高效液相色谱快速测定茶叶中儿茶素的含量.doc

高效液相色谱快速测定茶叶中儿茶素的含量46湖北化工2003年第l期高效液相色谱快速测定茶叶中儿茶素的含量罗晓明.蒋雪薇(长沙电力学院分析测试中心,湖南长沙410015)摘要:分析了酸的种类及pH对高效液相色谱(HPLC)法测定袁儿荼素(EC),袁没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),表儿茶素没食子酸酯(ECG),袁没食子儿茶素(EGC),儿茶素(C)和咖啡因的影响.实验表明:酸尤其是乙酸不仅能改善各组分的峰形.而且对保留时间和出峰顺序均有较大的影响.确定了简单,快速分析5种儿茶素及咖啡因的高效液相色谱分析方法.采用Cls反相柱.水一甲醇一乙酸(73.0/23.0/2.0)为流动相.在流速为1.0mL?min_.柱温3O.检测波长280am时等度洗脱分析样品.分析时间仅为25min,线性范围为0.890mg?mL(r一0.9980.999),回收率为98.2%100.3.检测限为5lOng.关键词:茶;儿茶素;咖啡因;分析;高效液相色谱中图分类号:TS2020657.72文献标识码:A文章编号:10040404(2003)010046031前言茶多酚(TeaPolyphnenols,简称TP)是存在于茶叶中的多羟基酚类化合物,其中大部分为儿茶素.目前分离的儿茶素有没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),表儿茶素没食子酸酯(ECG),表没食子儿茶素(EGC),表儿茶素(EC),儿茶素(C)等.具有多种生物活性,应用广泛1.目前,儿茶素的分析方法有容量法,比色法,原子吸收法,色谱法5,其中高效液相色谱(HPLC)法由于具有精确,简单,快捷的特点,现已成为分析茶叶中各组分的主要方法.作者详细分析了HPLC的分析条件及影响因素,力图得到一个准确,简单,快捷而又有良好重现性的分析方法.2实验方法2.1实验仪器与试剂Icl0高效液相色谱仪(sHIMADZU);SCLIOA紫外可见检测器(SH!NADSU);AlhimaC.8色谱柱(5tx4.6x250mm,ATTECH);CR7A数据处理仪(SHIMADzU);Qi00型超声清洗仪(江苏);玻璃滤器(5,25m);数值型温控水浴锅.EC,ECG,EGCG,GA,EGC(>95,SIGMA);咖啡因(生化,上海);甲醇,乙醇,磷酸,柠檬酸,乙酸,甲酸等均为分析纯;实验用茶为湖南云雾(市场购买),实验用水为蒸馏水(所用试剂进色谱仪前均采用5玻璃滤器过滤除杂2.2实验方法2.2.1标准溶液的配制准确称取一定量的EC,EGCG,EGC,ECG,咖啡因,加入lOmL甲醇:水:乙酸一25:74.5:0.5的溶液,用超声溶解10min,移人25mL棕色容量瓶中,用相同溶剂稀释至刻度,摇匀,分别配制成i00.0,200.0,300.0,400.0,500.0mg?L的标准溶液及标准混合溶液于一7O-C下保存.2.2.2茶多酚的提取称取茶叶3g,用质量分数为4O的乙醇溶液在温度40C的条件下浸提3次,每次10min,浸提液过滤后稀释至500mL,0.45m的微孔滤膜过滤后直接用于分析嘲.2.3茶多酚的HPLC分析按实验设计在流动相加人一定量的酸,经5*滤器过滤后超声波混合脱气l520min.在3O,流速1.0mL?min的条件下分析样品.根据标准样品的保留时间判断各组分的出峰位置,外标法计算各组分的含量.3结果与讨论3.1色谱条件的选择3.1.1流动相的选择实验采用甲醇一乙酸一水(25/0.5/74.5,体积比),乙氰一乙酸一水(14/0.5/85.5,体积比),甲醇一水(25/75,体积比),乙醇水一乙酸(13/86.5/0.5,体积比)等多种体系9等度洗脱分析了绿茶中的儿茶素,进样量6L,流速1.0mL?min_.,实验结果如表l.基金项目:湖南省科技厅重点资助项目(编号:OONKW1010)收稿日期:200212一l1.作者简介:罗晓明(1968一),男.2001年中南大学化学化工学院研究生毕业.主要从事教学和科研工作.2003年第1期罗晓明等:高效液相色谱快速测定茶叶中儿茶素的含量47表l不同流动相下茶多酚各组分的保留时间Tab.1Retentntimeofcomposition流动相中使用甲醇时,绿茶中各组分的出峰顺序为EGC,EGCG,CAF,EC,ECG.而采用乙氰时为EGC,CAF,EC,EGCG,ECG.