【毕业学位论文】（Word原稿）小麦（Triticum aestivum L.）矮秆基因Rht-B1和Rht-D序列多样性分析及Rht-D1c基因组区段分析生物化学与分子生物学博士论文

密级：内部 5 年 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 小麦 （ .） 矮秆基因 因组区段分析 of of in of of in 目 录 摘 要 . i . 一章 文献综述 . 1 1 小麦矮秆基因的鉴定与利用 . 1 麦矮秆基因的鉴定 . 1 源在矮化育种中的利用 . 5 2 小麦矮秆基因的致矮机理研 究 . 6 麦矮秆基因 基因克隆 . 6 白在植物矮化中的作用 . 7 3 立题意义及技术路线 . 10 题意义 . 10 术路线 . 12 第二章 我国主要矮源材料的同源基因 克隆及序列分析 . 13 1 材料与方法： . 13 料： . 13 法： . 13 2 结果与分析 . 20 用 . 20 矮秆材料中同源克隆 因 . 20 3 讨论： . 27 国小麦矮秆亲本中的矮秆基因 . 27 秆基因的保守性分析 . 27 第三章 矮变 1 号致矮机理初探 . 28 1 材料与方法 . 28 料： . 28 法： . 28 2 结果与分析 . 38 秆基因重复的发现 . 38 变 1 号重复片段大小的确定 . 41 交 . 47 时定量 . 48 克隆 1303列比较及 库筛选 . 49 3 讨论 . 50 变 1 号大片段重复断裂点的寻找和片段大小的确定 . 50 变 1 号致矮原因分析 . 51 否为等位基因的思考 . 52 第四章 全文结论 . 54 一 我国主要矮源材料的同源基因克隆及序列分析 . 54 (1) 各个材料矮秆基因分析 . 54 (2) 矮秆基因 3的重复序列区同源序列克隆及分析 . 54 二 矮变 1 号致矮机理初探 . 54 (1) 交确定矮变 1 号在 4D 染色体上发生了重复事件 . 54 (3) 实时定量 结果 . 55 参考文献 . 56 附录：主要试剂配方 . 65 致 谢 . 71 作 者 简 介 . 72 i 摘 要 矮秆基因 的开发与利用对世界小麦产量产生了巨大的推动作用，引发了一场举世闻名的“绿色革命”。明确不同矮秆亲本中的矮秆基因，研究其多样性与致矮机理，对于小麦遗传育种有着重要的理论意义与应用价值。 利用基因组特异的引物对 F 号、矮秆早、辉县红、蚰包、古城营、水源 86、农林 10 号、高秆对照品种中国春和粗山羊草（ 行了矮秆基因全长（包括部分 5整 终止子后的 13 个碱基和 3）扩增测序。结果发现：（ 1）我国小麦矮秆亲本辉县红、蚰包、古城营携带矮秆基因 矮秆早、农林 10 号和水源 86 携带矮秆基因 （ 2）不同矮秆材料相同矮秆基因的部分 5整编码区甚至 3后的重复序列均完全相同；高秆材料中国春中的 其相对应的矮秆基因仅在编码区有一个碱基的差异；粗山羊草 （ 因的 3与栽培品种存在着 2 个碱基的差异。以上结果说明该基因的 列非常保守。 矮变 1 号是我国特有的一个小麦矮秆种质资源，因其也是目前世界上植株最矮，降秆作用最强的一个矮源。序列分析发现矮变 1 号所携带的矮秆基因 启动子区和编码区与 全相同。 交揭示该基因所在的一个 1000上的大片段发生了2 次以上重复。 交和 析发现矮变 1 号的矮秆基因 表达量显著高于其野生型矮秆早，因此推断矮变 1 号的致矮机制是由于其矮秆基因重复后的剂量效应引起的。 关键词 ：小麦，矮秆基因，同源序列，多样性， 片段重复 in 960s 970s of by on it is F - to of in be in , 6, 0, e. a no We to in no in kb in by ht is a is in is of DS i DS as CR i It . a to to a . 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 小麦是世界第二大粮食作物，也是我国最重要的粮食作物之一。由于小麦矮秆和 半矮秆品种的广泛推广以及相应栽培技术的采用，从 1960得无数的人免于饥荒，这就是所谓的绿色革命 (et 1985;993;996;997;001)。绿色革命对粮食产量、社会 经济条件和环境可持续性都 有重大的影响。矮化植株的作用主要是增强耐肥抗倒伏性和增大收获指数，从而提高产量潜力 (985)。因此半矮秆小麦所具有的坚硬茎秆和抗倒伏性已为育种界普遍重视，并取得了显著育种成效。