粉体，分别进行体外溶出度试验，结果溶出4h时黄连纳米粉体和超微粉体的小檗碱溶出量比常规粉体分别增加43.5%和29.8%，而且，随着黄连粉体粒径的减小，小檗碱的溶出速率加快，黄连超微粉体和纳米粉体中小檗碱溶出速率比常规粉体大，而纳米粉体比超微粉体表现得更加明显6。丁志平等7进行不同粒径黄连粉在大鼠体内药代动力学的研究结果显示，黄连纳米粉体组、超微粉体组与常规粉体比较A和Ka值显著增大，而Ke值无显著差异(P 0.05)，以纳米粉体中小檗碱的生物利用度为100%计，则超微粉体和常规粉体的相对生物利用度分别为82.42%和55.13%，表明黄连超微粉体与纳米粉体的生物利用度比常规粉体大。当以纳米粉体直接入药时，可溶性成分可以完全溶解于胃液，进入小肠后开始被吸收，由于颗粒超细，表面活性大，其不溶性成分也极易附着在肠壁上，快速被吸收，进入血液，且因附着力的影响，排出体外所需的时问较长，提高了吸收率，吸收量也会增加8。这样使药材真正地达到全利用，可减少用药剂量，提高生物利用度和药效，也能节省有限的药材资源，避免不必要的浪费，尤其对传统名贵药材的资源保护，具有极其重要的意义。2 实现缓、控释和靶向定位给药，降低毒副作用 中药毒性成分的蓄积问题最近受到社会的普遍重视，但有些中药由于其毒性成分就是有效成分，使其在制备和使用过程中均造成了一定的困难。采用纳米技术可控制它们的释放速度，增加它们的血浆清除率，为这些药物的使用开辟了新的前景。中药中的有效成分能否在靶器官蓄积到有效浓度一直是其研究中的一项难点。通过选用对机体或各种组织病变部位亲和力不同的载体制作不同粒径的载药纳米微粒，能使药物输送到期望治疗的特定部位。纳米级的载药徽粒进入机体后，大部分聚集在单核吞噬系统(MPS) 丰盈的组织中，尤其是肝脏，可作为肝靶向给药系统的载体。在普通纳米粒表面通过物理吸附或共价结合一层或多层亲水性聚合物，制成“隐形”纳米粒(stealth nanoparticles)，可避开肝脏巨噬细胞尤其是枯否氏(Kupffer)细胞的吞噬，延长在血液中的循环时间9。通过优化隐形纳米粒的表面性质或控制药物载体微粒的大小，可以靶向到除肝脏外的其他器官或组织，达到靶向治疗的目的。中药土贝母抗癌有效成分TBMS严重的细胞毒性和刺激性阻碍了该有效成分的深入研究与开发。孙毅毅等10以a一氰基丙烯酸正丁酯为载体材料，研制了TBMS的肝靶向纳米粒(TBMSPBCANP),制得D50为0.68m、大小较均匀的纳米粒，体外释放达平衡时间与t1/2分别较注射剂延长26倍和19倍。纳米粒结构主要分布在肝脏组织中，且纳米粒对肺和肝脏的毒性明显较注射剂低，同时血管刺激性较TBMS注射剂大大降低。杨凯等 11研制的平均粒径为85 nm的葫芦素BE聚乳酸纳米粒(CuBEPLANP)口腔癌周黏膜下注射研究结果显示，CuBEPLANP对口腔癌颈淋巴结转移灶具有良好的靶向性，提高了颈淋巴结转移灶内药物浓度和延长药物持续时间，增强了疗效，同时降低了药物的全身毒副作用。由于血脑屏障的存在，目前许多药物均不能在大脑达到有效浓度，抑或达到有效浓度时，外周的毒副作用已经出现。而纳米药物表面吸附吐温80等表面活性剂后，可使脑内浓度显著增高，有人认为这是由于药物躲避了网状内皮系统的吞噬作用，在脑血管蓄积的机会大大增加，从而使其更易通过血脑屏障。通过在纳米粒表面连接和血脑屏障具有高亲和力的配体，可能实现纳米粒的脑内定位给药，药物在脑内缓慢释放，避免了其外周的毒性12。一些中药如治疗头痛的引经药白芷，以经过表面修饰的纳米粒为载体，可输送药物通过血脑屏障，定向到达中枢神经系统起到更好的治疗效果。应用纳米技术可使某些药性剧烈而作用时间短的中药如麝香、樟脑等以合适的纳米粒包裹，在体内起到作用缓和持久，副作用小的效果。3 增强中药原有疗效甚至呈现新的疗效当颗粒尺寸进人纳米量级时，由于量子尺寸效应和表面效应，纳米粒子呈现出许多常态下所没有的新奇的理化和生物学特性。中药被制成纳米粒子后可能导致药物的理化性质、生物活性发生重要变化，使活性增强和产生新的功效。炉甘石纳米化后抑菌作用显著增强，与未纳米化的炉甘石比较，对金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌等细菌的抑制作用有显著差异13。灵芝是我国传统的名贵中药材，其具有抗肿瘤作用较强的活性成分及功能因子被包裹在极其微小的、直径只有6um，且具有坚韧双层包壁的灵芝孢子中。一般制剂及粉碎技术不能将其孢子破壁，也不能提取到其中的脂质活性物质。