同时值得注意的是,虽然儿茶素各组分的最大吸收波长在270280nm之间,但它们在210nm时显示出的吸收值是280nm的630倍1o,然而,由于甲醇在280nm分析时信噪比较小,本实验仍采用280nm作为检测波长,流动相采用甲醇体系,不同甲醇浓度对儿茶素的保留时间和分离度的影响见图1.结果表明:流动相中甲醇浓度在22.59,627.59,6时均可以实现各组分的分离,其最佳浓度为25左右,且儿茶素与咖啡因容量因子的对数之间均呈负相关.图l甲醇浓度对窖量因子的影响【FiglEffect0fvolumepmpoflnofmethanolinmobilephaseonpacityfact0rofcompositnonCi8column)1.EGC2.C3.EGCG4.CAF5.EC6.ECG3.1.2酸的种类与pH对分析的影响图2流动相中乙酸比例对容量因子的影响【Fi备2Efftofvolumeproportionofaticinmobilephaseonpacityfact0r0fcompositiononCI8column)1.EGC2.C3.EGCG4.CAF5.EC6.EcG作者在各文献的基础上,选用甲酸,乙酸,柠檬酸,磷酸等多种酸进行了分析,考虑到ODS柱对酸的承受能力,控制流动相pH>2.5,(CHOH)为25,实验结果如图2.从图2可以看出:酸不仅能改变儿茶素各组分的峰形,而且对分析周期和出峰顺序也有影响.与其它酸不同的是:儿茶素与咖啡因的容量因子随乙酸用量的增加而下降,分析时间由56min降至23min,且体系中各种儿茶素保留时间下降较快,咖啡因保留时间下降较慢,乙酸用量为0.11.0时,出峰顺序为GA,EGC,C,EGCG,CAF,EC,ECG,而1.02.0时,EC则先于CAF出峰,其它组分出峰顺序不变.甲酸,柠檬酸,磷酸虽然也可以缩短茶多酚的分析时间,但主要体现在pH的改变,即加入一定的酸后引起的茶多酚酚羟基电离度的改变,从而缩短分析时间,以后再加入酸时,由于电离度改变不大,分析时间下降较慢.加入等量乙酸时的分析时间明显小于加入同样量乙醇的分析时间,由于乙醇的溶剂强度大于乙酸,在加入量相同的条件下,应有醇<酸,因此乙酸对儿茶素分析时间的改变应是酸度与洗脱强度共同作用的结果.因此,为了缩短分析时间,本实验采用水一甲醇一乙酸(73.0/23.0/2.0)作为流动相.3.2回收率与精密度实验在已知浓度的儿茶素混合样品中,加入不同量的儿茶素标准品,再按上述操作步骤进行测定,扣除标品中原有的儿茶素含量,计算各儿茶素的回收率与精密度,结果见表2.表2Tab.2回收率与精密度测定结果(n:6)Recoveandprecnofthemethod貅mgL黑mgLmgL.u/071_193.851.292.792.815.192.6O6.122.042.562.595.682.866.932.322.887.152.405.895.9O7.563.839.223.07m8642Oo13|J1一A8加%寻如加的舳加扎蚍m呱魄呱m259262935870848舭m蓦三魄粼呱m粼m湖.00000砌绷如一眦眦.c42O8642O,I,】基0点rJ暑i048罗晓明等:高效液相色谱快速测定茶叶中儿茶素的含量2003年第1期3.3线性关系yEGc一-4546+78398X,r一0.998;Yc一一93.3+采用甲醇:水:乙酸一25:73:2.0为流动相,1l727X,r-0.999.对不同浓度的标准混合溶液进行分析,以峰面积对应3.4方法应用儿茶素各组分的浓度进行线性回归,得线性回归方程按2.2.2的方法提取制备茶多酚溶液,按本文确为:y一5021+251429X,r一0.998;y=172+定的方法测定红茶,绿茶中各成分的含量,结果见表8527X,r一0.998;YEc一一36+4823X,r一0.999;3.表3茶提取物的组成及得率(n一5)Tab.3Yieldandcompositionofteaextracts(5)Percentofdryleaves(质量百分比);Eachvaluepresentsmean4-SE由于茶多酚易被氧化,采用水溶液制备的茶多酚5溶液应存放在冰箱中,且只能在12h内使用.本实验采用109,6的乙醇溶液,用乙酸调节pH一3.0,超声波脱气后存放,可以有效地阻止茶多酚的氧化引,提取溶r液的使用时间可延长至20d.