转录因子基因Mfhb-1的表达对苜蓿体细胞胚胎发生过程中营养元素含量的影响.doc

转录因子基因Mfhb-1的表达对苜蓿体细胞胚胎发生过程中营养元素含量的影响摘要：基因是在苜蓿体细胞胚胎发生诱导早期经扣除杂交得到的 类转录因子基因，相关研究表明，基因在苜蓿体细胞胚胎发生诱导的早期可能发挥重要作用。为了进一步探讨基因的生物学功能与营养元素吸收的关系，试验以经，诱导的苜蓿幼嫩叶片的叶肉细胞为材料，利用电感耦合等离子体发射光谱技术，对基因的正义、反义转化植株体细胞胚胎发生发育过程中的种营养元素含量进行了测定。结果显示，基因的表达可能在苜蓿体细胞胚胎发生诱导初期促进了对元素的吸收，同时抑制了对、元素的吸收；、等元素的含量变化可能受基因表达的影响较小。不过基因表达与营养元素吸收的关系，以及进而如何影响苜蓿体细胞胚胎发生的详细分子作用机理等有待于进一步研究。关键词：苜蓿；基因；转录因子；体细胞胚胎；营养元素；电感耦合等离子体发射光谱技术 ， ， ， ， ， （ ， ， ， ， ； ， ， ， ）： ， ， ， （） ， ； a， ， ， ， ： ； ； ； ； ； 苜蓿（ ）是研究植物体细胞胚胎发生的典型模式植物之一，基因是在苜蓿体细胞胚胎发生诱导早期，经扣除杂交得到的 同源异型域亮氨酸拉链蛋白（hemeodomain leuzine zipper，hd-zip）类转录因子基因。为了研究该基因的生物学功能，在前期利用正义、反义转化技术将该基因导入到了苜蓿中，并已得到该基因过量表达和低量表达的转化植株，。转录因子对各种功能基因的调控作用可能受到光照、植物激素、低温等逆境条件的影响。营养元素是植物体内一系列生理生化反应的关键辅助因子，因而在参与调控植物早期生长发育及其植物形态构建的过程中发挥着重要作用。前期研究结果显示，基因的表达可能与苜蓿体细胞胚胎发生过程密切相关，但具体的分子机理尚不清楚。本研究利用电感耦合等离子体发射光谱（ ，）法检测基因正义、反义转化植株体细胞胚胎发生过程中的种营养元素含量，以探讨的过量表达或低量表达对苜蓿体细胞胚胎发生过程中营养元素的吸收产生的影响，从而确定在苜蓿体细胞胚胎发生过程中该基因表达与营养元素含量变化的关系，进而为全面揭示基因作用的分子机理提供相关的研究方法和理论依据。 材料与方法 植物材料试验所用的苜蓿材料共有 种，分别是、；其中为苜蓿未转化的材料，作为试验的对照；、和是以 为起始材料经转化得到的转化体，为携带基因编码区反向序列的反义转化植株；为携带 基因编码区序列的正义转化植株；为携带全长 基因，包括编码区以及该编码区上游的保守序列开放阅读框（upstream open reading frames，uorf）序列的正义转化植株。 种苜蓿材料均在固体培养基、 、光照时间 的条件下进行试验材料的扩大培养。参照等建立的的苜蓿直接体细胞胚胎发生体系，取培养 的植株，剪下靠近顶端的叶片约 片，在含有少许 培养基的培养皿里切成小块，然后吸出液体，把切碎的叶片转入含有 （， ）培养基的 三角瓶里，进行液体悬浮振荡培养，直接诱导其体细胞胚胎发生，诱导时间为 。然后转入 培养基中，使前期叶肉细胞悬浮培养物继续发育，每 更换培养基一次，共发育培养 。培养条件为温度 、光照时间1 、转速为 。在苜蓿体细胞胚胎发生诱导培养的开始、第五天、第十天、第十五天、第十八天和发育培养的第十天、第二十天、第三十天分别取材，并称取 培养物，次重复，经液氮速冻后放入超低温冰箱（ ）中保存，待用。将材料从超低温冰箱中取出后放入烘箱中， 杀青 ， 烘干至恒重，转移至瓷坩埚中，用马弗炉 炭化 、 灰化 ，至灰化完全（无黑色颗粒）后取出冷却，加 （，体积比）混合液混匀，在电阻板上加热至完全溶解，定容至 。 