现在通过用高气流粉碎机粉碎至粒径呈纳米状态时，可将孢子破壁，使一部分原来不能释放出来的成分及功能因子被释出，并采用超临界二流体萃取技术，成功地萃取出灵芝孢子脂质活性物质，从而呈现新的疗效14。纳米技术在中药的外用制剂中亦具有广泛的应用前景。传统的中药透皮制剂多为硬膏、黑膏类，制备工艺简陋，药物吸收差，制约了中药透皮疗法的发展。皮肤是人体最大的器官之一，皮肤的间隙孔径多在20nm以下，角质细胞的通道孔径平均30nm。因此，将不易被人体皮肤和粘膜吸收的中药粗制剂做成纳米粒径的乳膏、贴膜和喷雾剂等透皮制剂，可增加药物通过皮肤间隙的穿透力和在吸收部位的吸收度。如天津研制的心宝贴膜中采用了超微乳化纳米级分散技术和贴膜贮库层辅料的纳米腔吸附技术，解决了中药易挥发性成分的纳米级分散和贮存技术工艺，临床总有效率为9615。4 改变中药传统的给药途径和剂型中药的给药途径主要是口服，纳米技术在中药制剂中的应用，将改变传统的给药方式并极大地丰富中药的剂型。对植物生理活性成分和有效部位用超音速干燥技术制成纳米级包囊，可将现有的复方中药改造成纳米级粉体，进一步加工成针剂、片剂、贴剂等。徐向田16发明的一种可防治非典的纳米中药，就是将金银花、黄芪、冬凌草等中药炮制后，采用微波萃取，减压浓缩和超高速射流技术，制成纳米中药粉剂。该纳米中药粉剂按要求制成合剂或注射剂后，体外试验发现有抗SARS病毒作用。5 改善液体药物的性能，提高其稳定性 挥发油是存在于植物体内的一类具有挥发性、可随水蒸气蒸馏、与水不相混溶的油状液体，具有多方面较强的生物活性。挥发油易挥发、易氧化、刺激性强、不稳定，若将其制备成纳米脂质体、微乳、固体脂质纳米粒等后喷雾干燥或冷冻干燥，或者将其包裹于环糊精中，制成一种粉末状的环糊精分子包囊，则可使挥发油液体药物固体粉末化，便于制成多种剂型，提高疗效。如武凤兰17采用喷雾干燥法制备的鸦胆子油干燥乳剂，具有良好的再分散性和稳定性。莪术油是由姜科植物郁金的根茎经水蒸气蒸馏而得的挥发油，呈浅黄或棕黄色，具有抗肿瘤、抗菌、消炎、增强免疫功能和抑制血栓形成的作用。但由于其具有很强的挥发性、不溶于水、味苦等缺点，限制了莪术油在临床上的应用。将莪术油制成环糊精包合物胶囊剂，可矫臭矫味，增大其水溶性，提高其生物利用度，防止莪术油挥发，增强莪术油的稳定性18。 9.3 纳米中药的制备纳米中药的制备是研究纳米中药的最基础也是最重要的问题。将纳米技术引入中药的研究时，不是简单地将药物进行粉碎至纳米量级，而是必须考虑药物的特性特别是中药组方的多样性及中药成分的复杂性，以及与其相匹配的载体的性能。例如：单味药可分为矿物药、植物药、动物药和菌类药等，有效部位和有效成分又包括无机化合物和有机化合物、水溶性成分和脂溶性成分等。因此，针对不同的药物及不同的剂型要求、用途等，在进行制备时必须选用合适的载体并采用不同的技术路线和制备方法。此外，如何在中医理论的指导下进行纳米中药新制剂的研究，也是进行中药纳米化时必须考虑的问题。 纳米中药的制备主要包含中药原药的纳米粉末和纳米载药体系两个方面，可采用多种现代制剂技术。下面就中药中的植物药、矿物药、动物药、菌类药及中药复方纳米制剂的制备分别进行介绍。9.3.1 植物药植物药是中药中数量最多、应用最广的一类药，也是采用纳米技术研究最多的一部分。目前纳米技术应用于中药领域的专利申请中，植物药约占65.48。根据植物药中有效成分、有效部位及原药材的理化性质及实际应用情况，常采取不同的制备方法。1 有效成分纳米技术在中药中的应用目前主要是在有效成分的研究上。有效成分由于是单一物质，在纳米制剂的制备、表征、质量控制、药理及毒理等方面的研究相对简单，通常将其制备成合适的纳米载要体系。抗肿瘤药物多具有一定的毒性，要求其制剂具有缓释、靶向特性以及延长在体内停留时间，因此常将其制备成纳米脂质体、聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒、微乳等（因本书第2章对抗肿瘤纳米药物有详细论述，在此仅作简单介绍）。陈大兵等19采用乳化蒸发低温固化法以硬脂酸为载体材料制备了长循环的紫杉醇Brij78固态脂质纳米粒(Brij78SLN)和Poronic F68固态脂质纳米粒(F68一SLN)，平均粒径分别为10429nm、22098nm，包封率分别为47、75。两种纳米粒都缓慢地释放药物，24 h后分别释放药物总量的8和20，且都可以延长紫杉醇的体内滞留时间，Brij78SLN，F68一SLN和紫杉醇注射剂的消除半衰期分别为4.88，10.06和1.36 h。