HPLC法测定拟南芥中总黄酮含量的研究

HPLC 法测定拟南芥中总黄酮含量的研究法测定拟南芥中总黄酮含量的研究 张海军 1 2 郭丽1 王明泽1 车野1 李泽宇1 王殿奎1 1 黑龙江省农业科学院大庆分院 黑龙江 大庆 163316 2 吉林大学植物科学学院 吉林 长春 130062 摘要 建立分析检测拟南芥中总黄酮含量的高效液相色谱法 色谱条件 Phenomenex C18 色谱柱 150 mm 4 6 mm 5 0 m 流动相 甲醇 0 4 磷酸水 35 65 v v 流速 10 mL min 1 检测波长 256 nm 柱温 35 进样量 10 L 试验建立的色谱条件 标准 品芦丁在 0 05 1 60 mg mL 1范围内 R2 0 9997 峰面积与质量浓度呈现良好的线性关系 平均回收率为 99 90 RSD 小于 3 n 6 该方法适用于拟南芥中总黄酮的检测 关键词 拟南芥 总黄酮含量 芦丁 高效液相色谱法 Determination of Total Flavonoids Content in Arabidopsis Thaliana by High Performance Liquid Chromatographic ZHANG Hai jun GUO Li WANG Ming ze CHE Ye LI Ze yu WANG Dian kui 1Daqing Branches of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Daqing 163316 Heilongjiang China 2College of Plant Science Jilin University Changchun 130062 Jinlin China Abstract The objective of this study was to establish a method to determine total flavonoids content in Arabidopsis Thaliana The mobile phase consisted on methanol A 0 4 orthophosphoric acid in distrilled water B and each solvent was filtered through a 0 45 m pore size filter and degassed in an ultrasonic bath before use The analysis of rutin was performed at 35 C column oven temperature with a 10 mL min 1 flow rate and the injection volume was 10 L Solvent A B of rutin was 35 65 and the chromatogram was detected at 256 nm The peak area had a good linearity with a correlation coefficient of 0 9997 and the recoveries of standard spiling was 99 90 with RSD less than 3 This method was suitable for determination of total flavonoids in Arabidopsis Thaliana and other plants Key words Arabidopsis Thaliana Total flavonoids content Rutin High performance liquid chromatographic method HPLC 黄酮类化合物是植物中苯丙氨酸代谢途径产生的重要生理活性物质 具有预防和治疗 乳腺癌 结肠癌 皮肤癌 骨质疏松症 妇女更年期综合症的功效 可提高机体免疫功能 降低心血管疾病和冠心病的发生 1 3 高效的检测方法是黄酮类物质研发的基础 目前 关 于总黄酮的定量检测方法有紫外分光光度法和高效液相色谱法 HPLC 4 5 等 主要集中于 银杏叶 6 桑叶 7 苦荞麦 8 苦丁茶 9 落叶松 10 百蕊草 11 花椒 12 和罗汉果 13 等药用 植物 但对模式植物拟南芥的相关研究较少 目前 利用根瘤农杆菌把 DNA 转化进模式 植物拟南芥基因组已是常规操作 其组织培养和植株再生研究也已成熟 14 本试验以芦丁 为标准品 建立检测拟南芥中总黄酮含量的 HPLC 法 旨在为深入研究 转基因 拟南芥 基金项目 教育部新教师基金资助项目 3M2101936604 第一作者简介 张海军 男 1986 山东济宁人 研究实习员 硕士 主要从事植物分子育种工作 在国 内外刊物发表学术论文 11 篇 其中主笔 7 篇 申请专利 1 项 通讯地址 大庆高新技术开发区科技路黑 龙江省农业科学院大庆分院 邮编 163316 TelE mail zhanghaijun 234 通讯作者 王殿奎 男 1963 黑龙江哈尔滨人 研究员 曾先后从事亚麻 大麻 菊芋等经济 能源作 物的新品种选育 产业开发和技术推广工作 先后主持国家攻关及省地各级科研项目 5 个 参加亚麻 948 项目等科研项目 14 个 申请国家外专局对俄科技合作项目 7 项 获得国家及省市级农业科技进步奖项 8 项 主持认定大麻品种 1 个 在国家二 三级刊物发表学术论文 15 篇 其中主笔 8 篇 主笔编写 大麻 种质资源描述规范和数据标准 在农业出版社出版 大庆市农业生产指导丛书 编委 