基因结构基因正义与反义结构如图所示，在图中， 为携带基因编码区上游的开放阅读框（）序列； 为基因反义编码区， 植株携带该片段； 为基因正义编码区（），植株携带该片段； 为基因全长序列（开放阅读框编码区序列），植株携带该片段。 主要试剂与设备、均为分析纯，由天津德恩化学试剂有限公司生产；试验用水均为超纯水，由德国公司 超纯水机现制现用。使用 电感耦合等离子体原子发射光谱仪（美国公司），垂直观测，观察位置自动优化；双阵列背投式固态检测器光学系统、材料雾化器、内置式三通道蠕动泵、 自激式固态高频发生器、空气切割消除尾焰技术系统、循环水冷却系统等均为实验室原已具备的仪器。营养元素标准溶液储备液为、 混合标准液，浓度均为 （德国默克公司）。将标准储备液用体积分数为 的 逐级稀释，、等混合标准液按、 梯度进行配制。 工作参数用检测样品溶解液中、的离子浓度，仪器工作参数分别是工作功率 、辅助气体流量 、冷却气体流量 、载气 、进样泵流量 ， 结果与分析 分析波长的选择及背景的校正法对每种营养元素的测定都可以同时选择多条特征谱线，且具有同步背景校正功能。因此，试验过程中对每种检测营养元素同时选取条谱线进行测定，综合分析强度、干扰情况及稳定性，选择谱线干扰少、精密度高的分析线。各营养元素的分析波长选择结果分别是 、 、 、 、 、 、 、 、 、 。 回归方程和相关系数按选择的工作条件检测各营养元素在配制好的系列梯度浓度的标准品混合溶液下的峰面积，用峰面积（）对标准液浓度（，）绘制标准工作曲线。各营养元素的线性方程和相关系数见表。 样品测定结果经检测，种苜蓿材料中元素和元素含量的测定结果为负值，低于系统检出限；其他种营养元素的测定结果见图，其中图为元素的含量动态变化，图为元素的含量动态变化，图为元素的含量动态变化，图为元素的含量动态变化，图为元素的含量动态变化，图为元素的含量动态变化，图为元素的含量动态变化，图为元素的含量动态变化。由种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中各营养元素含量动态变化可以看出，元素在种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中均表现出先下降后上升再下降并保持平稳的变化趋势，在诱导培养阶段的第五天，种苜蓿材料的元素含量由高到低表现为、；在诱导培养后期（ ），和的元素含量上升，和的元素含量保持平稳的态势。元素含量在种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的动态变化较为复杂。在体胚诱导培养阶段内，除表现出先下降后上升的趋势外，、和均表现出先上升后下降的变化，而的峰值在诱导培养阶段的第十天出现，早于的第十五天，也早于f4的发育培养阶段第十天。元素含量在发育培养阶段的初期（发育培养 ）还有一个高峰出现，此时种苜蓿材料的元素含量由高到低分别为、。元素含量在种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化波动较为复杂，和大致表现为在诱导培养阶段的第五天有一个高峰，然后下降，最后在发育培养阶段的末期有一个小幅上升；的元素含量在诱导培养阶段峰值出现前有一个下降的过程，诱导培养的第五天开始迅速上升，诱导培养的第十天达峰值后开始下降，在发育培养阶段表现出与和类似的变化趋势；的元素含量在诱导培养阶段一直增加，在发育培养阶段开始后才表现出下降趋势。元素含量在种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化十分明显，除了的峰值出现在诱导培养阶段的第十天外，其他种材料的峰值均出现在诱导培养阶段的第十五天，种材料在诱导培养阶段的元素含量峰值由高到低分别为、。而在发育培养阶段开始后，4种苜蓿材料的元素含量基本上一直处于很低的水平，并且保持平稳。