张景勍20等用逆相蒸发法制备紫杉醇磁性长循环脂质体，平均粒径是640 nm，包封率是96.64，静注或腹腔注射对小鼠EMT-6肿瘤生长均有较明显的抑制作用，抑瘤作用较紫杉醇注射液提高；同时，可降低药物对心、肺、肾等器官的毒性，表明紫杉醇磁性长循环脂质体不同给药途径均有一定的肿瘤靶向性和缓释长效作用。水飞蓟宾、灯盏花素、丹参酮等用于治疗肝炎、心脑血管疾病的有效物质，人们将其制备成固体脂质纳米粒、聚合物纳米粒、微乳等纳米载药系统，以达到靶向、缓释等目的。水飞蓟宾(silvbin，SLB)作为理想的肝损伤修复药物，临床上广泛用于治疗急慢性肝炎、肝纤维化和早期肝硬化等肝病。徐希明21采用薄膜乳化高压均质技术制备的平均粒径为148.9nm的水飞蓟宾脂质纳米粒，小鼠灌胃给药后血及肝、脾、肺、肾、脑、心、胃中的水飞蓟宾体内分布研究结果表明，与市售制剂相比，脂质纳米粒可显著减少水飞蓟宾在胃中的滞留，增加其在血及肝中的分布，肝靶向指数为1.81，无疑有助于肝炎的临床治疗。罗国安等22采用微乳液聚合法制备了载灯盏花素聚丙烯酸纳米粒（粒径50nm左右），并采用膜扩散技术对其释放度进行考察。实验结果显示，在7h内，载药纳米粒中的灯盏化素基本全部释放，同普通片剂相比，具有一定的缓释释放性质。有效成分的外用纳米制剂常采用具有高扩散性和皮肤渗透性的微乳载药系统。Hass A23等用肉豆蔻酸异丙酯，卵磷脂和PEG200制备了OW型毛果云香碱微乳滴眼剂。该滴眼剂粘度低，动物刺激性试验表明该制剂对兔眼和鸡蛋壳均无刺激性。与毛果云香碱水溶液相比，该滴眼剂有较明显的缓释效果，从而使其生物利用度大大提高。治疗类风湿性关节炎的雷公藤内酯醇将其制成微乳凝胶后能增加药物的皮肤透过率并有缓释的效果，从而可以减少药物的使用量达到降低毒性的作用24纳米结晶和固体分散技术是制备难溶性药物纳米粒子的常用方法。采用纳米结晶技术制备的纳米混悬剂与传统剂型相比，除增加粘附性和晶体结构中无定形粒子外，还可使在水溶性和/或脂溶性介质中都难溶的药物的饱和溶解度及溶出速率大大增加，适合于多种途径给药以提高吸收或靶向性，尤其适合大剂量的难溶性药物的口服吸收或注射给药25。齐墩果酸是存在于女贞子等多种植物中的一种生物活性成分，具有保肝、抗菌、抗肿瘤、抗衰老等功效，为临床上治疗肝炎的有效药物，由于齐墩果酸的水难溶性使其口服生物利用度极低。杨祥良等26采用纳米结晶技术制备了齐墩果酸纳米混悬液。其平均粒径284.9nm，与原料药相比较，25时饱和溶解度提高了6倍。固体分散技术是将药物高度分散于惰性的载体中，形成一种以固体形式存在的分散体。药物在载体中以分子聚集体、微晶或无定形形式存在，粒径可达到1-100nm，可显著地增加难溶性药物的溶出，提高其生物利用度。杨祥良等27采用固体分散技术进行羟喜树碱固体分散体的制备及体外溶出研究，结果显示，熔融法制备羟喜树碱PEG6000的固体分散体溶出速率明显提高。2 有效部位中药、天然药物的挥发油、黄酮、多糖等是应用纳米制剂技术研究较多的有效部位，目前最常用的方法是将它们制成乳剂、脂质体、分子包合物，例如鸦胆子油静脉乳17、薏苡仁油脂肪乳剂（康莱特注射液）28、青蒿油纳米脂质体29、黄芪多糖脂质体30、肉桂油环糊精包合物31等。何海冰等32将莪术油制备成乳剂，粒径范围在50200 nm，包封率达到80以上。此外，固体脂质纳米粒也常作为以有效部位为原料的纳米制剂载药系统，例如水飞蓟素固体脂质纳米粒33、降香油固体脂质纳米粒34。3 原药材当原药材直接入药或作为提取原料时，为了提高药物的生物利用度和提高药材的利用率，常采用超细粉碎技术来制备纳米粉体。由于纳米药物粒子具有较高的表面能，极易产生团聚现象，具有化学不稳定性，同时其制备设备要求相当高，因此，对于大多数植物药而言采用超细粉碎技术难以制备得到纳米级的粉体。此外，将药材提取物制成纳米制剂的研究也有少量报道，通常采用载药量大的固体脂质纳米粒作为载药系统。翁婷等35采用熔融超声分散法将具有良好的抗炎、免疫抑制、抗生育、抗肿瘤及抗菌活性但毒性又较大的雷公藤提取物制成固体脂质纳米粒，平均粒径178.5nm，体外透皮实验发现透皮速率恒定，24h内未见突释效应，且24h累积透过率明显高于雷公藤贴膏透皮吸收的透过百分率。9.3.2 矿物药矿物药也是采用纳米技术研究较多的一类药物，目的是改进某些药物的难溶性、提高药物疗效，例如纳米雄黄、纳米炉甘石、纳米朱砂、纳米蒙脱石、纳米硫磺等，常采用的制备方法是超细粉碎技术。