微生物限度检查法操作规程.doc

SOP QC-038-02 微生物限度检查法操作规程 第3页 共25页微 生 物 限 度 检 查 法 操 作 规 程第1页 共25页执 行 日 期起草部门质量管理部文件编号SOP QC-038-02起 草 人审 核 人批 准 人起草日期审核日期批准日期分发部门：质量管理部1 目的：建立微生物限度检查的基本操作，为微生物检查人员提供正确的操作依据。2 范围：适用于药品的微生物限度检查。3 责任：QC化验员、QC主任。4 内容：依据中国药典2005年版、中华人民共和国卫生部药品卫生检验方法。细菌、霉菌和酵母菌计数1 简述细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的方法，也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。 细菌、霉菌和酵母菌计数除另有规定外，均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上最常用的一种方法。以琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在规定条件下所生成的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数，不包括对营养、氧气、温度、PH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。 一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落数均可由一个或多个细菌生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位（colony forming unity,cfu）不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。 在进行本法测定时必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。2 仪器、设备2.1设备2.1.1无菌室 微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的空气净化系统。2.1.1.1结构和要求见无菌检查法。2.1.1.2操作间 操作间应安装空气除菌过滤层流装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9Pa。操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。2.1.1.3 缓冲间 缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。2.1.1.4洁净级别及检查方法 通常采用尘粒数和浮游菌数或沉降菌数测定法（参照医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测定方法的现行国家标准进行洁净度验证。洁净级别尘粒数/m3浮游菌（个）/m3沉降菌（个）/（90mm0.5h）微粒直径0.5m微粒直径5m100级3，50005110000级350，00020001003100000级3，500，00020，00050010沉降菌数测定（法）无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30分钟，将备妥的营养琼脂平板3个（经3035预培养48小时，证明无菌落生长），以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30分钟后，将盖盖上。在3035培养箱内倒置培养48小时，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。有条件的单位，同时应检查操作间和净化工作台上的浮游菌和尘粒数，分别应达到10000级和100级。如菌落数或尘粒数超标，应清洗过滤系统中的过滤器，必要时予以更换。2.1.1.5在每次操作前、后用 0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台、地面及可能污染的死角，然后启动室内的层流净化装置，同时用紫外灭菌灯照射30分钟。2.1.2阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试品检验用的无菌室内或净化工作台上操作。2.1.3无菌室与洗刷、灭菌消毒、培养、结果观察及办公室等配套设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。2.2仪器2.2.1 恒温培养箱（3035）、生化培养箱（2328）、微波炉（或其他适宜加热装置）、康氏振荡器、匀浆仪（30008000r/min）、恒温水浴、离心机、电热干燥箱（250300）、电冰箱、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定。）、菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平、pH系列比色计。5.2.2.2 玻璃器皿、锥形瓶（250300ml，内装玻璃珠若干；500ml，1000ml）、培养皿（直径9cm）、量筒（100ml，500ml）、试管（18mm180mm、28mm198mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20ml或30ml）及针头、载玻片、盖玻片、带盖玻璃消毒缸、带盖不锈钢筒。玻璃器皿用前应用洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。使用过后如与细菌接触，应先灭菌倒出内容物后再清洗，晾干。吸管、量筒应不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm适宜疏松的棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉塞，若用震荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免震荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于高压蒸汽121灭菌30分钟，烘干或160干热灭菌2小时，备用。天津安捷伦药业有限公司SOP QC-038-02 微生物限度检查法操作规程 第26页 共25页2.2.3用具 大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%75%乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌物品。接种环（白铱金或镍合金，环径4mm5mm、长度6cm10cm）、酒精灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、实验记录纸等。