生化实验论文

小鼠肝脏过氧化氢酶 的 制备与测定 小组成员 李 朋 10011140010 邱方洲 10011140016 武 浩 10011140020 谢 黎 10011140022 2010 级一大班法医 2012 年 1 月 3 日 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 过氧化氢酶 Catalase 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶 尤其在动物的肝脏 肾脏 红细胞中含量较多 其生物学功能是催化细胞内 H2O2 分解 防止过多 H2O2 对细 胞的危害 人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业 造纸与印染业 农业与 环保业 以及医疗卫生业等多领域 小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为 238KD 结构上由 4 个具有相同多肽链的亚基组成 是以 铁卟啉为辅基的结合酶 在 407nm 波长下有特征性的吸收 溶于水 几乎不溶于乙醇 氯仿 乙醚等有机试剂 酸性环境下溶解度低易析出 最适温度为 37 最适 pH 值约为 7 8 本 实验以小鼠肝脏为原料 根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性 通过组织匀浆 盐析 透析 分子筛层析等步骤 提取纯化过氧化氢酶 并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度 分子量 米氏常数等测定 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 实验方案实验方案 实验目的实验目的 熟悉并掌握生化四大技术 离心 层析 比色 电泳 熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法 实验原理实验原理 匀浆原理 匀浆原理 分离纯化某一种蛋白质时 首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原 来的天然状态 不丧失活性 所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细 胞破碎 过氧化氢酶在乙醇 氯仿等有机溶剂中溶解度很小 而脂质在有机溶剂中溶解度 较大 通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离 过氧化氢酶在乙醇 氯仿等有机 溶剂中稳定性好 不易变性 而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差 容易变性 根据上述 制备过氧化氢酶 匀浆 盐析 透析 过氧化氢酶测定 米氏常数值测定 Lineweaver Burk双倒数作图法 蛋白含量测定 lowry法 纯度及分子量测定 SDS PAGE 层析 制备过氧化氢酶 匀浆 盐析 透析 过氧化氢酶测定 米氏常数值测定 Lineweaver Burk双倒数作图法 蛋白含量测定 lowry法 纯度及分子量测定 SDS PAGE 米氏常数值测定 Lineweaver Burk双倒数作图法 蛋白含量测定 lowry法 纯度及分子量测定 SDS PAGE 层析 原理选择 0 05mol L pH4 0 醋酸 乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液 通过匀浆法破碎肝 组织细胞 匀浆液离心后脂质分配到有机相中 部分杂蛋白则沉淀下来 而过氧化氢酶主 要存在于上清液中 分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液 盐析原理 盐析原理 蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低 通过向过氧化氢酶 粗提液中加入适当浓度的中性盐 使过氧化氢酶呈盐析状态 而部分杂蛋白呈盐溶状态 离心 后过氧化氢酶主要存在于沉淀中 弃去上清收集沉淀 即可实现过氧化氢酶与部分杂蛋白 的分离 透析原理 透析原理 采用 20 乙醇 0 1mol L pH4 7 醋酸缓冲液 0 1mol L NaCl 溶液为透析液 对 产物进行透析处理 在该透析条件下 过氧化氢酶溶解度变小 以沉淀形式析出 但不变 性 透析过夜后离心 过氧化氢酶主要存在于沉淀中 但沉淀中也可能含有少量变性的杂 蛋白 选择 0 1mol L pH7 8 磷酸缓冲液复溶沉淀 则过氧化氢酶溶解 而变性的杂蛋白不 能溶解 从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离 层析原理 层析原理 凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质 