本章将回顾小麦矮秆基因的鉴定与利用及分子机制方面的研究进展。 1 小麦矮秆基因的鉴定与利用 麦矮秆基因的鉴定 英国 1959 年首次采用赤霉素化学标记法研究矮源，后来 士在几十年的研究实践中进一步证明了这是一种有效的矮秆基因源的鉴定方法。迄今，己鉴定并统一编号的降秆基因有 21 个 (988;董玉琛 et 2000)。上述 21 个降秆基因的染色体位置、品种来源、显隐性关系及其对赤霉素反应见表 1。虽然鉴定了 21个矮秆基因，但是研究主要集 中在 、 、 。 矮源的株高由于受外界环境条件及自身的遗传背景影响较大而进展缓慢。直到 1973年， et 1973)，而且赤霉素不敏感和矮秆、半矮秆这两个性状由于在分离世代种不发生分离所以推断这两个性状可能由同一个基因决定，使得矮秆基因及矮源的研究利用取得了突破性进展。 、 基因的研究 在小麦中，有两个赤霉素不敏感的位点 每个位点又鉴定了一系列的具有不同致矮效应的矮秆基因。 秆 ) , )和 . 点有四个等位基因： 高秆 ), ), a)(et 1998)。 、 、 这四个基因的赤霉素不敏感程度和降秆强度有关。相对而言 ， 为强降秆基因，它们的种子和幼苗对赤霉素处理不敏感， 、 为弱降秆基因，它们的幼苗对赤霉素反应不敏感，而种子胚乳对赤霉素处理敏感。据此有研究者对 、 、 进行了等位性测验发现： 、 等位基因 (et 1976)。 84 ，并且距离着丝点的距离小于 5et 1995)。然而 发现与 4记 标记定位在距离着丝点 45et 1995)，这个结果说明这两个位点不具有共线性，或者说明远离的重组在 08作图群体中受到强烈的抑制 (et 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 2 1997)。通过端体分析定位了 分别距离着丝点的距离为 1315130et 1975;et 1978;et 1983)。尽管 和 距离着丝点的距离相差很大，等位性测验表明这两个基因仍然是等位的 (et 1988)。就降秆强度而言， 8%， 减少 23%， 株高约 11%(程志军 et 1995) 。 矮秆基因作用于 营养器官的 细胞的长度而对细胞的分裂没有影响 (et 1998)。 表 1 21个矮秆基因 (988;董玉琛 et 2000) 1 和 部分显性基因来源于农林 10 号等 生品种，分别位于 4 4色体上 (et 1975;976)，对 应不敏感。这两个基因于 1999 年克隆 (et 1999)。 利用 (et 1999)的研究结果，开发了和 基因特异的 物，通过 增便可以鉴定材料所含基因符号 来源 表现性效应 染色体定位 显隐性 对 应 R h t 1 农林 10 号等 D a r u m a 衍生品种 降秆 24% 4 B S 1 3 c M 部分 显性 不敏感 R h t 2 农林 10 号等 D a r u m a 衍生品种 降秆 24% 4 D S 1 5 c M 部分 显性 不敏感 R h t 3 大拇指矮 ( T o m T h u m b ) 降秆 64% 4 B S 1 3 c M 部分显性 不敏感 R h t 4 B u r t 辐射突变体 降秆 4 5 % 隐性 敏感 R h t 5 M a r f e d E M S 诱变体 降秆 50% 部分显性 敏感 R h t 6 B u r t 隐性 敏感 R h t 7 B e r s e e E M S 诱变体 降秆 2 4 % 2A 隐性 敏感 R h t 8 赤小麦 2 D L 隐性 敏感 R h t 9 赤小麦 7 B S 隐性 敏感 R h t 1 0 矮变 1 号 降秆 64% 以上 4 D S 5 0 c M 不完全显性 不敏感 R h t 1 1 K a r l i k l 无芒 1 号诱变体 隐性 不敏感 R h t 1 2 K a r c a g 5 2 2 辐射突变体 降秆 4 6 % 5A 显性 不敏感 R h t 1 3 M a g m f 4 1 诱变体 降秆 2 4 % 隐性 不敏感 R h t 1 4 C a s t e l p o r z i a n o , C a p p e l l i 的 诱变体 降秆 3 4 % 部分显性 不敏感 R h t 1 5 D u r o x ， K 6 8 0 0 7 0 7 的诱变体（硬粒小麦） 隐性 不敏感 R h t 1 6 E d r n o r e 诱变体（硬粒小麦） 部分显性 不敏感 R h t 1 7 C h r i s 诱变体 隐性 不敏感 R h t 1 8 I c a r o , A n h i n g h 诱变体（硬粒小麦） 部分显性 不敏感 R h t 1 9 V i c 诱变体（硬粒小麦） 部分显性 不敏感 R h t 2 0 B u r t 诱变体 隐性 不敏感 R h t 2 1 X N 0 0 0 4 2 A S 部分显性 不敏感 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 3 有的矮秆基因类型 (et 2002)。 