聚丙烯酰胺凝胶 配制方法.doc

5TBE（组份浓度：5TBE，pH 8.3；配制量：1 L）：称取53.9 g Tris，27.5 g硼酸，量取20 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，充分搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。10% 过硫酸铵（组份浓度：10% (W/V) 过硫酸铵；配制量：10 ml）：称取1 g过硫酸铵，置于1050 ml烧杯中；加入约8 ml超纯水，搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至10 ml；4 保存（保存时间为2周左右，超过期限过硫酸铵将失去催化作用）。30% 丙烯酰胺（组份浓度：30% (W/V)丙烯酰胺；配制量：1 L）：称取290 g丙烯酰胺，10 g N,N-亚甲基双丙烯酰胺，置于1 L烧杯中；加入约600 ml超纯水，水浴加热至37 ，充分搅拌至溶解；加超纯水将溶液定容至1 L，用0.45 m滤膜过滤除去杂质；并检测该溶液pH值应不大于7；棕色瓶4 保存。0.1% AgNO3（组份浓度：0.1% (W/V) AgNO3；配制量：1 L）：称取1 g AgNO3，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水， ；加超纯水将溶液定容至1 L；棕色瓶室温保存。显色液（组份浓度：2% (W/V) NaOH，0.04% (W/V) Na2CO3，0.4% (W/V) 37%甲醛；配制量：1 L）：称取20 g NaOH，0.4 g Na2CO3，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，充分搅拌溶解；加4 ml 37%甲醛溶液，加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。10% 冰乙酸（组份浓度：10% 冰乙酸；配制量：1 L）：量取100 ml冰乙酸，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，搅拌混匀；加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。2.2.6 电泳检测2.2.6.1 玻璃板清洗首先用去污粉将电泳用玻璃板、胶垫、梳子等反复清洗；然后用级蒸馏水漂洗23次，直至玻璃板表面出现均匀水膜，既不聚成水滴，也不成股流下；再用超纯水漂洗1次，晾干；最后用无水乙醇擦拭，晾干备用74。2.2.6.2 缓冲液贮液和凝胶母液的制备缓冲液贮液用5TBE，具体配制方法见2.1.2.2，用时稀释5倍。凝胶母液用30%丙烯酰胺，具体配制方法见2.1.2.2。2.2.6.3 聚丙烯酰胺凝胶的制备10% 非变性聚丙烯酰胺凝胶（两块，约55 ml）各组分用量如下58：30% 丙烯酰胺：18 ml5TBE：11 ml超纯水：25 mlTEMED：36 ml10% 过硫酸铵：385 ml具体操作步骤如下75：首先，按要求组装好垂直电泳板，两块玻璃板的底部用1.5% 琼脂糖封边，防止封闭不严而导致聚丙烯酰胺胶液漏出。然后，灌胶。分别量取配比用量的30% 丙烯酰胺、5TBE和超纯水置于100 ml烧杯中，用玻璃棒搅拌混匀；然后用微量加样器加入配比用量的10% 过硫酸铵和TEMED，加入后聚合即开始，迅速摇匀；立即用玻璃棒引流，将混合液灌注于两块玻璃板之间，灌胶过程一次性完成，避免产生气泡；灌胶完成后，一次性平稳插入样梳以形成点样孔。最后，待聚合完全后往电泳槽中加入1TBE缓冲液直至没过点样孔，且正负极槽内缓冲液高度应一致。聚合时间一般在3060 min左右，凝胶聚合完全的标志是点样孔附近形成清晰的界面，轻轻拔去样梳，避免破坏点样孔，并立即用电泳缓冲液冲洗点样孔，以清除点样孔中的气泡和未凝固完全的胶液。2.2.6.4 电泳取PCR扩增产物5 ml与1 ml上样缓冲液混合均匀后点入点样孔，用10% 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以20 bp DNA ladder（Takara）作为分子量标准，缓冲液为1TBE。接通电源，恒压180200 V，电泳810 h，直至溴酚蓝距离凝胶边缘约1 cm时，停止电泳。2.2.6.5 银染、显色具体步骤如下76-78：（1）卸下玻璃板，用塑料薄片撬去上面一块玻璃板，并小心除去下方的琼脂糖凝胶；然后将附有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板以凝胶面朝下浸入盛有约200 ml超纯水的玻璃器皿中，凝胶即脱落于水中，轻轻摇晃15 sec，倒掉液体；（2）加入约200 ml 0.1% AgNO3，置于摇床之上，以轻摇20 min左右，倒掉液体；（3）加入约200 ml超纯水，轻摇15 sec，倒掉液体；（4）加入约200 ml显色液，轻摇510 min，直至出现清晰带型，倒掉液体；（5）加入约200 ml超纯水，轻摇15 sec，倒掉液体；（6）加入约200 ml 10% 冰乙酸，固定；（7）用Bio-Rad紫外凝胶成像系统观察，照相以记录电泳结果。1.4.3 聚丙烯酰胺凝胶改进的银染方法(1) 电泳结束后切断电源, 从电泳槽中倒出缓冲液, 然后取下胶板, 将凝胶从玻板中取出放入装有蒸馏水的瓷盘中, 用蒸馏水漂洗2 次。(2) 银染: 加入染色液(0.2%的AgNO3、1%的冰醋酸、1