随流动相流经作为固 定相的凝胶层析柱时 各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技 术 采用 sephadexG 200 葡聚糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分 离 通过监测洗脱液在 407nm 过氧化氢酶特征性吸收波长 和 280nm 波长下的光吸收值 变化 合并收集 OD407nm 和 OD280nm 重叠峰值管 即可获得纯化后的过氧化氢酶 米氏常数测定原理 米氏常数测定原理 底物浓度与反应速率之间的关系可用 V 表示 图形为矩形 max SK SV m 双曲线如下 将此式取倒数可得 以和作图可得一直线 1 max SV SK V m V 1 1 S 由图可知该直线与横轴的截距为 找出一系列的点 将点还原为直线 即可求出 Km m K 1 点的取法 设置不同的底物浓度 加入酶的量相同 反应相同的时间 找出反应后过氧化 氢的量 分解的底物可以求得 用它来表示反应速率 剩余的过氧化氢用高锰酸钾滴定 2KMnO4 5H2O2 3H2SO4 2MnSO4 K2SO4 5O2 8H2O 蛋白质浓度测定原理 蛋白质浓度测定原理 蛋白质中的酪氨酸等与酚试剂之磷钼酸 磷钨酸作用产生蓝色化合 物 其颜色深浅与蛋白质含量成正比 Lowry 法测定蛋白质可分为两个步骤 1 在碱性溶液中 蛋白质与铜离子发生反应 Cu2 蛋白质 Cu 蛋白质 2 Cu 蛋白质使试剂中的磷钨酸 磷钼酸还原成为蓝色化合物 测定光吸收值就可以推算出 蛋白质的含量 试剂中的碳酸钠有缓冲作用 使溶液的 pH 始终保持在 10 左右 显色最深 福林 酚法的灵敏度高 蛋白质浓度测定范围是 25 250 g ml 但此法实际上是蛋白质中酪 氨酸和色氨酸等与试剂的反应 因此他受蛋白质氨基酸组成的影响 即不同蛋白质中氨基 酸组成的不同会使显色强度有所差别 此外 样品中酚类及柠檬酸的干扰会使结果偏高 低浓度的尿素 约 0 5 左右 胍 约 0 5 左右 硫酸钠 1 硝酸钠 1 三氯醋 酸 0 5 乙醇 5 丙酮 0 5 对显色无影响 上述物质浓度高时必须做校正曲线 SDS PAGE 测定分子量原理测定分子量原理 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠 SDS 则蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于分子量大小 Mr 而与本身所带的电荷量和形 状无关 具体公式 lgMW A B Rf 实验步骤 实验步骤 一 组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液 1 颈椎脱臼处死 6 只小鼠 取肝脏约 6g 2 加入预冷匀浆缓冲液 51ml 用组织捣碎机匀浆 3min 取 200 L 匀浆液留样放入冰 箱 20 保存 3 冰浴下缓慢加入 3ml 氯仿 再次匀浆 1min 匀浆液离心 4 7500rpm 30min 弃 沉淀 收获上清液 44ml 于锥形瓶中 4 取匀浆上清液 120 L 加入 40 L 4 电泳上样 Buffer 沸水浴 5min 备用于 SDS PAGE 检测 20 保存 另取 200 L 匀浆后上清液 20 保存 二 盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶 1 冰浴搅拌状态下向肝脏匀浆上清液缓慢滴加 7mlNa2SO4 继续用玻璃棒手动冰浴搅 拌 1h 2 将盐析溶液离心 4 7500rpm 10min 弃上清保留沉淀 3 用 24ml 磷酸缓冲液溶解沉淀 15min 离心 4 5000rpm 10min 弃沉淀保留上 清液 4 取盐析后上清液 120 L 用 40 L 4 电泳上样 Buffer 沸水浴 5min 备用于 SDS PAGE 检测 20 保存 5 将透析袋至于沸水浴 5min 清洗晾凉后备用 6 将上清液放入透析袋中 置于透析液中两周 中途更换一次透析液 7 两周后取透析袋中浑浊溶液离心 4 7500rpm 10min 弃上清保留沉淀 8 用 3ml 磷酸缓冲液溶解沉淀 15min 离心 4 4000rpm 10min 弃沉淀保留上清 液 9 取上清液 120 L 用 40 L 4 电泳上样 Buffer 制样沸水浴 5min 备用于 SDS PAGE 检测 于 20 保存 10 将透析袋至于沸水浴 5min 清洗晾凉后备用 11 将收获的上清液放入处理后的透析袋中置于 75 的甘油中包埋浓缩 2h 待样品浓 缩至 1 2ml 收样 置于 20 保存 三 凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶 1 凝胶的处理 预先处理好 2 装柱 取一支层析柱 于底部填塞薄棉 将层析柱垂直夹于铁架台 于柱中加入 缓冲液 5cm 