3 试液、稀释剂和试剂3.1 试液3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。2.3.1.2 5%石碳酸溶液或其他适宜消毒液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）。3.1.3 75%乙醇溶液。3.1.4 碘酊或碘伏溶液。3.2稀释剂和试剂3.2.1 0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121灭菌20min。3.2.2 pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23 g，氯化钠4.30 g，蛋白胨1.0 g，加水1000ml，微温溶解，分装过滤，121灭菌20分钟。3.2.3 pH 6.8 无菌磷酸盐缓冲液 取磷酸氢二钾6.80g与氢氧化钠0.944g，加水稀释至1000ml，121灭菌20min。3.2.4 pH 7.6无菌磷酸盐缓冲液 取磷酸氢二钾6.80g与氢氧化钠1.70g，加水稀释至1000ml，121灭菌20min。3.3 试液3.3.1 二盐酸二甲基对苯二胺试液 取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g，加水10ml，即得。临用时少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。3.3.2 亚碲酸钠（钾）试液 取亚硫酸钠（钾）0.1g，加新鲜煮沸后冷至50的水10ml使溶解。3.3.3 玫瑰红钠试液 取玫瑰红钠0.1g，加水使溶解成75ml。3.3.4 亮绿试液 取亮绿0.1g，加水100ml使溶解。3.3.5 盐酸试液 取盐酸8.4ml，加水稀释成100ml。3.3.6 0.1%氯化三苯四氮唑试液（TTC） 取氯化三苯四氮唑0.1g，加水溶解成10ml。3.3.7 靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。3.3.8 碘试液 取碘6g，碘化钾5g，加水20ml使溶解。3.3.9 过氧化氢试液 取浓过氧化氢溶液（30%），加水稀释成3%的溶液。临用时配制。3.4 指示液3.4.1 中性红指示液 取中性红1.0g，研细。加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。变色范围pH6.88.0（红黄）。3.4.2 亚甲蓝指示液 取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。3.4.3 酚磺酞指示液 取亚甲蓝0.5g，加1mol/L氢氧化钠溶液2.82ml，使溶解，再加水至100ml。变色范围pH6.88.4（黄红）。3.4.4 溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫1.6g，加95%乙醇使溶解成100ml。色范围pH5.26.8（黄紫）。天津安捷伦药业有限公司3.4.5曙红钠指示液 取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。4. 培养基 除另有规定外，培养基灭菌条件为121 20min。4.1 营养琼脂培养基与营养肉汤培养基；4.2 玫瑰红钠琼脂培养基；4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）；4.4 胆盐乳糖培养基（BL）；4.5 培养基制备注意事项4.5.1采用干燥培养基，按照说明配制，应对灭菌后的培养基PH值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。4.5.2配制的培养基不应有沉淀。如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。4.5.3培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。4.5.4培养基配制后应在2小时内灭菌，避免细菌繁殖。4.5.5灭菌后的培养基应保存在225，防止被污染，可在3周内用毕；保存于密闭容器中，可在一年内使用。制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分散失及染菌。4.5.6用水浴或微波炉加热溶化琼脂培养基，勿用电炉直接溶化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏。已溶化的培养基应一次用完，剩余培养基不宜再用。培养基不能反复加热溶化。 5. 供试品抽样、保存及检验量5.1 抽样5.1.1 一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的35倍量（以备复试或留样观察）。5.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。5.1.3 凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。5.2 保存5.2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死、损伤或繁殖。5.2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。5.3 供试品的检验量5.3.1 所有剂型的供试品须取自2个以上的包装单位（中药蜜丸须取自4丸、膜剂除须取自4片以上）。5.3.2 固体及半固体（黏稠性供试品）制剂检验量为10g，液体制剂检验量为10ml。膜剂除另有规定外，中药膜剂为25cm2（中药膜剂较厚不宜取量过多），化学及生化膜剂为50cm2。贵重的或微量包装的供试品检验量可以酌减。但除另有规定外，口服固体制剂不得低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。5.3.3要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。6.试验准备6.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀桨杯、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等经传递窗转移至无菌室。每次实验所用物品必须提前做好计划，准备足够用量，避免操作中出入无菌间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。6.2开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30分钟。6.3关闭紫外杀菌灯后，操作人员用肥皂洗手，进入缓冲间换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、手套、口罩。