生物技术制药复习提纲2010(整理版).doc

2010生物技术制药复习提纲一、基本概念1、质粒：是存在于细胞染色体之外的双链封闭环状的DNA分子。它含有有别于细胞染色体的独立复制子，能自主地复制自身的DNA。2、生物药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物，称为生物技术药物。3、贴壁细胞：生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖的细胞。4、悬浮细胞：生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长的细胞。5、单克隆抗体：是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。6、多克隆抗体：由于病原微生物是含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体，即针对多种抗原决定簇的抗体。7、人-鼠嵌合抗体：在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的重链（H）和轻链（L）可变区分离出来，分别与人Ig的重链和轻链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的人-鼠嵌合抗体。8、改形抗体：用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中的CDR序列，即可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性。可基本消除免疫原性。这种改形抗体又称CDR移植抗体。9、Fab抗体：用胃蛋白酶可将IgG的重链在铰链区的C端处裂解，获得两个完全相同的抗原结合片段（Fab），在Fab片段之间仍保留有铰链区与二硫键，为Fab双体，具有完整的双价抗体活性，但相对分子质量减少了1/3，为10000，在人体内产生的抗鼠蛋白的排斥反应也相应的降低至30%，由于仍保持抗体分子的立体构型，因此在人体内仍然很稳定，成为小分子抗体的雏形，称Fab抗体。10、Fv抗体：用胃蛋白酶水解抗DNP（二硝基苯酚）单克隆抗体产生Fab片段后，过Sephadex G-75柱时，显示出两个峰，第一个峰为Fab主峰，第二个峰的抗体结合片段的分子大小约为Fab的一半，这个片段含有L链和Fd链一半的N端可变区，具有与完整抗体相似的结合能力，因此命名为“抗体可变区片段”，称Fv抗体。11、单链抗体：是由一段弹性连接肽把抗体可变区重链（VH）与轻链（VL）相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。12、植物的分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程，可分为胚胎发生和器官发生。13、脱分化：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。14、再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出器官。15、愈伤组织：从植物的各种组织、器官等外植体经脱分化而形成的细胞聚集体。16、继代培养：由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间称之为第一代培养，连续多代的培养即为继代培养。17、固定化酶：是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。18、固定化细胞：被限制或定位于特定空间位置的细胞，与固定化酶一起被称为固定化生物催化剂。19、模拟酶：根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。二、技术原理1、简要说明影响目的基因高效表达的因素1）外源基因的剂量：质粒的拷贝数和稳定性2）外源基因的表达效率：启动子；分泌信号；终止序列的影响3）外源蛋白的糖基化4）宿主菌株的影响：菌体生长力要强；菌体内源蛋白酶要弱；菌体性能稳定；分泌能力强。大肠杆菌系统影响目的基因表达的因素：1）外源基因的剂量：质粒的拷贝数增加，基因的表达产物增加2）外源基因的表达效率：启动子的强弱；核糖体结合位点的有效性；SD序列和起始密码的间距；密码子的偏爱性3）表达产物的稳定性4）细胞的代谢负荷5）工程菌的培养条件酵母系统影响目的基因表达的因素：1）外源基因的剂量：质粒的拷贝数和稳定性2）外源基因的表达效率：启动子；分泌信号的效率；终止序列的影响3）外源蛋白的糖基化4）宿主菌株的影响2、基因载体应具备的条件书本：1）载体能够独立地复制；2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记；3）应具有很强的启动子；4）应具有阻遏子，使启动子受到控制；5）应具有很强的终止子；6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号：起始密码AUG和SD序列。课件：1）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；2）具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；3）具有较高的外源DNA装载能力；4）具有多种单一的限制内切酶识别切割位点；5）具有合适的筛选标记。3、导致基因工程菌中质粒不稳定的原因及如何提高质粒的稳定性质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。