此外，还可采用化学分散法制备纳米矿物药。雄黄应用历史十分悠久，主要用于祛风除湿，解毒杀虫，入丸散或外用。雄黄的主要成分为二硫化二砷，难溶于水，服用方法一般是将其研磨成粉末入药，在胃肠道不易分解，仅极少部分被吸收。谢长生等36采用超细粉碎技术制备出粒径小于100 nm的纳米雄黄，实验表明纳米颗粒表现出尤为突出的生物效应。皮振邦等37采用微波条件下的化学分散法来制备纳米炉甘石即在高频电磁场的作用下，加入化学分散剂，促使碳酸锌(炉甘石主要成分)颗粒分散，所得到的纳米级粉体粒径分布为50100 nm。由于矿物药成分相对单一，能在保持原药成分的基础上，使药物有效成分被人体充分吸收，形成独具特色的纳米原料，进而还可以制备成各种制剂，例如纳米炉甘石凝胶38。9.3.3 动物药以动物贝壳入药的石决明、珍珠层粉等介类药因质地坚硬一般采用超细粉碎技术制成纳米粉体4，39，从动物中提取的有效成分及其衍生物则可根据其不同目的采用适当的纳米载药系统。张莉等40将去甲斑蝥素制成平均粒径为(449)nm的WO型微乳及注射液，与去甲斑蝥素注射液相比，实现肝脏较多药物分布，降低了肾脏分布，增强了去甲斑蝥素的疗效，降低泌尿系统毒副作用，并在一定程度上延长药物在小鼠体内的循环时间。9.3.4 菌类药当菌类药直接入药或作为提取原料时，为了提高药物的生物利用度和药材利用率，可采用超细粉碎技术将药材制成纳米粉体。从菌类药中提取的有效部位，如香菇多糖、冬虫夏草多糖、猪苓多糖等被用于肿瘤或肝脏疾病治疗时，多被制成脂质体，达到靶向和提高疗效的作用。王凯平等41将猪苓多糖制成长循环脂质体，平均粒径为100nm，药物包封率为55.3。9.3.5 中药复方 中药复方是充分体现中医药理论的代表，其疗效经过几千年的应用已得到充分肯定。古代医家在传统的中药水煎剂的煎制过程中，也考虑到因药物的性质不同采用不同的方式，例如含挥发性物质的药物煎煮时要后下，质地坚硬的药物要破碎或先煎，毒性药物须炮制等。随着科学技术的发展，纳米技术也像其它新技术一样正在不断应用到中药的制剂领域，针对药物的特性采取相应的制备手段，使药物发挥出更好的疗效。中药复方纳米制剂应根据处方中药味的特性及在处方中的地位综合考虑制备方法。例株洲千金药业有限公司将妇科千金片中的部分药物纳米化，以增强疗效，提高原药材利用率。大黄复方液体喷雾剂42由10味药材组成，由处方量药材所得到的挥发油较多，易在制剂中聚集而影响药物的物理稳定性，解决这个问题是保证该喷雾剂质量的关键。王新春等将处方量的挥发油形成微乳，有效地解决了挥发油的物理稳定性问题。9.4纳米中药、天然药物研究实例9.4.1 雷公藤内酯醇雷公藤内酯醇是从卫矛科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）、昆明山海棠(T. Hypoglaucum(Levl) Hukeda)、苍山雷公藤(T. Forretii Dials)以及东北雷公藤(T. Regelli Sprague et Taketa)等植物中分离得到的环氧二萜内酯化合物，又称雷公藤甲素、雷公藤内酯。它具有抗炎、免疫抑止、抗肿瘤、抗生育等药理活性，是雷公藤中的主要有效成分之一43-45。由于其生理活性强，具有显著的抗炎、免疫抑制、抗肿瘤及抗生育作用，在临床上已用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤病、肾脏等疾病等，最近研究表明其在器官移植抗排斥反应方面具有广阔的应用前景。但具有明显的毒副作用，其临床不良反应发生率高。毒副反应主要发生在消化系统、泌尿系统、生殖系统、心血管系统、皮肤、骨髓及血液系统等。由于其突出的毒副作用，在临床上的应用受到了极大的限制。由于雷公藤内酯醇在治疗类风湿性关节炎、银屑病等自身免疫性疾病方面的疗效非常肯定，因此，在保持雷公藤内酯醇生物活性的前提下，降低其毒副作用，是开发雷公藤内酯醇需解决的关键问题。科技部将其列入十五攻关计划纳米专项，拟通过纳米载药系统降低其毒副作用。该项目由华中科技大学药物研究所杨祥良教授负责，研究的内容有：雷公藤内酯醇微乳凝胶、雷公藤内酯醇聚合物纳米粒和雷公藤内酯醇固体脂质纳米，2005年已通过国家的验收。1 雷公藤内酯醇微乳凝胶剂微乳（Microemulsion）作为一种新型的纳米给药系统，具有稳定性好、溶解能力强、制备简单、易工业化、可用滤过法灭菌等优点，已用于多种给药途径的研究。