参考文献:1Nakagama,eta1.Teacatechinsupplementationincreaseantioxidantcapacityandpreventsphospholipidhydroperoxidationinplss一7maofhumansJ,JAgricFoodChem,1999,47(10):39673973.zKondoK,eta1.Scavengingmechanismsof(一)一epigallocatechingallateand(一)一epicatechingallateonperoxylradicalsandfor一83mationofsuperoxideduringtheinhibitoryactionJ.FreeRadicalBiolMed,1999,27(7/8):855863.93ChungFungLung,eta1.Thepreventionoflungcancerinducedbyatobacco-specificcarcinogeninrodentsbygreenandblackteaJ.ProcSocExpBiolMed,1999,220(4):244248.1O34罗晓明,等.茶多酚的提取及在化妆品中的应用J.湖南轻工业高等专科学校,2001.3(3):3-7.JosephlJDalluge,eta1.Selectionofcolumnandgradientelutionsystemfortheseparationofcatechinsingreenteausinghighper?formanceliquidchromatographyJ.JournalofChromatographyA.1998.793:265-274.NakakuliRA,eta1.Rapidanalysisofmethylatedxanthinesintessbyanimprovedhighperformanceliquidchromatographicmeth-odusingapolyvinylpolypyrroridoneprecolumnJ.J-Chromatogr-A.1999,848(12):523527.KumamotoM,eta1.EnhancedseparationandelutionofcatechinsinHPLCusingmixedsolventsofwater,acetonitrileandethylacetateasthemobilephaseJ.Anal-Sci.2000,16(z):139144.罗晓明,等.茶多酚浸提工艺研究J.食品工业科技,2002.23(3):4143.NelsonBrantC,eta1.Theseparationofgreenteacatechinsbymi-cellarelectrocellarelectrokinrticchromatographyJ.JMicrocolumn,1998,10(8):671-679.BronnerWE,eta1.MethodfordeterminingthecontentoIcate-chinsinteainfusionsbyhighperformanceliquidchromatographJ.JChromatogrA.1998,805:13714z.ARapidDetectionofCatechinsandCaffeineinTea-leavesbyHighPerformanceLiquidChromatographLUOXiao-ming,JIANGXue-wei(ChangshaUniversityofElectricPozoer,Changsha4loo15,China)Abstract:EffectsofacidandpHonhighperformanceliquidchromatograph(HPLC)for(一)一epigallocatechin3一gallate(EGCG),(一)一epicatechin(EC),(一)一epicatechin一3一gallate(ECG),(+)一catechin,(一)一epigallocatechin(EGC)andcaffeinewasdiscussed.Effectofacidespeciallyaceticacidonnotonlypeakshapeofcompositionbutletenliontimeandelutionorderwasresulted.AsimpleandfastHPLCmethodusinganODScolumn(4.6250mm)andwatermethanolaceticacid(73.o/25.0/2.0)mobilephasesystemwasd