倒卵叶五加及其复方佳蓉片对大鼠的抗衰老作用

倒卵叶五加及其复方佳蓉片对大鼠的抗衰老作用摘要目的观察倒卵叶五加及其复方对亚急性衰老大鼠血清丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活性、总抗氧化能力（T-AOC）以及睾丸组织中NO、iNOS含量的影响。方法60只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、倒卵叶五加组、佳蓉片组和维生素E组，每组12只。D-半乳糖连续腹腔注射建立亚急性衰老大鼠模型，各组大鼠在腹腔注射D-半乳糖（正常组动物注射等量生理盐水）的同时，正常和模型组大鼠灌胃生理盐水10mL/（kgd）、其他各组依次给予倒卵叶五加1g/（kgd）、佳蓉片6g/（kgd）、维生素E20mg/（kgd），用药50d。分别检测各组大鼠血清MDA含量、GSH-Px活性、SOD活性及T-AOC。结果与正常对照组大鼠比较，模型组大鼠MDA含量明显升高，GSH-Px活性、SOD活性、T-AOC明显降低（P0.01或P0.05）；睾丸组织NO和iNOS含量明显升高（P0.01）。与模型组比较，倒卵叶五加、佳蓉片、维生素E三组大鼠血清MDA、睾丸组织NO和iNOS含量明显降低（P0.01或P0.05），GSH-P活性、SOD活性、T-AOC明显升高（P0.01）。结论倒卵叶五加和佳蓉片可升高衰老大鼠的抗氧化能力，具有明显延缓衰老的作用；机制可能与其抗氧化和降低衰老大鼠睾丸组织中NO和iNOS的含量有关。关键词倒卵叶五加；佳蓉片；大鼠；抗衰老；SOD活性；NO；iNOS中图分类号R285文献标识码A文章编号1673-7210（2013）02（b）-0012-03衰老是正常的生理现象，亦是自然规律。抗衰老一直是医学界普遍关注的科学问题，但因衰老机制不明，防治衰老的药物实无根本突破。英国学者Hatman曾于1956年提出衰老的自由基学说，认为人体内存在清除自由基的防御系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物（GSH-Px）及维生素、氨基酸、金属蛋白等；随着年龄的增长，机体抗氧化防御物质合成和活性下降，清除自由基能力降低，导致自由基代谢产物丙二醛（MDA）等大量堆积，加速机体的衰老1-2。中医认为，衰老与肾虚、肾精不足密切相关，补肾中药是中药延缓衰老的有效药物。佳蓉片是我科室20世纪90年代研制成功的主治更年期综合征新药（国药证字Z20026690），经多年临床应用证实，不仅对更年期综合征具有明显疗效，而且发现能够显著改善衰老证侯，如减少面部皱纹、延缓绝经期、促进生育能力3-5。为什么佳蓉片会有如此功效呢？经检索和分析处方中倒卵叶五加可能具有抗衰老作用。为证实该推论，本研究设计了倒卵叶五加的抗衰老作用实验研究，以期探讨倒卵叶五加和佳蓉片对亚急性衰老大鼠血清MDA含量，GSH-Px和SOD活性、总抗氧化能力（T-AOC）、以及睾丸组织中NO、iNOS含量的影响；评价倒卵叶五加及其复方的抗衰老作用。1材料与方法1.1试剂D-半乳糖，批号201112B09，北京化学试剂公司，采用生理盐水配成6%的溶液；SOD、MDA、GSH-P、T-AOC、NO、iNOS试剂盒，南京建成生物工程研究所。倒卵叶五加浸膏，含生药量3.8g/g浸膏，批号2011091201，由宝鸡饮片出品；佳蓉片，批号201111032，陕西博爱制药有限公司出品。1.2实验动物SD大鼠，8周龄，雄性60只，体重200250g由第四军医大学实验动物研究中心提供，动物合格证号：SCXK（军）字第2007-007号。随机分为正常组、模型组、倒卵叶五加组、佳蓉片组、维生素E组，每组12只大鼠。D-半乳糖连续腹腔注射（320mg/kg，50d）建立亚急性衰老大鼠模型，各组大鼠在腹腔注射D-半乳糖（正常组动物注射等量生理盐水）的同时，正常和模型组大鼠灌胃生理盐水（10ml/kg）、其他各组依次给予倒卵叶五加（1g/kg）、佳蓉片（6g/kg）、维生素E（20mg/kg），用药50d。1.3抗氧化指标检测大鼠末次给药后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，内眦取血2mL，离心取上清；按照TBA法检测MDA含量，比色法检测GSH-Px，黄嘌呤氧化酶法检测SOD，铁还原法检测T-AOC等指标。1.4NO、iNOS含量大鼠断头处死，每只大鼠取左侧睾丸组织约100mg滤纸吸干水分后称重，冰浴条件下切成小米粒大小组织块，加入适量冷生理盐水，制成10%组织匀浆，4000r/min离心12min，取匀浆上清，以冷生理盐水稀释成需要浓度，酶标仪测定组织蛋白含量，按照试剂盒说明进行操作，测定睾丸组织N0、iNOS的含量。1.5统计学方法数据采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料采用均数标准差（xs）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用2检验。以P0.05为差异有统计学意义，P0.01为差异有高度统计学意义。2结果2.1抗氧化能力的影响模型组大鼠MDA含量明显升高，GSH-Px、SOD活性T-AOC明显降低，与正常组比较差异具有统计学意义（P0.01或P0.05）。倒卵叶五加、佳蓉片和维生素E明显抑制衰老大鼠MDA含量升高；显著升高GSH-Px、SOD、T-AOC活性，各试药组与模型组比较差异有统计学意义（P0.05或P0.01）。