在经皮给药系统中，微乳比普通制剂具有更强的透皮能力。雷公藤内酯醇是一个亲脂性小分子，临床使用剂量低，通过透皮给药，可以避免产生胃肠道毒副反应以及肝脏的首过效应等，降低血药的峰谷现象，提高治疗指数，增强长期用药的顺应性。但雷公藤内酯醇的皮肤刺激性较大（在浓度较高时尤为明显），因此必须选择合适的载体，使在给药浓度较低时，仍有较高的透皮速率，同时又能有效降低雷公藤内酯醇的皮肤刺激性。微乳作为一种具有促透皮功能的纳米载药体系，对雷公藤内酯醇透皮有较好的效果24。（1）雷公藤内酯醇微乳46 制备及表征 图9-4为油酸、聚山梨酯80、丙二醇和水组成的微乳伪三元相图，根据图示的微乳区，选择合适的微乳处方。将油酸与丙二醇混合均匀，加入雷公藤内酯醇，充分搅拌，使其完全溶解，形成油相。另将聚山梨酯80溶于水中，形成水相。混合油、水两相，搅拌均匀，即得雷公藤内酯醇微乳。图9-4 微乳载药体系的伪三元相图按不同比例制备的雷公藤内酯醇微乳（ME1ME4，ME5ME7），理化性质如表9-1所示。由表可知，ME1具有较低粘度和折射率。随着微乳中油和表面活性剂的含量增加，粘度和折射率均有增大。各微乳的pH均呈弱酸性，由于雷公藤内酯醇在pH小于3或大于8时，可能发生水解，微乳在该pH值下有利于药物的稳定。表9-1 各雷公藤内酯醇微乳的理化性质微乳多分散指数粘度 (mPaS)pH折射率ME10.2200.01413.50.85.730.041.3682ME20.3380.028432.40.76.580.031.4039ME30.1450.012104.00.55.350.031.3802ME40.3520.012722.00.85.940.021.4124ME50.1650.006103.50.55.350.031.3801ME60.1970.001104.00.45.350.031.3813ME70.2100.011104.30.65.350.031.3815各微乳的粒径如图9-5所示。微乳的粒径均在10150nm之间，90的微乳液滴粒径小于100nm。由图可知，油和总表面活性剂增加均使微乳的粒径增加。雷公藤内酯醇和透皮促进剂薄荷脑均为亲脂性物质，因此在制备微乳时将其加入油相，溶解后再加入水相。图9-5 各微乳的有效粒径示意图各微乳在37保存6个月，外观均无明显的变化，雷公藤内酯醇的含量以及粒径均无显著变化。高速离心实验表明微乳具有很好的物理稳定性。各微乳分别在15、25、37的条件下放置一个月，外观无明显的变化，而当微乳置于5下保存，则有明显的浑浊和相分离现象出现，而升高温度时，体系又可恢复形成微乳。透皮吸收研究各微乳组（ME1ME4）中或非纳米对照组中雷公藤内酯醇的透皮吸收速率及渗透系数如表9-2所示，雷公藤内酯醇的累积渗透曲线如图9-6所示。由图可知，雷公藤内酯醇微乳的经皮渗透行为符合零级渗透动力学过程。在第12h，ME1、ME3、ME4组的累积透皮量与对照组接近，在第24h时，则明显高于对照组。由累积渗透曲线可知，在第12h后，微乳组仍以稳态透皮速率透皮，而对照组的透皮速率明显下降。另外，ME2的透皮速率较低，在第12h时，透皮量明显低于对照组，而当24h时，由于其持续的透皮，其透皮量明显增大，与对照组无明显差别。表9-2 各微乳中雷公藤内酯醇的透皮吸收参数处方透皮速率(gcm2h-1) 渗透系数 (103 cm/h)ME11.51 0.156.040.60ME20.61 0.082.440.32ME31.58 0.126.320.48ME40.98 0.063.920.24对照组0.89 0.073.560.28 图9-6 微乳中雷公藤内酯醇的累积渗透曲线()ME1, ()ME2, ()ME3, ()ME4, ()对照组薄荷脑是一种烯萜类透皮促进剂，对皮肤无刺激作用，同时具有较好的芳香气味。考察了1薄荷脑的促透皮能力以及载药量对微乳中药物的透皮速率影响，结果如表9-3所示。在ME3中加入1的薄荷脑，即得ME6。ME6的透皮速率明显高于ME3，薄荷脑的透皮促渗作用明显。ME5、ME 6、ME 7的微乳组成相同，药物的含量分别为0.01、0.025、0.05，透皮速率分别为0.81、2.08、4.18gcm-2h-1，药物的透皮速率随着药物的浓度增加而增加。由图9-7的累积渗透曲线可知，微乳中药物在24h内的透皮扩散行为符合Ficks第一扩散定律。因此微乳用于透皮给药，具有稳态透皮时间长、透皮速率高、释药恒定的特点，能防止出现血药峰谷现象。