操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，等干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。7. 供试液的制备按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。如使用了乳化剂、分散剂、中和剂或灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响。供试液的制备如需水浴加温时，温度不应超过45，30分钟。除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：7.1液体供试品 取供试品10ml，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可先加入适量的（5ml8ml）无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。7.2固体、半固体或粘稠液供试品 取供试品10g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪（3000r/min5000r/min，24min），振荡器或乳钵研磨等方法分散法混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并在水浴中适当加温使供试品分散均匀。蜜丸等需剪碎，放入匀浆杯。7.3 气雾剂将供试品置冰箱（48）2h，取出，消毒开启部位周围，以无菌钢锥钻孔并插入容器中，不移出钢锥，以转动方式使容器内抛射剂缓缓全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液，按标示量补加稀释剂至足量（若含非水溶性成分，加适量无菌聚山梨酯-80）混匀，吸取相当于10g或10ml供试品，再稀释成100ml作为供试液。7.4 合剂（系指含王浆或蜂蜜者，下同）与滴眼剂可直接用供试品作为供试液。称取供试品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪（3000r/min5000r/min，24min），振荡器或乳钵研磨等方法分散法混匀。胃溶胶囊加稀释剂后置451水浴中振摇。7.5 非水溶性供试品7.5.1 软膏剂、乳膏剂先将已备妥灭菌的含司盘-80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯-80 10g的混合物融化，待冷至45时，加入供试品5g（5ml），立即用无菌玻璃棒搅拌均匀，分次少量慢慢加入45的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20供试液。7.5.2油剂 取供试品10ml加入5ml8ml无菌聚山梨酯80，摇匀，再加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。7.5.3 栓剂取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，置45水浴保温10min，使溶，加无菌聚山梨酯-80 5ml8ml，振摇使乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯-80总量为100ml），摇匀。7.5.4 非水溶性的膜剂供试品取规定量，剪碎，加稀释剂100ml（必要时可增加稀释剂），置45水浴中，保温，振摇，使溶解，作为供试液。4.5.2.3 肠溶胶囊（片）供试品称取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液（pH6.8）100ml的锥形瓶内，于45水浴中，保温，振摇，使溶解，作为供试品。4.5.3 茶剂取供试品10g，置无菌锥形瓶中，加100ml稀释剂，振摇30s，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30min）。4.5.4 以上供试品如吸水膨胀，或黏度过高，可增加稀释剂，制成1：201：100供试液。4.5.5 含抑菌成分供试品供试品如干扰控制菌检验（即按常规检查法，加入规定量的对照菌，阳性对照菌不生长），按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。4.5.5.1 稀释法 将供试品液放入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。4.5.5.2 离心沉淀集菌法 取规定量的供试液于刻度离心管中，离心（3000r/min）30min，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可先离心（500r/min）5min，取全部上层液，再行集菌处理。4.5.5.3 薄膜过滤法取规定量的供试液，置稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45m0.02m微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50ml100ml，取出滤膜备检。4.5.5.4 中和法凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。如含磺胺类的供试品，加入100ml对氨基苯甲酸的增菌液中；含汞、砷类的供试品，加入硫乙醇酸盐培养基100ml中；含洗必泰的供试品，加入含聚山梨酯-80等表面活性剂的100ml增菌液中（表面活性剂的用量应预试，用量过大有抑菌作用）。4.5.5.5 沉降法 取规定量供试液，自然沉降5min，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌制剂。4.6 试验前的准备4.6.1 将供试品及所有已灭菌的物品及稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先准备足够用量，避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。4.6.2 开启无菌室紫外洒和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。4.6.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外灯，进入更衣室，换工作鞋。再用消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。4.6.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。4.7 检查法4.7.1 细菌、霉菌与酵母菌计数4.7.1.1 平皿菌落计数法4.7.1.1.1 供试液的稀释取23支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂（注意：勿在乙醇灯焰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）。