基因工程菌的质粒不稳定常见的是分裂不稳定，它主要与两个因素有关：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，二是这两种菌比生长速率差异的大小。提高质粒稳定性的方法：1）选择合适的宿主菌2）选择合适的载体：低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高，增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低，但对稳定性不利。3）选择压力：在培养基中加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长4）分阶段控制培养：先使菌体生长至一定密度；再诱导外源基因的表达。5）控制培养条件：调控环境参数如温度、PH、培养基组分和溶解氧浓度6）固定化4、简述三种分离纯化常用色谱方法的基本原理1）离子交换层析（IEC）基本原理：通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。它具有分辨率高，容量大，容易操作的优点。该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。2）疏水层析（HIC）基本原理：是利用蛋白质表面的疏水区域与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组分进行分离的层析方法。无机盐的存在能使相互作用力增强。所用介质表面的疏水性为有机聚合物键和相或大孔硅胶键和相流动相一般为pH68的盐水溶液在高盐浓度时，蛋白质与固定相疏水缔合；盐浓度降低时蛋白质疏水作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来。3）亲和层析（AC）基本原理：是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。配体：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质载体：与配体结合的支撑物亲和层析大体可分三步：配体固定化；吸附目的物；样品解析4）凝胶过滤层析基本原理：以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。主要应用两个方面：脱盐和更换缓冲液；蛋白质分子的分级分离。在产品的形成阶段前用于出去产物的多聚体及降解产物。5、试比较动物细胞和植物细胞生理特点的异同动物细胞与植物细胞生理特性的比较特征动物细胞植物细胞大小/m1010010100生长形式悬浮、贴壁悬浮营养要求很复杂很复杂倍增时间/h1510020120细胞分化有有限分化环境影响非常敏感敏感细胞壁无有产物存在部位胞内或胞外胞内或胞外产物浓度低低含水量/%约90供氧需求（Kla）1252030产物疫苗、单抗、酶、生长因子、激素、免疫调节等酶、天然色素、天然有机化合物等动物细胞的生理特点1）细胞的分裂周期长：细胞分裂时间为1248h2）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象3）正常二倍体细胞的生长寿命是有限的4）动物细胞对周围环境十分敏感5）动物细胞对培养基的要求高6）动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同7）动物细胞生产药物的特点：分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。缺点是培养条件高、成本贵、产量低。8）动物细胞的化学组成：蛋白质、核酸、脂类、糖类植物细胞的主要生理活性物质及其他化学成分1）生理活性物质：酶类、维生素、植物激素、抗生素和植物杀菌素2）其他成分：生物碱、糖苷类、挥发油、有机酸6、试比较说明动物细胞培养基与植物细胞培养基的区别动物细胞培养基大致分为3类：天然培养基、合成培养基和无血清培养基1）天然培养基：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等，成分复杂，不稳定2）合成培养基：氨基酸、维生素、糖类、无机盐、其他成分、小牛血清添加小牛血清的作用：提供生长因子和激素；提供贴附因子和伸展因子；提供结合蛋白；提供脂肪酸和微量元素3）无血清培养基无血清培养基加入添加剂：激素和生长因子；结合蛋白；贴附和伸展因子；有利于细胞生长的因子和元素优点：提高可重复性；减少微生物污染；供应充足稳定；产品易于纯化；避免血清因素对细胞的毒性；减少血清中蛋白对生物测定的干扰。植物细胞培养基1）无机盐大量元素(30mg/L)：N、S、P、K、Ga、Na、Mg、Cl微量元素(30mg/L)：Fe、B、Mn、I、Mo、Cu、Zn2）碳源：糖类、肌醇、甘油3）植物生长调节剂：生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯4）有机氮源：蛋白质水解产物（如谷氨酰胺）或各种氨基酸5）维生素：常用B族维生素、生物素和肌醇7、试比较动物细胞与植物细胞培养操作方式的异同点动物细胞的培养操作方式1）培养方法：悬浮培养：让细胞自由地悬浮于培养基内生长繁殖 贴壁培养：让细胞贴附在某种基质上生长繁殖贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）：微载体培养、包埋和微囊培养、结团培养2）操作方式：分批式操作、半连续式操作、灌流式操作植物细胞的培养操作方式成批培养法；半连续培养法；连续培养法；固定化培养法8、抗体的基本结构及每一区域的功能作用9、简要说明制备的单链抗体的基本原理及该抗体的优点单链抗体是由一段弹性连接肽把抗体可变区重链（VH）与轻链（VL）相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。