表9-3 不同载药量微乳的透皮速率微乳透皮速率 (gcm-2h-1)渗透系数 (103cm/h)ME50.81 0.093.240.36ME62.08 0.108.320.40ME74.18 0.1216.720.48图9-7 促进剂对雷公藤内酯醇微乳透皮的影响 （）ME7, ()ME6,（）ME5皮肤刺激性研究考察处方ME6和非纳米组对照组中雷公藤内酯醇的皮肤刺激性以及空白微乳、20丙二醇水溶液的皮肤刺激性。家兔的皮肤刺激性实验发现，ME6组在第3、4天时皮肤发红现象较明显，此后皮肤逐渐恢复正常。而对照组导致了明显的红斑现象，具有明显的刺激作用。ME6的皮肤刺激性较低的原因可能是微乳对雷公藤内酯醇起到了包裹作用，减少了药物与皮肤的直接接触，降低了药物皮肤刺激性。由此可知，微乳作为雷公藤内酯醇的载体具有良好的应用前景。（2）雷公藤内酯醇微乳凝胶剂47微乳的制备取处方量的油、聚山梨酯80和丙二醇，充分混合后，再加入雷公藤内酯醇和薄荷脑，搅拌使其完全溶解，形成微乳油相。另取处方量的水，将水和油相混合，搅拌均匀后即得（处方微乳A、B）。微乳的有效粒径分别为43.01、22.2nm，最大粒径均小于100nm，微乳中聚山梨酯80的含量增加，其粒径有下降趋势。将微乳A、B稀释50倍后，测定其粒径分别为106.60、56.11nm，这表明微乳经稀释后粒径有明显的增加，但仍处于微乳区。微乳凝胶剂的制备将处方量的卡波姆940加入水中，充分溶胀后，用适量的三乙醇胺调节pH，搅拌均匀，制成透明的凝胶基质。将微乳A、B分别与适量的凝胶基质混合，充分搅拌后，即得0.003的雷公藤内酯醇微乳凝胶剂1、2。考察各处方的性状、pH值、稳定性（耐热、耐寒、离心实验）以及粒径（稀释50倍），结果如表9-4所示。表9-4 各微乳处方的理化性质处方序号耐热试验耐寒试验离心试验pH有效粒径（nm）1无明显变化乳白色固体无明显变化6.9087.282无明显变化乳白色固体无明显变化7.2298.13对照组无明显变化乳白色固体无明显变化6.90未检出对照组：含20丙二醇的卡波姆水凝胶剂由表9-4可知，各处方在-15条件下保存24小时后，均因水的冻结而变成乳白色固体，这表明微乳凝胶剂应在保存在0以上。而在60的条件下，各处方的性状均无明显变化，这提示微乳可在较高温度下保存。微乳凝胶剂的透皮吸收研究用透皮试验考察凝胶剂的透皮能力，雷公藤内酯醇的透皮吸收速率及渗透系数如表9-5所示。 表9-5 各处方的透皮速率及渗透系数处方序号透皮速率（gcm-2h-1）渗透系数(103 cm/h)10.0640.0042.130.1330.0400.0041.330.13对照组0.0180.0040.60.13 对照组是以20丙二醇溶液作为雷公藤内酯醇溶媒的普通水凝胶剂，雷公藤内酯醇的透皮速率最低。于非纳米的对照组相比，微乳凝胶剂1、2的透皮速率分别提高了3.55、2.22倍。与微乳凝胶剂2相比，微乳凝胶剂1的聚山梨酯80的用量明显降低，而其透皮速率明显高于微乳凝胶剂2，这表明表面活性剂的用量对药物的透皮有明显的影响，降低表面活性剂的用量有利于提高微乳凝胶剂中药物的透皮。2 雷公藤内酯醇聚合物纳米粒（TPPLANP）48-50在DDS领域中，可生物降解和生物相容性的聚合物纳米粒在缓释/控释药物、避免药物降解或泄漏方面显示了极大的应用前景。通过改变可降解单体的比例和聚合反应条件可调节聚合物在体内的降解，提高疗效，降低不良反应，提高药物的稳定性。将溶有适量聚乳酸和雷公藤甲素的丙酮无水乙醇所组成的有机相，搅拌下滴加到含有一定量Poloxmerl88水相中，滴毕，继续搅拌25 min，然后减压蒸出有机溶剂和一部分水，即得纳米粒胶态混悬液。在最优处方条件下制备的纳米粒呈圆形，形态规整（见图9-8），平均粒径为149.7 nm，多分散系数为0.088；采用冷冻离心和RP-HPLC法测定药物的平均包封率和载药量分别为74.27 和1.36 ；药物体外释放研究表明，0.5h以后药物缓慢从材料中释放。BA 图9-8 TP-PLA-NP的TEM照片（A，29 000）和AFM照片（B，三维图像） 雷公藤内酯醇聚乳酸纳米粒体外释放曲线见图9-9。从图中可看出，TP的释放呈现突释和缓释两个阶段。图9-9 TPPLANP体外释放曲线TPPLANPs对Wistar大鼠继发性佐剂关节炎的影响研究，结果表明，中剂量和高剂量纳米组可明显抑制AA大鼠的组织肿胀（p0.005），随着给药时间延长，抑制效果更好，在给药16d，其抑制率分别为32.9 %和 40.3 %，对于同一剂量的TPPLANPs组和TP对照组，其抑制效果没有显著性差异。