元素含量在种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化跌宕起伏，、都表现为在诱导培养阶段先下降后上升再下降的变化趋势；进入发育培养阶段后，都是先上升后下降；以材料的元素含量最高，峰值出现在诱导培养阶段的第十五天；其次是材料，元素含量峰值出现在诱导培养阶段的第十天；第三是材料，元素含量峰值出现在发育培养阶段的第十天；而材料的元素含量峰值出现在诱导培养阶段的第十五天。到发育培养阶段结束前 （发育培养 ），种材料的元素含量都处在最低值，并且一直维持到发育培养阶段结束。元素含量在种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中基本上处于下降的趋势，种材料的元素含量峰值大都没有超过诱导培养阶段的起始水平；到发育培养阶段结束时（发育培养 ），种苜蓿材料的元素含量由高到低分别为、。元素含量在苜蓿种材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化起伏很大，在发育培养阶段结束前 （发育培养 ），与元素含量的变化趋势基本一致，4种材料的fe元素含量大都处在最低值；但在发育培养 后，种材料的元素含量出现了戏剧性的变化，其含量水平大幅上升，最后都超过了前面水平，达到了峰值，此时种苜蓿材料的元素含量由高到低分别为、。元素含量在种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化趋势和元素正好相反，其在诱导培养阶段基本上都处在较平稳的状态，而一进入发育培养阶段，种材料的元素含量立即大幅度上升，峰值出现在发育培养阶段的第十天，而后迅速下降，到发育培养阶段结束时，又恢复到诱导培养阶段的水平。种材料的元素含量达峰值时由高到低的排序为、。 讨论 基因的表达对苜蓿体细胞胚胎发生发育的影响苜蓿种材料体细胞胚胎发生发育的显微观察，显示，在诱导培养阶段的第十天，和的表面会形成一些突起结构；在第十五天时，和表面才出现微小的突起结构。在发育培养阶段，和的表面白色组织增多，且培养液浑浊不清，在发育培养的第三十天时，观察到培养物中出现一些小的子叶胚，而其他种材料多是鱼雷胚。在发育培养的第二十八天时，统计种材料的体细胞胚胎数目，由高到低依次为、。上述结果表明，基因编码区的表达可能促进了苜蓿体细胞胚胎胚性细胞的诱导，从而促进了苜蓿体细胞胚胎的发生，而的表达可能对该基因的表达有一定的抑制作用。 基因的表达对苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中营养元素含量的影响基因的表达可能促进了苜蓿对元素的吸收。由图可以看出，在苜蓿体细胞胚胎发生发育进行诱导培养的第五天，种材料的元素含量由高到低依次为、，这与苜蓿体细胞胚胎发生发育情况和最后（发育培养的第二十八天4，5）体细胞胚胎数量所观察到的排序结果相吻合。在诱导培养后期，和的元素含量上升，和的元素含量保持平衡，说明元素对胚性细胞的形成可能有一定的促进作用，由此可推测基因的表达可能促进了苜蓿体细胞胚胎诱导后期阶段对元素的吸收。基因的表达可能促进了苜蓿对元素的吸收。图表明，元素含量在苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中的变化较为复杂。除表现出先下降后上升的趋势外，、和均表现出先上升后下降的趋势，而的峰值在诱导培养阶段的第十天出现，早于的第十五天，也早于f4的发育培养阶段第十天。在发育培养的初期，种材料的元素含量由高到低表现为、，并且与最后所观察到的体细胞胚胎数目排序情况类似；由此可推测 基因的表达可能促进了苜蓿对元素的吸收。基因的表达可能促进了苜蓿对元素的吸收。