在scFv中，连接肽的长度一般为15个氨基酸，常选用甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）构成一段具有一定弹性及蛋白酶抗性的多肽，其序列为（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）3，其作用是既连接VH、VL，又保持一定的灵活性，使VH、VL的功能区间在折叠后仍可配对。优点：分子小，容易进入组织（包括肿瘤），可用于肿瘤的诊断和治疗；因其为单链，易于进行分子改造；体内半衰期短、免疫原性低。10、试以环糊精为例说明模拟酶制备的基本原理 环糊精（CD）是一种优良的模拟酶，可提供一个疏水的结合部位并能与一些无机和有机分子形成包结络合物，以此影响和催化一些反应。环糊精分子是由多个D-（+）-吡喃葡萄糖残基通过a-1,4糖苷键连接而成。每个葡萄糖残基呈现无扭曲变形的椅式构象，整个分子组成略呈锥形的圆筒，分子内有空穴。环糊精分子的疏水区处于空穴内侧，亲水区处于环状分子外侧。当一个与环糊精的空穴相适应的疏水分子遇到环糊精时，则进入它的空穴中与之“契合”（包结）。在环糊精催化反应时，参与反应的底物分子先被环糊精分子包结，再与其发生反应，这与酶促反应十分相似。三、技术方法1、基因工程药物制造流程 获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌（或细胞）培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装2、试述获得目的基因的一种方法1）鸟枪法：随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。局限性：工作量较大，需要了解目的基因的背景知识；不能获得最小长度的目的基因；不能除去真核生物目的基因的内含子结构。2）cDNA法（反转录法）mRNA的纯化cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成自身引导法：获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失置换合成法：获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失双链cDNA的克隆平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收目的cDNA文库的鉴定局限性：并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；细菌或原核生物的mRNA半衰期很短；mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难；仅限于克隆蛋白质编码基因3）PCR法PCR法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。4）化学合成法较小分子蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成必须已知目的基因的核苷酸排列顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段退火成为两端形成粘性末端的双链DNA片段按正确的次序退火使连接成较长的DNA片段再用连接酶连接成完整的基因局限性：不能合成太长的基因；遗传密码的简并性，中性突变；费用较高3、如何将目的基因与载体进行连接(几种末端的连接策略)1）应用相同或不同的限制性内切酶酶切目的基因和载体，产生相互互补的粘性末端2）将非互补粘性末端改造、修饰成完全平头或形成相互互补的粘性末端3）平头末端直接与载体连接4）平头末端分别加同聚物尾5）加装人工接头引入酶切口4、单克隆抗体制备的流程，并简要说明每一步骤的理论依据。1）抗原与动物免疫制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫多数抗原物为混合物，须经免疫、筛选、克隆化为使杂交瘤细胞稳定，一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫免疫方法：体内免疫法和体外免疫法2）细胞融合与杂交瘤细胞的选择细胞融合的方法：取适量脾细胞（1108）与骨髓瘤细胞（23107）进行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。细胞融合后可产生多种融合：脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合细胞选择性培养基：HAT培养液、次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶（T） A阻断DNA合成3）筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。常用的克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法。4）杂交瘤细胞抗体性状的鉴定对杂交瘤细胞进行染色体分析，既是鉴定的客观指标，又能了解其分泌抗体的能力。可用羊或兔抗Ig不同类和亚类的抗体，进行免疫扩散或ELISA法来鉴定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。