和 冬小麦的农艺性状都有影响。李杏谱以冬小麦品种背景培育了几个近等基因系，研究了 和 小麦农艺性状的作用。研究结果表明 著提高了单株穗数、粒数和粒重、地上部分生物产量、经济系数和倒二叶面积； 著提高了单株 （或单穗）粒数和粒重、经济系数和倒二叶面积，显著降低了千粒重 (李杏谱 et 1998)。 研究认为， 和 单独存在时 ,对单穗重、千粒重、单株籽粒产量影响不显著。 J 等报道， 和 能减少小麦蛋白质的含量 (et 1999)；而 等研究表明，在中欧含 基因的品种易获得高产，加工面包用的小麦品种多数含 基因 (P et 1998)。 和 两个半矮秆基因对产量的作用大小不同学者的观点有所分歧。 (1984)认为两者没有本质上的差异，而 (1980)则认为 的产量显著高于 。 (1991)研究表明，具有 基因的品系比具有 品系产量高 ，众说纷纭。根据 列水平上的研究揭示 (999)， 和 在 列上野生型和突变性之间都是单碱基的替换提前形成终止密码子造成 的缺失。二者在对赤霉素的反应上而引起矮化的原因是相似的，所以推测它们对产量的影响应该本质上没有差异，因此认为产量上的差异可能是由于环境因素引起的。 另外，在 25条件下，此温度对高秆材料叶片长度有很大的延伸，含有 基因型的材料叶片延伸较少，含有两个矮秆基因的 +因型、 因型和 3 基因型的材料没有影响 (et 1989)。 因的研究 性基因，来源于大拇指矮，中国西藏的一个品种，位于 4et 1972)，对 离 30.6 et 1998)。 淀粉酶 1表达有影响，因此对 样可以抵抗收获前穗发芽。 目前抗穗发芽能力最强的矮秆基因 (傅大雄 et 2005)。 以小麦大拇指 矮的近等基因系及其分离群体为材料 , 分析了大拇指矮的矮秆基因 穗发芽的影响。结果表明 万平 et 2001) 含有 因的去胚的糊粉层通过低温处理可以对 生反应， 导后也可以产生反应而变得对赤霉素敏感。 导的赤霉素敏感反应对 浓度有依赖性，敏感强度与低温诱导相似 (et 1986)。 到了两个 记与 遗传距离分别是 7.1 9.2 1 个 记 遗传距离是 8.0 et 2001)。 没有广泛地应用到育种中。然而， 与高秆基因型杂交的 于杂交小麦育种工作者具有很重要的意义 (et 1997)。携 秆基因的半矮秆杂种小麦除抗倒伏能力强外，曾报道其还具有使小麦种子成熟后期 认为这种基因的多效性有利于杂种小麦抗穗发芽、面粉加工品质优良等特点 (et 1983;周文春 1998)。 道携带 因的大拇指矮对赤霉素不敏感，而且 et 中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 4 1975)。周文春等利用小麦品种及其 等基因系的研究结果表明， 有增加每穗粒数的正效应，但同时有降低千粒重的负效应。但用较高粒重的 秆系和粒重超过对照品种的父本组配较易获得粒重具竞争优势的杂种，适于选育半矮秆杂种小麦 (周文春 1998)。张荣铣等发现 , 因 对光合速率、叶绿素含量等具有正向效应 ,但对光合速率值持续期等有负向效应 (张荣铣 1995)。李杏谱等研究认为， 秆基因对单株籽粒、单株产量和穗粒数均有负向作用，但显著提高了千粒重 (李杏谱 et 1999)。 因的研究 别是由辐射诱变和化学诱变得到的赤霉素敏感的矮秆基因。 2005 对其进行了定位分别位于 2 3色体上，并找到了他们的分子标记分别为 005)。 因的研究 性矮秆基因来源于赤小麦，分别位于 2 1920. 000)。 这两个基因不影响 胚芽鞘的长度或者种子萌发力 (et 1999)，并且对表皮细胞有影响 (et 2005)。这两个矮秆基因被引入澳大利亚而取代 et 2000;et 2001)。 微卫星标记 根据这一标记发现，含 et 1998;000)。 卫星标记有005)和 et 2001)， 在 7结果与以前的 者认为可能是由于矮秆基因表达的环境影响或者材料的原因引起的 (005)。