关于TTC和Evans blue双染色.doc

关于TTC和Evans blue双染色 ?我 最 近 在 做 心 肌 再 灌 注 损 伤 后 药 物保 护 作 用 方 面 的 课 题 ,心 肌 梗 死 面 积 的 估 算 采 用 的 是 TTC和Evans blue双染色,即 首先把 心脏用vans Blue进行冠脉灌流，判定出缺血区（不能被染成蓝色）；再用TTC进行染色，判断出坏死区（不能被染成红色),但 我 做 Evans blue这 里 老 是 做 不 好 ,分 不 出 红 色 和 蓝 色 ,所 以 就 想 单 独 用 TTC染 色 来 估 算 面 积 ,不 知 这 种 可 行 性 如 何 ,还 请 大 家指 点 . Enjoyinglife 发表于 2009-9-4 09:56 AM你好，我也要做这个实验了，但是我还没搞清除伊文氏蓝是不是用生理盐水配，TTC是不是用蒸馏水配(好象不是)，你能不能指点我一下，谢谢！ ni478 发表于 2009-9-4 10:35 AM我也在做同样的东西，给你看看这个吧，挺有用的。 lanuit 发表于 2009-9-4 11:14 AM谢谢，你给的东西帮助很大，不过我在实验中遇到了一个问题：我们是在静脉注射evans blue，大约56ml，可以从心脏表面看到有染蓝和未染蓝的部分，但是，用TTC染色后，可以看到TTC未染好的部分（颜色）很浅，应该就是梗死区，可是其它部分都是红的，除了表皮上的蓝色外，没有看到里面的组织有蓝色，是不是本来就这样？还是我的实验有问题？ dashowertk 发表于 2009-9-4 11:53 AM我今天也做了，结果只有心脏表明有蓝色，里面都没有染色。EB溶液在心脏内多长时间可以去冲洗啊 lyping 发表于 2009-9-4 12:33 PM我是做心肌缺血的。TTC染色后全是红色不知道什么原因了 dashuiniu 发表于 2009-9-4 01:12 PM从静脉注射伊文斯蓝是正确的做法，因为冠状动脉注射你不能保证溶剂就刚好通过心脏。为保证心肌细胞不死亡，需用4摄氏度的EB的生理盐水溶剂；可以稍微延长EB在心肌中的时间至3分钟；如果心脏全部为红色，看看是不是TTC的浓度偏高，调节至1%试试。这只是个人建议，愿与你共同学习。 liuxsh7110 发表于 2009-9-4 03:09 PM这个是个总结，都是DXY的各位战友们发的帖子，自己总结的。好久没上论坛了，希望对大家有用附件不知道为什么老是传不上，就在这贴出来吧一、TTC染色原理：TTC（2，3，5氯化三苯基四氮唑）是脂溶性光敏感复合物，1894年首次合成用来检测种子的生存能力，1958年开始用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。它是呼吸链中吡啶核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。二、TTC溶液配制：（10.1M Na2HPO4: 14.2 mg in 1L distilled H2O20.1M NaH2PO4: 12 mgin 1L distilled H2O3Mix 1L 0.1M Na2HPO4 with 0.5L 0.1M NaH2PO4 adjust pH to 7.44Dissolve 1g TTC powder (sigma T 8877) in 100ml phosphate solution注意事项：1、TTC新鲜配置。2、再灌注3小时以上。3、新鲜组织切薄片2mm左右放置TTC溶液内。4、TTC放置37度温箱内15-30分钟。5、如当天显色不好，可从TTC中拿出置入10%甲醛过夜再看。二、心肌缺血和梗死范围测定a. 完成全部采血后，开胸再次钳夹左前降支，于颈静脉注入3Evans 蓝23ml，（也可以切下心脏再从主动脉注入EB但切记原结扎部位一定要重扎紧）。确定未缺血与缺血心肌(未缺血心肌呈蓝色，危险区域不染色)。b.经耳缘静脉推注10%氯化钾（2ml/kg），使心脏停于舒张期,开胸取出心脏。c.生理盐水冲洗心脏，剥离心包后称重。d. 将离体心脏用保鲜膜包裹，置于-20下保存1h，切取左、右心房及右心室标本，从非梗死区纵行切开左心室。e. 将缺血区心室肌以平行于房室沟的方向切成4 片，每片厚12mm。置入1氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸缓冲液(pH7.4)中37水浴1015min。(避光，振荡)f. 10福尔马林固定10ming. 梗死区不染色，未梗死区染为红色，红色区与未染色区之和为缺血区。以梗死心肌（不染色的心肌）与全左心室心肌（染色与不染色的心肌）重量和比值表示心肌梗死面积。h. 未染色切片固定后行组织学检测。Downey JM. Measuring infarct size by the tetrazolium method. In: The ISHR Handbook of Experimental Laboratory Procedures问题：一、我目前正在做梗死心肌的TTC染色，但是结果相当不满意，染色出来的心肌全是红色，无白色梗死区。而我在做TTC染色前已经用Evans blue染色心脏，显示缺血区明显，缺血时间为30分钟。我的具体操作过程如下，请高手指点出其中的错误。1.配制TTC染液：1克TTC/100ml磷酸盐缓冲液（PH7.4），4度冰箱避光保存备用。2.制作心肌缺血模型：麻醉插管开胸结扎冠脉缺血30min1Evans blue染色取心略漂洗心脏置于-20度冰箱冻存1小时（保鲜膜包裹）3.TTC染色：心脏切片约2.5mm厚置于TTC染液中避光，振荡，37恒温染色1520min10福尔马林固定10min。按我这样的程序，做不出预期的结果，请高手分析一下原因或是指导一下关键技术。对于我提到的TTC染色的问题，一直困扰着我。我想心肌全部染成红色，说明了梗死区不明显，既然我结扎是可靠的，那只有一个可能，即是梗死区原有的活性心肌产生的酶尚未被代谢，是不是与我没有行再灌注这个过程有关？再查文献，认为行TTC染色，缺血后再灌注过程是必须的。