图揭示，元素含量在苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中变化波动较为复杂，在诱导培养阶段的第五天，除了的元素含量呈下降趋势外，其他种材料的元素含量均呈上升趋势，其中上升的最迅速；该现象可能是由于的表达而导致的元素含量峰值较与 滞后。结合体细胞胚胎发生发育观察结果，可以推测基因的过量表达可能在苜蓿体细胞胚胎发生诱导的初期，就促进了苜蓿对元素的吸收。基因的表达可能抑制了苜蓿对元素的吸收。由图可以观察到，元素含量在苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中的变化十分明显，除了的峰值出现在诱导培养阶段的第十天外，其他种材料的峰值均出现在诱导培养阶段的第十五天，且种材料在诱导培养阶段元素含量峰值由高到低表现为、，与最后的体细胞胚胎数目统计结果呈反比关系。由此表明，高含量的元素可能不利于苜蓿胚性细胞的分化，由此可推测基因的表达在苜蓿体细胞胚胎发育培养阶段初期就可能抑制了对元素的吸收。在、和这种材料中，元素、元素、元素、元素含量在苜蓿体细胞胚胎诱导和发育过程中的变化大体趋于一致，表明 基因的过量或低量表达，对、元素的含量变化影响不明显。 主要营养元素对体细胞胚胎发生发育的影响目前对营养元素在体细胞胚胎发生发育中的具体生物学功能的研究较少，主要集中在与体细胞胚胎发育模式相似的合子胚上。如许淑苹在研究杉木cunninghamia lanceolata（lamb.）hook合子胚的发育时发现，元素的含量在合子胚发育进程中呈小幅上升变化；元素含量总体上呈较大幅度上升；、元素含量呈先下降后上升的变化；元素含量在体胚发育的后期呈持续上升趋势，而后达到最高值；和元素含量较低，元素的含量不超过 ，元素的含量不超过 。甄艳等在研究湿地松（pinus elliottii engelmann）加勒比松（p. caribaea morelet）的杂种合子胚发育过程中，发现、和元素在胚胎发育早期的合子胚中含量最高；、和元素呈相似的变化趋势，在发育开始后先小幅下降而后随胚发育逐渐上升；元素在合子胚发育早期的含量较高，随后下降，而后大幅度上升，在合子胚发育后期达到最大值。本研究发现，对照材料的体胚发育培养 后，、元素含量随着胚胎的发育不断升高；元素含量总体变化不大；、元素含量峰值均出现在体细胞胚胎诱导或发育的中间阶段，mg元素含量峰值出现在体胚诱导末期；mn元素含量峰值出现在体胚发育初期。已有研究发现，高浓度的钠离子可以使蛋白变性，也可以影响细胞质中蛋白质的功能。液泡缺少钠离子将会削弱酶的功能，也会限制生长发育。拟南芥（arabidopsis thaliana l.）基因在胚胎形成后期表达，它编码的核内靶蛋白可以增加胚胎形成后期的阳离子容量，当该蛋白在拟南芥中过量表达时还可以促进拟南芥萌芽的发生。钙离子对于调节植物渗透压扮演着重要的角色，不同的植物细胞对钙离子存在不同的响应，一般情况下，钙离子在细胞信号传导过程中起到中心作用，如在组织培养中，钙离子的浓度变化体系中含有大量胚胎表达的钙离子依赖蛋白激酶。铁是植物生长发育所必需的元素，主要作为结构螯合物或金属蛋白存在于植物组织中，常参与氧化还原反应，然而铁的不溶性限制了它的吸收；通过细胞质膜三磷酸腺苷酶的细胞外酸化，可以帮助将铁泵进细胞内，铁被膜还原酶还原成二价铁离子，然后转运进细胞内。黄立皓研究发现，、和离子含量的增加可以提高愈伤组织中细胞的渗透势，促进细胞中遗传物质的形成，从而提高愈伤组织分化率。等在研究卵叶车前（ ）体胚与非胚性愈伤组织中营养元素含量时发现，高含量的、和是体胚形成的关键因素。本研究发现，在对照材料体细胞胚胎的发育过程中（转入发育培养基 之后），体细胞胚胎发育培养物中的、元素含量不