加完稀释剂后，试管塞应立即塞上。另取一支1ml灭菌吸管吸1:10供试液1ml，加入装有9ml灭菌稀释剂的试管中混匀，即为1:100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1:102、1:103、1:104等适宜稀释级（至少共3级）。每递增1稀释级，必须另换一支吸管。在做10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于所需刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，再沿第二级稀释管的内壁靠近液面但不接触液面处缓缓吹出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。4.7.1.1.2 注皿在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各级稀释液各1ml至每个平皿中（从高稀释级至低稀释级吸液时可不换吸管），每一稀释级注23个平皿，注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体。将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另加用YPD琼脂）溶化，冷至约45时，倾注上述各个平皿约15ml，立即快速旋转平皿混匀，混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上，然后置操作台上待凝。4.7.1.1.3 培养凝固后，将细菌计数平板倒置于3035培养箱中培养48h。霉菌、酵母菌计数平板于2528培养箱中培养72h。4.7.1.1.4 菌数测定阴性对照取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。4.7.1.1.5 菌落计数一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。勿漏计琼脂层内细小的各平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的鉴别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加12个平皿注皿，注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。或用0.001%TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不应点计在内。排除的方法需按该制剂微生物药品而定，并须观察菌落特征及染色形态。若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界线，一条链作为一个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。记录各稀释级平板的菌落数，求出各稀释级2或3个平板菌落的平均数。当菌落数在15个以上的同稀释级二平板菌落数相差1倍时，该稀释级菌落数不得作为计数依据；当2个平板菌落数均在15（含15）以下时，两下平板菌落数的差值允许范围为04、17、29、310、412、514、615。超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。有下列情况者，点计菌落时间需提前或延长培养时间：a） 菌落生长呈蔓延趋势者，细菌点计需在24h，霉菌点计需在48h做初步点计（点计霉菌菌落时，动作宜轻，勿反复翻转平板或造成震动，使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差）。b） 在48h点计细菌，72h点计霉菌时，菌落极小不易辨认，需延长培养时间4h7h，再点计菌落数。c） 对有疑义的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。供试品按营养琼脂平板点计细菌菌落数；固体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌数，一般液体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数及酵母菌总数；含蜂蜜及王浆的合剂按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数，按YPD琼脂平板点计酵母菌菌落数，两者合并为霉菌及酵母菌数。点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。4.7.1.1.6 菌数报告规则细菌数宜选取平均菌落娄在30300的稀释级，霉菌、酵母菌宜选取平均菌数在30100的稀释级在30100的稀释级作为报告菌数。如有1个稀释级在30300（30100）之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告（见表1例）。如同时有2个相邻稀释级在30300（30100）之间时，按下式计算两级比值。比值高稀释级的平均菌落数稀释倍数低稀释级的平均菌落数稀释倍数当比值2时，以两稀释级的均值报告，当比值2时，以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表1例）。如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30300时，以后2个稀释级计算级间比值报告（见表1例）。如各稀释级的平均菌落数均不在30300，以最接近30或300的稀释级乘以稀释倍数报告（见表1例）。如各级稀释级平均菌落数均在300（100）以上，按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表1例）。如各各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表1例）。如各稀释级均无菌生长或最低稀释级平均菌落数小于1，应报告菌数为10个/g或ml（见表1例）。如当1:10（或1:100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1:10）稀释级时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数（见表1例）。表1 细菌数报告规则举例规则原液各稀释级菌落数比值菌落数报告数1:101:1001:100019136527602890239236不可计不可计260.531164295271202196305465016002046603542125131101.62.21.72.1164003775027100276001960030500513000260516000380002700028000200003000051000026010培养基稀释法4.7.1.2 培养基稀释法取供试液（原液或1:10供试液）3份。