University of South Alabama的James M. Downey, PhD关于TTC染色写得相当详细，他第一段就有关于这方面的论述：This technique relies on the ability of dehydrogenase enzymes and cofactors in the tissue to react with tetrazolium salts to form a formazan pigment. It can be argued that tissue lacking either of these would not be able to survive and is therefore dead or destined to die. On the other hand, tissue that stains positively is not necessarily healthy and may succumb hours or even days latter. For that reason, the longer the reperfusion period after an ischemic insult, the more reliable the method becomes for discriminating between dead and viable tissue. Reperfusion times of less than 3 hrs (2 hrs for crystalloid-perfused Langendorff hearts) are unreliable with this method since insufficient washout time has occurred. Three days of reperfusion is considered optimal. Unfortunately, the need for a recovery model increases the complexity of a 3-day reperfusion by an order of magnitude. For that reason, most investigators settle on 3-6 hours of reperfusion for an open-chest study. Beyond 3 days of reperfusion remodeling within the infarct again makes the assessment unreliable due to scar shrinkage.因而，行TTC染色结扎冠脉后30分钟，必须要有最好是大于3小时的再灌注时间，这样出来的结果才比较满意。二、做大鼠左动脉前降支结扎30min（也尝试过45，60min）后，再灌注至少3小时以上，取心脏做TTC染色，无梗死面积。肯定结扎上，而且尝试过再灌注后取心脏前再从原位置结扎住前降支，然后染色，仍然不行。单独做结扎6h后，做TTC染色，都可以做出梗死，但如果做再灌注就始终不成功，请问前辈谁知道是什么原因？而且不知道为什么再灌注后，取心脏前文献报导都需要再次结扎住前降支？三、有谁做过关于大鼠心肌缺血再灌注TTC和 Evans blue双染色？关于这方面的研究，国内外大多文献都是缺血30分钟，再灌注2小时，后TTC和 Evans blue双染色，正常心肌蓝色，危险区红色，梗死区灰白色，但是我做过很多次，染出的都是红色！不知是什么原因，有做过这方面实验的请指教！谢谢！1 首先应该检查建模是否成功，（若TTC溶液配置没问题），建议：单用TTC 染色（15分钟）即可见到梗死区，白色。2 如果确定模型成功，注射EVANS BLUE 后非缺血区应该被染兰的，进行TTC染色时候也是不会被冲洗掉的 ，你可以加大EVANS BLUE 浓度，亦可换从升主动脉逆行灌注EVANS BLUE,直视力下确保心肌被EVANS BLUE 正确灌注。为了区分缺血与非缺血区我是在进行TTC染色前即进行照相分析的。四、各位前辈，我现在在做缺血再灌模型实验，心梗面积的检测需使用Evans blue, 我是从主动脉逆行注入，但是做了近三十只大鼠，效果很差，很多都是心腔着色，非常着急，请问是否有做这方面的高手给我指点一下，万分感谢！贡献一点个人经验。我做大鼠和小鼠的冠状动脉血管造影，用此方法，效果很好。1、颈静脉插管2、暴露升主动脉3、颈静脉灌注造影剂4、数秒后，造影剂到达左心室5、立即用血管钳夹住升主动脉，逼迫左心室射血全部进入冠状动脉。6、立刻用血管钳夹住所有心脏上方的大血管，摘取心脏。（保留Evens blue 在冠状血管内。在大量液体灌注时，冠状动脉入口的阻力大于主动脉瓣的阻力，从主动脉逆向灌注，压力过强，会使造影剂进入左心室，压力过小，造影剂进不了冠状动脉。所以我设计阻断主动脉，令左心室射出的造影剂无路可走，逼进冠状动脉。掌握好时间，会给你意外的欣喜效果。五、我现在做大鼠缺血再灌后TTC和Evans Blue双重染色，发现在把切片放在37度水浴箱行TTC染色后，心肌切片就开始皱缩的很厉害，非常难看，有没有做过TTC的朋友知道这种情况，请指导一下。_我是把心肌切片放在培养皿里面，就是直径大的那一半，然后把培养皿直径小的那一半倒着放（底部就会直接压着心肌标本），这样就不会皱缩。我的体会就是你标本从冰箱取出后要迅速切下来，在它还没皱缩之前就迅速把它放在培养皿里面，注入TTC溶液，然后把另外一半的培养皿压在上面，或者用玻片压也可以，反正就是平的东西压在上面就可以了，注意，压在上面的东西也不能太重，不然心肌就压的不成样子了。 kaixin831120 发表于 2009-9-4 03:48 PM我最近也在做这个染色，也是染不出白色的梗死区域。另外我还有个疑问：实验结束时，再次结扎冠脉后，Evans blue是否可以从颈总动脉注入？我从颈总动脉注入后，可以看到心脏的蓝色和红色分界比较清楚。 Tiankong 发表于 2009-9-4 04:27 PM伊文斯蓝-TTC双重染色的帖子应该顶起来！请问：（1）为什么在从颈动脉注入伊文斯蓝时要将左前降支给结扎了？ （2）10