此外还须进行亲和力、特异性、纯度和识别抗原的相对分子质量等进行测定。5）单克隆抗体的大量制备体外培养法：可获得10 g/ml的抗体动物体内诱生法：可获得520 mg/ml的抗体BALB/c小鼠提前几周腹腔注射降脂烷接种杂交瘤细胞取腹水离心取上清6）单克隆抗体的纯化依单克隆抗体Ig的类和亚类的不同，采用各种不同的纯化方法。动物体内诱生法制备的单克隆抗体的纯化过程如下：澄清和沉淀处理：离心、取上清、超滤、盐析分离：凝胶过滤用于IgG和IgM类单克隆抗体的分离纯化 阴离子交换层析用于IgG类单克隆抗体的分离纯化 亲和层析用于IgG类单克隆抗体的分离纯化5、简要说明酶的固定化方法1）载体结合法物理吸附法：通过氢键、疏水作用、电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶性载体上，从而制成固定化酶。有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等无机载体：活性炭、氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等离子结合法：是酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上的固定化方法。共价结合法：使酶分子上非活性部位功能团与载体表面活性基团之间发生化学反应而形成共价键的连接方法。2）交联法：是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。3）包埋法：酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在高分子凝胶细微网格中或高分子半透膜中，分为网格型和微囊型两种。只适用于小分子底物和产物的酶。6、固定化酶反应器的类型特点及选择依据固定化酶反应器的类型特点：1）间歇式搅拌罐反应器：用于游离酶反应后随即放料2）连续流动搅拌罐反应器：连续进料、连续出料3）填充床反应器：固定化酶填充于床层内，反应器内的流体的流动形态为平推流形，底物以恒定流速通过反应床。4）流化床反应器：底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的。5）循环反应器：部分反应液流出，和新加入的底物流入液混合，再进入反应床进行循环。6）连续流动搅拌罐-超滤膜反应器：由连续流动搅拌罐反应器和超滤装置组合而成的反应器，它在连续流动搅拌罐的出口处装有半透膜。7）其他反应器反应器的选择依据：根据固定化酶的形状来选择根据底物的物理性质来选择根据酶反应的动力学特性来选择根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择根据操作要求及反应器费用来选择四、实践与进展 1、已知拟南芥中某一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，请选择一种单细胞微生物，设计一个实验流程确保能得到最终产物。酵母是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物，其基因组小，世代时间短，有单倍体、双倍体两种形式。酵母繁殖迅速，可以廉价地大规模培养，而且没有毒性。能够将所表达的产物直接分泌出细胞外，从而大大简化了产物的分离纯化工艺。表达产物能糖基化。因此，选择酵母作为宿主菌。流程：获得目的基因（人工化学合成法或染色体DNA的限制性内切酶酶切）组建重组质粒构建基因工程菌（选择酵母作为宿主菌）培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定最终产物2、最近发现一种新型病毒，你如何开发一种该病毒的诊断试剂？利用血清学鉴定的原理，设计血清学鉴定用的抗体试剂作为诊断试剂。参照HBsAg的反向被动血凝诊断试剂的制备，设计流程如下：1）制备该新型病毒抗原；2）用病毒抗原免疫豚鼠，获得抗病毒血清，提取相应特异性抗体；3）将人新鲜“O”型红细胞用丙酮和甲醛处理4）用纯化的抗病毒血清致敏醛化血细胞5）洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。3、某质粒载体具有Tetr和Kanr表型，在Kan抗性基因内有一Bgl的切点。现用Bgl切割该载体进行外源基因克隆，问：（1）重组质粒转化后涂皿时应加什么样的抗生素？ 四环素Tet（2）培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型？ 抗四环素Tetr（3）如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体？ 外源DNA片段插入在质粒Kanr基因的编码序列内，使该基因失活；体外重组反应混合物转化给大肠杆菌TetsKans菌株，并涂布在Tet平板上，凡获得了该质粒和重组质粒（TetrKans）的寄主细胞都可长成菌落；将Tet平板上的菌落原位影印在含Kan平板上生长，对比这两个平板的菌落生长情况，凡在Tet平板上能够生长而在Kan平板上不能生长的菌落，便是属于带有重组体质粒的转化子克隆；挑出这样的阳性克隆，扩增分离含有插入片段的重组体。4、设计一种筛选杂交瘤细胞的实验方法，并简要说明基本原理。基本原理：由于SP2/0等骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺乏株，脾细胞内却有这种酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT，用次黄嘌呤