每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿内（每皿各0.2ml或0.2ml）。每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。每1ml注入的5个或5个以上平皿点计的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得3组数据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。4.7.1.3 结果报告4.7.1.3.1 菌落数在100以内时，按其数据报告。4.7.1.3.2 菌落数大于100时，取两样有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。4.7.1.3.3 复试供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的均值报告。4.7.1.3.4 细菌、霉菌和酵母菌形态特征比较，见表2。表2 细菌、霉菌、酵母菌形态特征比较（营养琼脂及玫瑰红钠琼脂平板）细菌霉菌酵母菌菌落大小差别很大，在同一平板上可出现针尖大小至大于10mm菌落一般较大，亦有细小的菌落。在同一平板上生长的菌落大小有时不一致多数直径为1mm2mm，在同一平板上生长的菌落大小有时不一致外观形态多样，小而突起或大而扁平多为圆形，有的蔓延生长为无定形培养基表面生长者多为圆形，内层生长者为圆形、铁饼、纺锤或三角形色泽白、灰白或无色，亦有淡褐、淡黄及淡红色，菌落正反面颜色相同小菌落灰白，大菌落形成孢子后颜色多样。菌落上反面颜色不同乳白或粉红色多见，在同一平板上色调较单一透明度透明或不透明小菌落半透明有明显折光性，大菌落不透明透明较差边缘整齐或不整齐，有放射线状、树枝状、锯齿状、卷发状。低倍镜下一般见不到边缘菌丝体构成，多呈放射状整齐、低倍下可见球状，卵圆状或假菌丝状，细胞细密排列气味一般有臭味往往有霉味多带酒香味与培养基结合不结合结合较牢固，不易挑起不结合，易挑起生长速度一般很快较慢较快细胞形态球或杆状，细小均一，高倍镜或油镜下可观察形态菌丝体相互交织，成熟霉菌常有产孢组织及孢子多数为圆或卵圆形，常有芽体相连排列单个、分散或有一定的排列方式丝状交织单个分散4.7.2 控制菌检查除另有规定处，取供试液10ml（相当于供试品）1g、1ml、1cm2），直接或处理后接种，经增菌、分离培养后，进行革兰氏染色、生化试验等检查。4.7.2.1 大肠杆菌（Escherichia coli）4.7.2.1.1 增菌培养取胆酸乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。（361）培养48h24h（必要时可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于（361）培养5h与24h时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外等下观察。阳性对照呈现荧光，MUG阳性。供试液的MUG管呈现荧光，MUG阴性。然后加入数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈现玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆酸乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌。供试液MUG阳性，靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。4.7.2.1.2 分离培养如MUG阳性，靛基质阴性，或MUG阴性，靛基质阳性，均应将上述供试液胆盐乳糖培养基培养淮轻轻摇动，以接种环蘸取12环培养液划线于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板，（361）培养18h24h，观察EMB或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠杆菌菌落生长，或有菌落但不同于表3所列特征，可判未检查大肠杆菌。当阳性菌对照平板未生长或长长菌落经检查不是大肠杆菌，应查找原因，重新试验。有疑似菌落生长者，挑取可疑菌落做革兰染色、镜检、IMViC试验。表3 大肠杆菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。非典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗色中心，无金属光泽麦康凯琼脂典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润，非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色4.7.2.1.3 纯培养当阳性对照的平板量典型菌落生长时（表3），若供试品分离平板有疑似菌落生长，应挑选23个可疑菌落分别接种至营养琼脂斜面，（361）培养18h24h；如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应蘸取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于EMB琼脂平板，（361）培养18h24h，再挑选单个疑菌落，纯培养，做靛基质试验（I）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）、枸似橼酸盐利用试验（C）及革兰氏染色、镜检，按表4规定判断结果。4.7.2.1.3.1 IMViC试验靛基质实验（I）：取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养物中，培养24h，沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。加基红试验（M）：取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养（482）h，于管内加入加基红指示剂数滴，立即观察，呈鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性。乙酰甲基甲醇生成试验（V-P试验）：取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基，培养（482）h，每2ml培养物中加入-奈酚乙醇试液1ml混匀，再加40%氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，在4小时内，如出现红色应判为阳性，无红色应为阴性。枸橼酸盐利用试验（C）：取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面，培养48h72h，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为兰色时为阳性，培养基颜色无变化时为阴性。