图9-10是大鼠踝关节的病理学切片观察，低剂量的纳米组没有明显的治疗作用，中、高剂量对AA大鼠佐剂关节炎有较好的治疗效果。图9-10 大鼠踝关节的病理学切片观察 (100) A：正常大鼠； B：对照组； C： TP (0.1 mg/kg)； D： TP-PLA-NPs (0.1 mg/kg)；E：TP-PLA-NPs (0.05 mg/kg)；F：TP-PLA-NPs (0.2 mg/kg).TP产生毒副作用的主要部位是肝脏、肾脏和睾丸，进行TP-PLA-NPs对三种脏器的影响研究结果表明，对于同一剂量的AST和ALT酶的活力，BUN和尿蛋白的含量，TP-PLA-NPs组明显低于TP对照组，高剂量（0.6 mg/kg）有显著性差异（P 0.05），提示TP-PLA-NPs可降低TP引起的肝和肾毒性。纳米粒可降低肝和肾毒性可能是由于聚集在肝上纳米粒中的药物或相对较少聚集在肾上纳米粒中的药物缓慢释放的结果。图9-11显示了TP-PLA-NPs对睾丸组织的病理学变化，从图中可看出，高剂量的非纳米组引起睾丸病变明显重于纳米组，前者几乎所有曲细精管内各级生精细胞和精子消失，精子严重变性坏死，管腔内出现多个多核巨细胞。图9-11 TP-PLA-NPs对睾丸组织的病理学变化 (ig, 15 d). a, Control (200); b, TP-PLA-NPs (0.6 mgkg-1)200; c, free TP (0.6 mgkg-1)400.采用核磁共振方法研究TP及TP-PLA-NPs对大鼠代谢物的影响。结果表明，尿素、尿囊素、DMG和TMAO是TP引起肾毒性的重要标记物；乙酸、乳酸和甘氨酸是TP引起肝毒性的重要标记物；肌酸和肌酸酐是TP引起睾丸毒性的重要标记物。通过比较它们在5d、10d、15d的相对浓度，结果显示，TP对照组的尿素、尿囊素、肌酸和肌酸酐浓度明显低于TP-PLA-NPs，而DMG、TMAO、乙酸、乳酸和甘氨酸浓度明显高于后者，提示纳米组降低肝脏、肾脏和睾丸的毒性主要是改变了这些代谢物的相对浓度变化而引起的。3 雷公藤内酯醇固体脂质纳米粒51-53梅之南等采用乳化超声分散法制备了雷公藤内酯醇固体脂质纳米粒(TP SLN)， AFM照片（图9-12）显示，SLN呈圆球状或椭圆球状微球，分布均匀。激光散射法测定脂质纳米粒粒径在100200nm之间，平均粒径为116.1nm，Zeta电位值较高，说明该体系较稳定，纳米粒不容易聚集。 图9-12 SLN 的原子力显微镜（AFM，三维图像）TP-SLN经皮给药、抗炎活性、毒性、大鼠尿液代谢物核磁共振等研究结果表明：TP-SLN在12小时内累积透皮吸收率达78.5，而普通溶液为32.4，TP-SLN的粒径越小，抗佐剂性关节炎活性越强，且能明显降低血清中IL-1含量。说明TP-SLN透皮给药后，可以延缓药物的释放，提高药物疗效。TP-SLN灌胃和腹腔注射的LD50值均高于TP对照组（TP溶液）；TP对照组能显著降低SOD和GSH-Px的活性，并能提高MDA、ALT、AST、BUN、Cr的含量，而TP-SLN则无显著性差异；组织病理学检查和琼脂糖电泳研究结果显示，SLN能降低TP对肝、肾等组织的毒性。大鼠尿液代谢核磁共振研究进一步证实TP-SLN对大鼠肾小管损伤较TP对照组小，能降低TP对肝脏的毒性。9.4.2 鬼臼毒素鬼臼毒素是从小蘖科鬼臼属植物中提取到的木脂类抗肿瘤成分。体外、体内试验已证明有抗肿瘤活性，能抑制微管聚合，抑制细胞核有丝分裂，使其停止于中期。外用治疗尖锐湿疣的体外药效试验证明能抑制培养的正常人皮肤角质形成细胞和宫颈癌上皮细胞的脱氧核苷掺入和DNA合成，阻碍其分裂和增殖。鬼臼毒素治疗尖锐湿疣起效快、疗效好，治愈率高，其靶部位是皮肤表皮层中的棘层，是治疗尖锐湿疣的一个理想药物。鬼臼毒素常用剂型为含药0.5%的酊剂和软膏剂，但在治疗过程中，常见的副作用是用药部位有疼痛与刺激，包括皮肤红斑、糜烂、水肿，若大面积使用将产生严重的全身性吸收毒性，包括头晕、恶心、呕吐、腹泻、腹痛、血小板减少、白细胞降低、肝功能异常、共济失调及外周神经麻痹等。但这些毒副作用限制了其在临床中应用，为了有效地治疗尖锐湿疣，必须降低制剂对皮肤的刺激性，增加鬼臼毒素在靶器官（皮肤）中的滞留时间，促进药物在皮肤中的吸收，降低进入血液循环的药量。华中科技大学、第一军医大学等单位对鬼臼毒素的纳米制剂进行了研究。