见表1。表1大鼠各指标检测结果（xs，n=12）注：与模型组比较，*P0.01，*P0.052.2睾丸组织NO和iNOS的含量模型大鼠睾丸组织NO和iNOS的含量明显升高，与正常组比较差异有统计学意义（P0.05或P0.01）；倒卵叶五加、佳蓉片和维生素E显著降低睾丸组织NO和iNOS含量，与模型组比较差异有统计学意义（P0.05或P0.01）。见表2。表2各组大鼠睾丸组织NO和iNOS的含量（xs，n=12）注：与模型组比较，*P0.05，*P0.013讨论刘国强等6报道，MDA的含量可代表脂质过氧化产物的浓度，间接反映组织的损伤程度。所以，MDA是机体衰老过程中产生的过量超氧阴离子自由基与脂质发生过氧化反应的终产物7。GSH-Px是机体广泛存在的重要的过氧化物分解酶，其功能是催化谷胱甘肽（GSH）参与过氧化反应，清除细胞在呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻不饱和脂肪酸的过氧化作用。Giardino等8早在2002年就证实，随着年龄增加机体氧化还原平衡逐渐被打破，过氧化产物不断积累、抗氧化物质的含量明显下降，导致衰老。正常情况下，SOD的功能是清除体内新陈代谢过程中产生的自由基，使机体氧化与抗氧化保持平衡9；T-AOC反映体内酶性和非酶性抗氧化物的总水平，血清T-AOC含量是全面评估机体抗氧化能力的重要指标。倒卵叶五加是佳蓉片中的君药。倒卵叶五加具有健脾益气、补肾宁心、舒筋活络的功能，适用于体虚乏力、食欲不振、腰膝酸软、阳痿、失眠多梦、健忘、风寒湿痹等。本研究证实，D-半乳糖致模型大鼠血清MDA含量明显升高，SOD、GSH-Px活性、T-AOC明显下降，说明模型大鼠抗氧化能力明显降低；倒卵叶五加、佳蓉片和维生素E能明显降低D-半乳糖诱发的衰老大鼠血清MDA含量，升高SOD、GSH-Px、T-AOC含量；这不仅说明倒卵叶五加具有显著抗氧化应激能力并发挥抗衰老作用，同时也提示佳蓉片临床应用表现出的具有一定延缓衰老的功效应该与其君药地位密切相关。细胞的能量代谢障碍及凋亡是多种器官衰老退化的重要基础，NO能直接调控氧与血红素的结合与释放，进而控制对线粒体的氧供给，导致细胞内10水平下降，引起细胞凋亡11；睾丸组织是雄性生物生殖能力的重要器官，由此中医称“肾乃先天之本，生命之源”。本试验发现，D-半乳糖致衰老大鼠睾丸组织NO、iNOS的含量均明显增高，与文献报道12一致；采用倒卵叶五加、佳蓉片和维生素E干预，能明显降低衰老大鼠睾丸组织NO和iNOS的含量，说明倒卵叶五加等可通过调节睾丸组织NO、iNOS的含量抑制细胞凋亡，从而延缓睾丸组织的衰老。但是，倒卵叶五加是佳蓉片的君药，临床主适应证是用于妇女更年期综合征，那么，对雌性生殖器官的作用如何，本课题组的研究尚在进行中。参考文献1VohraBP，SharmaSP，KansalVK.Age-dependentvariationsinmitochondrialandcytosolicantioxidantenzymesandlipidperoxidationindiferentregionsofcentralnervoussystemofguineapigsJ.IndianJBiochemBiophys，2001，38（5）：321-326.2LIUKunzhi.TheeffectofdeoxyribonucleicacidontheactivityofsupemxidedismutaseandperoxidesJ.ActaLaserBiologySinica，2002，11（2）：119-121.3毛凯平，周杰，荣刚，等.佳蓉片治疗更年期妇女灼口综合征的疗效观察及其对血清性激素水平的影响J.实用临床医药杂志，2011，15（24）：117-118.4单呜，张维苹，赵书刚.佳蓉片配合激光治疗皮肤光老化93例J.中国中医药科技，2011，18（6）：533-534.5王锦秋，王民.佳蓉片临床应用新进展J.西部医学，2006，18（5）：660-661.6刘国强，杨桂文，安利国.芦笋黄酮对D-半乳糖衰老小鼠大脑皮层SOD、MDA的影响J.科技信息：学术研究，2008，（2）：119.7ZhangQ，LiX，CuiX，etal.D-galactoseinjuredneurogenesisinthehippocampusofadultmiceJ.NeurolRes，2005，27（5）：552-556.8GiardinoR，GiavaresiG，FiniM.Theroleofdifferentchemicalmodificationsofsuperoxidedismutaseinpreventingaprolongedmuscularischemis/reperfusioninjuryJ.ArtifCellsBloodlmmubiolBiotechmol，2002，30（3）：189-198.9何建明，李玉蓉，韦英秀.急性脑梗死患者血管内皮生长因子与自由基SOD、MDA的临床研究J.现代生物医学进展，2010，10（12）：2295-2298.10WuXJ，SthalT，HuY.Theproductionofreactiveoxygenspeciesandthemitochondriaimembranepotentialaremodulatedduringonionoil-inducedcellcyclearrestandapoptmisina549cellsJ.JNulr，2006，136（3