4.7.2.1.3.2 革兰染色、镜检a） 以接种环蘸取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰23次（载玻片不烫手）固定。b） 滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。c） 滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。d） 滴加95%乙醇，脱色20s30s，水洗。e） 滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。染色结果：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。大肠杆菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。4.7.2.1.4 结果判断结果判断见表4。对于MUG-1反应应不符的可疑菌株，应重新分离培养，再作生化实验证实。表4 MUG的结果判断MUG-1曙红亚甲蓝琼脂IMVic结果无菌生长无菌生长无菌生长检出大肠杆菌未检出大肠杆菌未检出大肠杆菌检出大肠杆菌检出大肠杆菌注：、如出现或出现，均应重新分离菌株，再作MUG-1和IMVic试验。革兰阴性杆菌。4.7.2.2 沙门菌（Salmonella apecies）4.7.2.2.1 增菌培养取营养肉汤培养基3份，每份100ml，2份分别加入1：10供试液各10ml，其中1份加入对照菌液0.1ml（含菌50100个）做阳性对照，第三瓶加入稀释剂10ml做阴性对照，（361）培养18h24h后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长，否则试验无效。轻轻摇动供试品及阳性对照增菌培养瓶，分别吸取1ml接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10ml中，（361）培养18h24h。阳性对照管应呈现混浊。4.7.2.2.2 分离培养轻轻摇动供试品和阳性对照增菌培养瓶，以接种环分别蘸取12环培养液接种于胆盐硫乳琼脂（DHL）或沙门菌志贺菌菌琼脂（SS）平板及曙红亚甲蓝（EMB）琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置于（361）培养24h48h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落。沙门菌在上述平板上的菌落形态特征见表5。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落生长，或有菌落但不同于表5所列特征时，可判为未检出沙门菌。在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门菌菌落形态，需进一步鉴别。阳性对照平板上，应有沙门菌落形态特征的菌落生长，否则，应查明原因再行检查。如阳性对照平板有典型菌落生长，供试品平板均未生长或无疑似菌落生长，则报告1g或1ml供试品未检出沙门菌。由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别。表5 沙门菌菌落形态特征培养基菌落形态胆盐硫乳琼脂（DHL）无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全都黑色或无黑色沙门、志贺菌属琼脂（SS）无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褪色曙红亚甲蓝琼脂（EMB）无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落麦康凯琼脂（MacC）无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色4.7.2.2.3 初步鉴别试验从每个供试品的分离平板上挑取23个疑似菌落（无色或微带橙色，产H2S的菌落；无色或微带橙色、不产H2S的菌落；红色，产H2S的菌落）分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，蘸取培养物划线于斜面并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，（361）培养（242）h，观察结果。同时接种阳性对照。疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应为：a. 斜面红色（产碱），底层黑色（产H2S）并显示黄色（产酸）；b. 斜面红色，底层黄色；c. 斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。将疑似沙门菌的三糖铁琼脂或营养琼脂斜面培养物做生化试验、血清学凝集试验及革兰不染色、镜检。沙门菌应为革兰阴性杆菌。4.7.2.2.4 生化试验4.7.2.2.4.1 靛基质试验用接种环蘸取少许培养物，接种至蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌检查法靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应。4.7.2.2.4.2 脲酶试验用接种环沾取疑似菌斜面培养物，划线接种于脲琼脂培养基斜面，培养24h，斜面变为红色为阳性，不变色为阴性。沙门菌应有阴性反应。4.7.2.2.4.3 氰化钾试验取培养20h24h的疑似菌株营养肉汤培养液，分别用白金耳蘸取1环，接种至氰化钾培养基及对照培养基（不含氰化钾的相同培养基），立即以橡胶塞塞紧，培养24h48h，对照管应有菌生长，试验管有菌生长者为阳性，无菌生长为阴性。沙门菌应为阴性反应。4.7.2.2.4.4 赖氨酸脱羧酶试验用接种环沾取疑似菌斜面培养物分别接种于赖氨酸脱羧酶培养基及对照培养基（不含赖氨酸脱羧酶的相同培养基），培养24h48h，对照管应为黄色，试验管呈紫色为阳性，呈黄色为阴性。沙门菌应为阳性反应。4.7.2.2.4.5 动力检查用接种环蘸取疑似菌斜面培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中，培养24h，细菌沿穿刺外周扩散生长，为动力阳性，否则为阴性。阴性培养物，应在室温保留2d3d后，再判断。沙门菌除鸡雏沙门菌无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动。4.7.2.2.4.6 血清凝集试验在洁净载玻片一端，以白金耳蘸取沙门菌属AF“O”多价血清23环，再取斜面上部培养物少许，与血清混合，将玻片前后侧动，如出现凝集现象，应以0.9%氯化钠溶液与同株培养物作对照试验，无凝集现象时判为血清凝集阴性。有时有反应迟缓时，需将玻片与湿棉球置平皿内，约过20min，再观察。