周阳用微卫星标记 周阳 et 2003) ： 就全国范围而言 ， 约 42. 3 %的品种含有 但不同生态区的分布频率不同 ； 结合赤霉酸 ( 反应试验 ， 约 20. 6 %的品种同时含有 对 基因的研究 基因是从矮变 1号中鉴定出来，是矮秆早的天然突变株，该基因位于 4降秆作用最强的基因，平均株高只有 25 et 2003） 与分子标记 离分别是 1.5 .8 et 1998)。小麦最终株高除决定于所带的矮秆基因外，还受矮秆基因所处的遗传背景和环境条件的影响。林志珊等的研究结果表明矮变 1号不仅地上部分对赤霉素不敏感，其胚乳组织也不敏感，推测矮变 1号对赤霉素的不敏感受 一主效基因控制，还有其他微效修饰基因的影响 (林志珊 et 1994)。傅大雄等报道， 仅是一个控制普通小麦株高的显性主效目的基因。由于所处核遗传背景的不同， 所在矮源其自身株高与致矮力均可能有很大的差异。因此， 在矮变 1号中所表现出的“极度矮化”和强大致矮能力只是一种特殊形式，通过杂交以调整其核遗传背景之后， 可以有效地用于杂交小麦 (傅大雄 et 1998)。 以 4D 染色体携带 而极度矮化的小麦显性矮秆系“矮变 1号”与中、高秆的现代小麦改良品种杂交 ， 选育出了一批植株较矮变 1号显著提升、以至达到中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 5 小麦育种理想株高的半显性衍生矮秆系 ， 已将其应用于杂交小麦及小麦常规育种。对半显性衍生矮秆系与起始矮秆系矮变 1号矮秆主基因之间的同一性进行了研究。以此提出了小麦显性矮秆基因“微突变”的概念 (傅大雄 et 2001)。 至于 子水平上的致矮机制还未见报道。 因的研究 源于 22 的辐射突变体，在 5色体上，与芒抑制基因 密连锁，对应不敏感。 有很强的降低株高效应 (46%)，其矮秆性遗传接近完全显性。 秆等基因系的开花期比相应的亲本晚 6 d。 秆系的株高变化很大。由同一品种转育的 株高变动于 50 90秆系在后期还出现早衰 (赵寅槐 )。其中， 、 、 用 行了分子标记。由于研究所用的材料不同， 使 有不同的遗传背景和处于不同的环境，这可能就使上述研究结果彼此有差异。因此，在实际应用中，应选择与当地生态环境相似的条件下的研究结论作为理论依据。 7005)。另外，丛簇矮生性基因 及独秆基因 ，因其缺点很多没有在育种上得到利用，研究报道很少。 源在矮化育种中的利用 矮秆小麦的研究利用开始于 19世纪末。日本育种家可能是最早注意到矮源的利用的。当时澳大利亚的 本世纪初开始据统计，多数国家和地区麦区种植半矮秆小麦品种超过 80%（见表 2）。从表 2可以看出，矮源在小麦育种上的应用越来越广泛。在矮秆资源的利用中，日本的赤小麦 (达摩 (小麦矮化育种中得到了 最广泛的利用，并取得了显著的成效。 表 2 利用矮源育成的半矮秆小麦的种植情况（ 1997） (徐相波 et 2001) of 1997) 国家 /地区 播种面积比例 % 国家 /地区 播种面积比例 % 国家 /地区 播种面积比例 % 埃塞俄比亚 51 印度 92 墨西哥 99 东部和南部 66 南亚 92 墨西哥中 99 非洲 美洲 埃及 98 伊朗 69 秘鲁 83 北部非洲 88 西亚 59 安第斯地区 85 尼日利亚 99 中国 79 巴西 53 小麦的利用 意大利的 1911 年从日本引进的赤小麦，用作为早熟矮秆亲本，育成了 品种。这些品种不但成为意大利小麦育种的骨干材料，而且在世界许多国中国农业科学院博士学位论文 第一章 文献综述 6 家都得到广泛利用。意大利的 引进我国后，分别命名为中农 28、矮立多、南大 2419、阿夫、阿勃等，在提高我国小麦生产上发挥了很大作用。据报道，在南欧和中欧一些地区的小麦品种主要含有赤小麦的矮源 (金善宝 1994;et 1998;董玉琛 殿升 2000)。 摩小麦的利用 1935 年日本用达摩小麦与美国品种杂交育成了著名的矮秆品种农林 10 号。以农林 10 号作为骨干亲本，在世界范围内选育出了一系列半矮秆小麦推广品种，如我国间接利用农林 10 号育成了矮丰 3 号等品种。据统计，在美国刊登的小麦品种中，有 40%具有农林 10 号矮秆基因。据 B 报道，在最近 20 年，英国的绝大多数小麦品种都含有农林 10 号矮秆基因 (金善宝 1994;999;董玉琛 殿升 2000)。其它矮源，如原产我国西藏的大拇指矮、从品种矮秆早中发现的矮变 1