HPLC同时测定妇炎康复片3种主要抗炎成分含量.doc

HPLC同时测定妇炎康复片3种主要抗炎成分含量作者：汪选斌1,湛晓明2,王明仲3单位：1郧阳医学院附属人民医院中药药理实验室，湖北 十堰 442000;2湖北中医学院，湖北 武汉 430000;3襄樊市中心医院，湖北 襄樊 441000)【摘要】 目的:建立HPLC同时测定妇炎康复片中芍药苷、橙皮苷及黄芩苷含量的方法。方法:采用HPLC条件为：色谱柱为Phenomenex C18柱(250 mm×4.60 mm，5μm);流动相：乙腈-磷酸二氢钾水溶液(0.05 mol/L，磷酸调pH至3.0)(梯度洗脱:0 min,1783;10 min,1783;15 min,2278;30 min,3070);流速：1.0 mL/min;柱温：40 ;检测波长：231 nm。结果:芍药苷的线性范围为0.05330.4800 μg (r=0.9997)，橙皮苷的线性范围为0.07980.7182 μg(r=0.9999)，黄芩苷的线性范围为0.36003.420 μg(r=0.9999);平均加样回收率，芍药苷为99.49%，RSD=1.70%(n=5)，橙皮苷为99.59%，RSD=0.41%(n=5), 黄芩苷为99.92%，RSD=1.26%(n=5)。结果测得3厂家妇炎康复片中每片含芍药苷为1.0656，1.4455，0.7042 mg;橙皮苷为0.5383，0.7676，0.4403 mg;黄芩苷为3.9544，7.0312，2.8877 mg。结论:该方法简便、快速、准确，可用于妇炎康复片的质量控制。 【关键词】 妇炎康复片;芍药苷;橙皮苷;黄芩苷;高效液相色谱法Simultaneous Determination of Three Main Antiinflammatory Constituents in Fuyankangfu Tablets by HPLC WANG Xuanbin1，ZHAN Xiaoming2，WANG Mingzhong3，XIAO Yuqing1，LI Hongliang1，WANG Shanshan1，LIU Ming1 (1Laboratory of Chinese Herbal Pharmacology,Renmin Hospital,Yunyang Medical College, Shiyan, Hubei 442000;2Traditional Chinese Medicine College of Hubei,Wuhan 430000;3The Central Hospital of Xiangfan,Xiangfan,Hubei 441000,China)Abstract:Objective To establish a HPLC method for determining the contents of paeoniflorin, hesperidin and baicalin in Fuyankangfu Tablets. Methods HPLC was performed on a PhenomenexC18 column(250 mm×4.60 mm，5 μm),and the mobile phase was composed of acetonitrile0.05mol/L KH2PO4 (adjusted to pH 3.00 with H3PO4)with gradient elution(0 min,1783;10 min,1783;15 min,2278;30 min,3070).The flowrate was 1.0 mL/min. The operating temperature was maintained at 40 and the detection wavelength was 231 nm. Results The linear ranges of paeoniflorin,hesperidin and baicalin were 0.05330.4800 μg(r=0.9997), 0.07980.7182 μg(r=0.9999) and 0.36003.4200 μg (r=0.9999),respectively.The average recovery rate of paeoniflorin was 99.49%(RSD=1.70%，n=5), hesperidin was 99.59%(RSD=0.41%，n=5)and baicalin was 99.92%(RSD=1.26%，n=5).The contents of paeoniflorin in Fuyankangfu Tablets from three companies were 1.0656,1.4455,0.7042 mg,hesperidin were 0.5383,0.7676,0.4403 mg,baicalin were 3.9544,7.0312,2.8877 mg,respectively.Conclusion The method is simple，quick，accurate，which can be used for the quantity control of Fuyankangfu Tablets.Key words: Fuyankangfu Tablets;Paeoniflorin;Hesperidin;Baicalin;HPLC黄芩、赤芍、陈皮为妇炎康复片中的三味主药1，药理研究证明，三者的主要成分黄芩苷、芍药苷、橙皮苷具有良好抗炎作用2-4。本实验拟建立同时测定妇炎康复片中黄芩苷、芍药苷及橙皮苷含量的HPLC法，为制订该复方质量控制的含量测定项提供参考。1 仪器与试药日本SHIMADZU LC20A液相系列(LC20AD泵、SPDM20A检测器、SIL20A自动进样器);GILSON TC100柱温箱;LC solution色谱工作站;FA2004电子分析天平(上海天平仪器厂);KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司);pHS25酸度计(上海雷磁仪器厂);黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110715200815)，芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0763200118)，橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110721200613);乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，磷酸二氢钾、磷酸为分析纯。