未出现凝集时，应取斜面培养物，置含少量0.9%氯化钠溶液的试管中，制成浓菌悬液，在100水浴中保温30min，待冷，再作凝集试验。如出现凝集，应判为阳性，否则为阴性。4.7.2.2.5 结果判定上述各项试验反应，一般应为硫化氢阳性（或阴性），靛基质阴性，脲酶阴性，氰化钾阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，动力阳性，AF“O”多价血清凝集试验阳性。各鉴定结果按表6判定。表6 沙门菌检查结果判定序号血清凝集试验（AF“O”血清）生化试验结果凝集反应10030min凝集反应0.9%氯化钠溶液对照123阳性阴性阴性阳性阴性阴性阴性符合符合不符合检出沙门菌检出沙门菌未检出沙门菌上述各项试验任何一项不符合或有可疑反应的培养物，均应进一步鉴定后做出结论。4.7.2.3 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）4.7.2.3.1 增菌培养取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入1：10的供试液10ml（相当于供试品1g或1ml），其中1份加入对照菌50100个作为阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于（361）培养1824小时，阳性对照应生长良好，阴性对照应无菌生长。4.7.2.3.2 分离培养轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取12环培养液（如有菌膜应挑取之），划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，于（361）培养1824小时。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，显灰白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙和黏液型等。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落或无疑似菌落生长，可判未检出铜绿假单胞菌。当阳性对照平板无菌落生长或生长菌落经检查不是铜绿假单胞菌，应研究原因，重新试验。4.7.2.3.3 纯培养供试品分离平板生长菌落具有上述特征或疑似者，以接种针挑取23个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18h24h，取培养物作革兰染色，并做氧化酶试验。4.7.2.3.4 革兰染色、镜检革兰染色与大肠杆菌检验法相同。镜检：铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列。4.7.2.3.5 生化试验4.7.2.3.5.1 氧化酶试验取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养物涂于滤纸片上，再滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30s内纸片呈粉红色，逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。如证实为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。4.7.2.3.5.2 绿脓菌素试验取上述琼脂培养物，接种于绿脓菌素测定用培养基（PDP）斜面上，（361）培养24h后，观察斜面有无色素，如有色素，在试管内加氯仿3ml5ml，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将氯仿移至另一试管中，加入1mol/L盐酸试液约1ml，振摇后，静置片刻，如在盐酸溶液层内出现粉红色，即为绿脓菌素阳性。试验同时应作阴性对照。如培养基斜面无色素产生，应于室温培养1d2d再按上法试验。当阴性对照试验呈阴性时，供试品培养物为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素阳性，可判检出铜绿假单胞菌。绿脓菌素阴性的培养物，应继续做以下试验。4.7.2.3.5.3 硝酸盐还原产气试验以接种环蘸取营养琼脂斜面培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，培养24小时，如在培养基的杜氏管中有气体产生，即为阳性。4.7.2.3.5.4 42生长试验取营养琼脂培养基斜面培养物于0.9%无菌氯化钠溶液中，制成菌悬液，再将菌悬液划线接种于营养琼脂培养斜面，立即置于（401）水浴中培养24h28h（应将整个斜面浸没在水浴中），有菌苔生长者为阳性，否则为阴性。4.7.2.3.5.5 明胶液化试验以接种针沾取营养琼脂培养基斜面培养物，穿刺于明胶培养基内，（361）培养24h，取出置冰箱内10min30min。如培养基仍呈溶液状，为阳性。4.7.2.3.5 结果判定供试品培养物为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，即报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌；当供试品培养物为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性、绿脓菌素试验阴性，其硝酸盐还原产气试验、42生长试验及明胶液化试验均为阳性时，应判检出铜绿假单胞菌。与上述结果不符时，可判1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌。4.7.2.4 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）4.7.2.4.1 增菌培养取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基3份，每份100ml，2份分别加入1：10的10ml供试液，其中1份加入50100个对照菌作为阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。置（361）培养18h24h（必要时可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。4.7.2.4.2 分离培养将上述供试品增菌培养液及阳性对照增菌液轻轻摇动，以接种环蘸取12环培养液，划线接种于卵黄高盐琼脂培养基平板或甘露醇高盐琼脂培养基平板，置（361）培养24h72h。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板如无菌落生长，或有菌落但不同于表7所列特征，可判1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。当阳性对照平板未生长或生长菌落经检查不是金黄色葡萄球菌时，应研究原因，重新试验。表7 金黄色葡萄球菌在