使用前将凝胶混匀顺玻璃棒缓慢注入柱中 待其自然下沉 凝胶床 至少 2 3 柱高 3 平衡 磷酸缓冲盐溶液流洗 控制流速 5 10 滴 min 4 浓缩样品 5 加样 用吸管吸取待分离的浓缩液 1 2ml 在接近凝胶床表面处沿柱壁缓慢加入 6 洗脱 用磷酸盐缓冲液保持流速 7 收集及检测 样品下降至底部 5cm 开始用试管收集流出液 每管收集 2ml 收集管 依次在 407nm 和 280nm 波长下测吸光度值 绘制洗脱曲线 如图 如图 1 8 收获纯化产物 收集 OD407nm 和 OD280nm 重叠峰值管 9 取 2ml 纯化后存样于 20 保存 备于蛋白质浓度和 Km 值测定 10 取层析样品 60 L 用 20 L 4 电泳上样 Buffer 制样 沸水浴 5min 备用于 SDS PAGE 检测 于 20 保存 四 Lowry 法测定纯化的过氧化氢酶浓度 1 选择标准蛋白 选择与待测样品 层析后的纯化样品 相同或组成类似的蛋白质作 为标准蛋白溶液 2 标准蛋白溶液的配制 将标准蛋白经凯氏定氮法准确测定其蛋白质含量 再用无离 子水配制成 0 1mg ml 的储存液 3 实验结果表 1 所示配成不同浓度的标准蛋白组 编上号码 以第一管为空白管 在分光光度计上测定 650nm 处的光密度值 4 以各标准溶液浓度为横坐标 各管的光密度值为纵坐标作图 绘制标准曲线 如图 如图 2 5 测定样品蛋白 取试管两支 一支放 1ml 稀释的层析后纯化样品和 1ml 试剂 AB 混 合液 另一支放 1ml 生理盐水和 1ml 试剂 AB 混合液 两者均混匀后在 50 水浴 保温 10 分钟 冷却 再各加入试剂 C 3ml 立即混匀 置于 50 水浴中保温 20 分 钟 冷却后测定 650nm 波长处的光密度值 五 双倒作图法测定纯化的过氧化氢酶米氏常数 1 稀释匀浆后和层析后样品各 1000 倍 5 L 5ml 2 过氧化氢的浓度再标定 取清洁锥形瓶 2 支 各加 0 04mol L 的过氧化氢溶液 2 0ml 和 25 硫酸 2 0ml 分别用 0 002mol L 高锰酸钾滴定至微红 记录滴定毫升数去 平均值 计算过氧化氢的摩尔浓度 3 反应测速 取干燥的 50ml 锥形瓶 5 只 编号后操作 终止反应 血液加入后立即 计时 10 分钟 到时立即加入 25 硫酸 2 0ml 边加边摇 终止酶促反应 4 滴定 用标准 0 002mol L 高锰酸钾滴定 记录各瓶耗高锰酸钾的 ml 数 5 计算 1 反应瓶中过氧化氢浓度计算 S H2O2摩尔浓度 H2O2的 ml 数 3 0 2 反应速度计算 V H2O2的摩尔浓度 加入 H2O2毫升数 0 002 2 5 消耗 KMnO4的 ml 数 加入的 H2O2的毫摩尔数 剩余的 H2O2的毫摩尔数 3 求 Km 值 如图 如图 3 六 SDS PAGE 法测定纯化的过氧化氢酶分子量 1 凝胶的制备 预先处理好 2 蛋白质 样品的处理 将蛋白质溶解在蛋白质样品溶解液中 在 100 加热 2 5 分钟 蛋白质的最后浓度一般为 0 05 1mg ml 3 加样 4 电泳 5 剥胶和固定 垂直柱形电泳 6 染色和脱色 7 蛋白质的定量 如图 如图 4 实验结果 实验结果 小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化 酶活酶活溶液体溶液体 积积 mlml 蛋白浓蛋白浓 度度 mg mlmg ml IU mlIU ml 总酶活总酶活比活比活 IU m g 回收率回收率 KmKm 分子量分子量 匀浆产匀浆产 物物 4444 2 7 层析产层析产 物物 2 20 2051010202048 7848 78 0 0795 57 891 图 1 试验中的几个注意事项试验中的几个注意事项 1 使用离心机要注意平衡 平稳 对称 牢固 缓慢 以防止损伤离心机 2 手动玻璃匀浆器助溶时 要注意缓慢旋转推移 时间稍微长一些 使溶解的更充 分 3 使用分光光度计前 要记得调零 图 2 图 3 图 4 4 装柱时 避免出现断层 干胶 实验必须保证试管 量筒 吸管等的清洁 以避 免试剂之间的污染 影响实验结果 5 匀浆制备中快慢交替 防止温度过高对过氧化氢酶产生影响 6 洗脱速度不可过快 以防样品带扩散 结果误差分析结果误差分析 本次实验结果与理论数值基本符合 但稍有误差 可能因为 1 使用的仪器内有杂质 仪器老化 2 滴加的试剂与酶没有充分接触 3 酶因为操作时温度稍高部分会失活 4 拿出离心管时稍微晃动使沉淀与上清液混合 5 层析时收集的液滴大小不均造成吸光度测量误差 6 滴定时计时不准确 滴定终点人为判断不一致 7 滴定前过氧化氢分解或稍被硫酸污染 8 周围环境中的杂蛋白影响 可能因为实验时间过长造成酶活性降低 实验讨论实验讨论 1 盐析时 为什么要在冰浴搅拌的状态下 且要缓慢滴加 答 常温下 酶的活性有损伤 搅拌和缓慢滴加 是防止局部盐浓度过高 使杂蛋白 析出 2 为什么匀浆 透析中用醋酸缓冲液 而盐析 凝胶层析中用的都