妇炎康复片(市售药品,西安某公司、锦州某公司、重庆某公司，三厂家药品批号分别为：200812009、20090101、090403，规格：基片重0.35 g/片)。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：Phenomenex C18(250 mm×4.60 mm，5 μm);流动相：乙腈-磷酸二氢钾水溶液(0.05 mol/L，磷酸调节pH值为3.0)(梯度洗脱：0 min,1783;10 min,1783;15 min,2278;30 min,3070);流速：1.0 mL/min;柱温：40 ;进样量：10 μL;检测波长：231 nm;理论板数按芍药苷计算不低于8000，按橙皮苷计算不低于50 000，按黄芩苷计算不低于60 000。2.2 对照品溶液的制备精密称取适量黄芩苷对照品、橙皮苷对照品，配成每1 mL甲醇含芍药苷0.0267 mg、橙皮苷0.0399 mg、黄芩苷0.1800 mg的混合对照品溶液。2.3 供试品溶液的制备取本品10片，除去糖衣，研细，精密称取约0.35 g置50 mL容量瓶中，加甲醇约40 mL，超声处理30 min，放置至室温，加甲醇定容至刻度，摇匀，经微孔滤膜(孔径0.45 μm)滤过,取续滤液，即得。2.4 阴性样品溶液的制备取不含黄芩、赤芍及陈皮的妇炎康复片组方中其它药味的对照药材粉末按一定比例混合为模拟片剂，按上法制成阴性样品溶液。2.5 干扰试验取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL分别进样，按2.1项色谱条件测定，记录色谱图，阴性样品溶液不干扰测定，结果见图1。 图1 妇炎康复片的高效液相色谱图 A.对照品 B.样品 C.阴性样品2.6 线性关系考察精密吸取含芍药苷(0.0267 g/L)、橙皮苷(0.0399 g/L)及黄芩苷(0.1800 g/L)的对照品混合溶液2、6、10、14、18 μL，分别进样，对测得的峰面积(Y)和各对照品进样量(X)作回归处理，得芍药苷标准曲线，并计算得到芍药苷回归方程为：Y=163990X-78694 ，相关系数r=0.9997，表明芍药苷在0.05330.4800 μg范围内进样量与峰面积值呈良好的线性关系。得橙皮苷标准曲线，并计算得到橙皮苷回归方程为：Y=315638X-159348，相关系数r=0.9999，表明橙皮苷在0.07980.7182 μg范围内进样量与峰面积值呈良好的线性关系。得黄芩苷标准曲线，并计算得到黄芩苷回归方程为：Y=914161X-454055 ，相关系数r=0.9999，表明黄芩苷在0.36003.420 μg范围内进样量与峰面积值呈良好的线性关系。2.7 精密度试验精密吸取含芍药苷(0.0267 g/L)、橙皮苷(0.0399 g/L)及黄芩苷(0.1800 g/L)的对照品混合溶液10 μL，分别按上述含量测定色谱条件进样5次，测得芍药苷RSD=0.73%(n=5)，橙皮苷RSD=0.19%(n=5)，黄芩苷RSD=0.40%(n=5)，表明仪器精密度好。2.8 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定，记录黄芩苷及橙皮苷峰面积，计算5次测定芍药苷RSD=1.21%(n=5)，橙皮苷RSD=1.82%(n=5)，黄芩苷RSD=0.55%(n=5)，结果表明供试品溶液在24 h内检测稳定。2.9 重复性考察取同一批妇炎康复片(批号：200812009)6份，分别按2.1项下色谱条件测定黄芩苷及橙皮苷含量，芍药苷：RSD=1.31%(n=6)，橙皮苷：RSD=1.31%(n=6)，黄芩苷：RSD=0.96%(n=6)，表明该方法重现性好。2.10 回收率试验精密称取5份已知含量(含芍药苷0.4130%、橙皮苷0.2193%及黄芩苷2.0089%)的妇炎康复片基片粉末，分别准确加入一定量的芍药苷、橙皮苷及黄芩苷的对照品，按2.3项下制备方法和2.1项下色谱条件分别测定含量，计算回收率。芍药苷的平均回收率为99.49%，RSD=1.70%，橙皮苷的平均回收率为99.59%，RSD=0.41%，黄芩苷的平均回收率为99.92%，RSD=1.26%，结果见表1。表1 回收率实验结果(n=5)2.11 样品测定按2.3项下制备方法和2.1项下色谱条件对3批市售样品进行测定，记录峰面积，计算黄芩苷及橙皮苷含量，结果见表2。表1 三家药厂妇炎康复片中3种有效成分的含量3 讨论现代药理研究证明，妇炎康复片具有抗炎、抑菌、镇痛及活血化淤的药理作用2-4，该方由黄芩、败酱草、薏苡仁、赤芍、川楝子、柴胡、陈皮等七味中药组成，主药中黄芩、赤芍、陈皮所含主要成分黄芩苷、芍药苷、橙皮苷抗炎效果显著。建立三种主药中3种主要抗炎成分的含量测定方法，能更有效控制妇炎康复片的质量，本实验建立对3种成分同时进行含量测定的方法，对该复方的质量控制具有实际参考价值。通过230400 nm波段扫描检测结果，最大紫外吸收波长芍药苷为231 nm，橙皮苷为283 nm，黄芩苷为276 nm。三个波长中只有选取231 nm检测时，三者均有较好吸收值，杂质不干扰测定，故选取231 nm为检测波长。实验采用超声波提取，对超声20、30、40 min分别进行了对比，30 min已提取完全。参考药典及相关文献中芍药苷、橙皮苷、黄芩苷的含量测定方法5-7，分别以磷酸溶液、醋酸溶液、磷酸二氢钾溶液作缓冲液进行试验，结果表明，磷酸二氢钾溶液为缓冲液时，峰形高且对称性好;酸性较强时，三个被测峰拖尾均减小。因此采用磷酸二氢钾水溶液(0.05 mol/L，用磷酸调节pH值为3.0)作缓冲液，对比甲醇和乙腈为有机相，结果显示乙腈为有机相峰形较好。实验采用梯度洗脱，基线漂动不影响测定;测定30 min结束时另设置10 min平衡，可使连续进样时每次洗脱时间少于40 min，连续进样未见前次进样对后几次进样造成杂质干扰;且重现性好。本方法用HPLC法同时测定妇炎康复片中3种主要有效成分的含量，简便、快速、准确，可用于妇炎康复片的质量控制。【参考文献】 1国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准新药转正标准第四册S.北京：化学工业出版社，1994，4：17.2张喜平，田 华，程琪辉.黄芩苷的药理作用研究现状J.中国药理学通报，2003，19(11)：1 212-1 215.3张冬松，高慧媛，吴立军.橙皮苷的药理活性研究进展J.中国现代