1 鬼臼毒素固体脂质纳米粒54制备与表征（1）超声波法: 将取处方量的固体脂质，加热至固体脂质的熔点之上10C，待固体完全熔融后，再加入药物，使之溶解直至熔融体变得透明。将表面活性剂溶于热水（与熔融体同温），形成均匀的水相。将熔融体与水相混合，并高速搅拌30min，使其形成热初乳。将热初乳置于超声波细胞粉碎仪中，于400W的功率下超声分散5次，每次4分钟，在超声过程中应保持体系温度在固体脂质的熔点之上。超声完毕后，自然冷却，即得SLN水分散体55。(2)高压乳匀法: 按(1)方法制备热初乳液，将热初乳液输入高压均质机中均质（一级压力为800bar，二级压力为70bar），均质过程中应保持体系温度在固体脂质的熔点之上。均质完毕后，自然冷却，即得SLN水分散体56。用高压乳匀法和超声波法分别制备鬼臼毒素SLN，其平均粒径分别为73.4、179.5nm，粒径分布如图9-13所示。高压乳匀法制得的SLN的形貌为球形，原子力成像照片如图9-14所示。图9-13 鬼臼毒素SLN的粒径分布图.（左侧为高压乳匀法，右侧为超声波法） 图9-14 高压乳匀法制备的鬼臼毒素SLN的形貌图 鬼臼毒素SLN皮肤靶向性研究用鬼臼毒素SLN（浓度为0.15）、市售的0.5酊剂和自制的0.15酊剂进行经皮渗透研究，比较鬼臼毒素SLN的皮肤靶向能力。实验结果显示，载药SLN在皮肤中的滞留量明显高于其它两个酊剂，其滞留量分别是0.15和0.5酊剂滞留量的2.347、3.406倍。虽然0.5酊剂的药物含量较高，但其皮肤滞留量却最低。由载药SLN的滞留量可知SLN能有效地促进药物进入皮肤，提高靶部位的吸收。0.5酊剂的透皮速率为0.076gcm-2h-1，第8h时的累积透皮量为0.377gcm-2，有明显的系统性吸收。而载药SLN和0.15酊剂的接收液中均无鬼臼毒素，这表明药物均未能透过皮肤，主要滞留在表皮中，但SLN的滞留量更大，皮肤靶向性最强。2 鬼臼毒素脂质体涂膜剂57-58制备与表征精密称取鬼臼毒素50mg，大豆卵磷脂400mg，胆固醇100mg，维生素E 8mg加入100ml圆底烧瓶中，以二氯甲烷充分溶解，置于旋转蒸发仪上，旋转蒸发仪连接循环水式真空泵，将烧瓶置于水浴中，水浴温度40，转速120rpm，负压维持在2030kPa，旋转蒸发至二氯甲烷挥发干净，瓶壁上形成一薄层亮黄色脂质膜，加入5ml乙醚溶解脂质膜。再加入pH74的PBS液5ml，超声水浴3min，得到乳白色凝胶，再置于旋转蒸发仪上减压蒸发除去有机溶剂形成鬼臼毒素脂质体混悬液(a液)。将壳聚糖03g加入5ml的3稀醋酸中充分搅拌并过夜即制得淡黄色粘稠的壳聚糖溶液(b液)。将a液和b液混合搅拌即制得0.5的脂质体鬼臼毒素涂膜剂。取鬼臼毒素脂质体混悬液适量以生理盐水稀释，测定多数脂质体的粒径在200800nm之间，平均粒度350nm。以HPLC法测定脂质体中鬼臼毒素的平均包封率为763。稳定性观察将脂质体鬼臼毒素混悬液置于4冰箱中，3个月后测定包封率为75.8，6个月后的包封率为73.4；将脂质体鬼臼毒素混悬液置于室温下6个月肉眼可见黄白色沉淀，包封率下降为49.7。而将脂质体鬼臼毒素涂膜剂分别置于4冰箱中和室温下6个月，外观均未见沉淀、变色等变化。表明将脂质体涂膜剂较混悬液的稳定性高。将制备的鬼臼毒素脂质体混悬液分别置于37和100条件下1小时后测定其包封率，结果前者包封率下降26.9，后者下降98.7。表明鬼臼毒素脂质体混悬液具有热不稳定性。刺激性试验将脂质体鬼臼毒素涂膜剂分别涂于10只家兔的阴道宫颈处，每只涂药0.5ml，并以等量的0.5鬼臼毒素酊剂作为对照，分别在12、24、48h观察家兔阴道粘膜情况，结果观察药物涂于阴道后形成粘着性薄膜，未见明显的充血、糜烂等粘膜刺激表现，而对照组粘着性差，有4只出现阴道宫颈粘膜充血水肿，并且有一只出现轻度糜烂。皮肤靶向性研究大鼠用1苯巴比妥钠腹腔注射麻醉后俯卧位固定大鼠于揲作台，选取背部两侧对称部位约1.5cm1.5cm作为涂药区，电动剃须刀剃净鼠毛，3()只大鼠从130随机编号，单数左侧涂抹0.5脂质体鬼臼毒素混悬液，右侧则涂抹0.5鬼臼毒素酊剂，双数与之相反，用1 mL注射器吸取药物，每只涂药量均为0.25ml。用小玻璃棒轻轻涂抹药物约20 s，使药物分布均匀单侧涂药面积约1.0cm1.0cm。分别于取标本前1、2、4、6、12、24 h单剂量涂药，每一时间涂5只大鼠。在同一时问用颈椎脱臼法处死大鼠剪取涂药中心区域大小约0.5cm0.5 cm的皮肤组织用PBS液洗