主笔 1 万余字 作为翻译多次率团出访俄罗斯 E mail 359351633 收稿日期 修回日期 中总黄酮及相关产品的研究提供一种技术参考 为后续的综合利用开发提供理论依据 1 材料与方法 1 1 供试仪器 高效液相色谱仪 LC 20A 色谱系统包括 DGU 20A3脱气机 2 个 LC 20AT 溶剂阵 列检测器 紫外检测器 SPD 20AV 紫外检测器 CTO 10AS 柱温箱 CBM 20A 系统控制器 LC Solution 工作站 7725 手动进样器 日本岛津公司 KQ3200DE 型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 HWS24 型电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司 FA2004A 型分析天平 1 2 供试试剂 甲醇 HPLC 级 美国 Fiser 公司 磷酸 HPLC 级 美国 Fiser 公司 甲醇 分 析纯 山东禹王试剂 乙醇 分析纯 北京化工厂 纯净水 总黄酮标准品 芦丁 Rutin 纯度 98 购自美国 sigma 公司 1 3 色谱条件 Phenomenex C18色谱柱 150 mm 4 6 mm 5 0 m 流动相 甲醇 0 4 磷酸水 35 65 v v 流速 10 mL min 1 检测波长 256 nm 柱温 35 进样量 10 L 分析时间 每份样品 30 min 所有样品平行测定 3 次 求其峰面积的平均值 根据保留时 间定性 根据峰面积定量 根据标准品的标准曲线计算样品中各异黄酮成分的含量 1 4 标准品的配置 精密称取标准品芦丁 2 5 mg 用甲醇 HPLC 级 定容至 25 mL 配成标准品母液 分别精密吸取母液 0 05 0 10 0 20 0 40 0 80 1 60 mL 定容到 10 mL 摇匀备用 1 5 样品的制备 迅速精确称取鲜重约 0 5 g 拟南芥叶片 加入 80 的甲醇 分析纯 提取液 按 400 L 100 mg 鲜重比例 于研钵研磨至匀浆 超声处理 60 min 滤渣甲醇洗涤 2 次 室温静 置 2 5 h 混匀后转入 2 5 mL 离心管 置于 80 水浴 14 h 12000 g 离心 15 min 将上清 液经 0 45 m 滤膜过滤 加甲醇定容至 50 mL 得预处理液 转入 HPLC 专用小瓶中封口 4 下保存待测 2 结果与分析 2 1 色谱条件的优化 2 1 1 检测波长的选择 将标准液和待测液进行连续波长扫描 结果发现 256 nm 和 360 nm 下具有最大吸收峰 且峰形良好 参考其他文献 7 9 选用 256 nm 波长检测 2 1 2 流动相的选择 分别以甲醇 0 4 磷酸水 85 25 75 25 65 35 55 45 45 55 35 65 25 75 15 85 作为流动相 试 验结果表明甲醇 0 4 磷酸水 35 65 条件下峰形尖锐 灵敏度及保留时间均较好 分离 效果也较为理想 故选择甲醇 0 4 磷酸水 35 65 为流动相 2 1 3 总黄酮标准品和样品 HPLC 色谱图 在 1 3 色谱条件下的标准品和拟南芥样品 HPLC 色谱图结果如图 1 所示 保留时间为 11 9 min 样品得到很好分离且峰形良好 0 02 55 07 510 012 515 017 520 0min 0 25 0 00 0 25 0 50 0 75 1 00 1 25 1 50 1 75 2 00 2 25 mAU x100 256nm 4nm 1 00 1 0 704 231932 0 832 7460 3 1 114 221014 1 362 11432 5 1 530 183786 1 691 132027 7 2 118 127423 8 6 841 105337 9 8 909 2652 10 10 400 1927 11 12 922 15613756 12 15 336 958899 13 17 461 1011 14 21 421 530837 0 02 55 07 510 012 515 017 520 022 525 0 min 0 5 0 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 mAU x10 256nm 4nm 1 00 1 677 472219 2 200 495971 2 741 107353 3 746 220585 4 259 123780 7 666 533098 11 184 104212 19 441 495633 图 1 总黄酮标准品 A 和样品 B HPLC 色谱图 Fig 1 HPLC chromatograms of standard rutin A and extraction sample B 2 1 4 线性关系的考察 HPLC 法测定不同浓度的标准品液 分别以浓度和峰面积为横纵坐标作回归方程 得 到标准品的标准曲线 y 2000000 x 56138 标准品芦丁在 0 05 1 60 mg mL 1范围内 R2 0 9997 峰面积与质量浓度呈现良好的线性关系 见图 2 芦芦丁丁标标准准曲曲线线 y 2000000 x 56138 R2 0 9997 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 00 30 60 91 21 51 8 浓浓度度 m mg g m mL L 1 1 峰峰面面积积 图 2 总黄酮标准品芦丁的标准曲线 Fig 2 Standard curve of standard rutin 2 2 测定方法的验证 2 2 1 精密度试验 取同一浓度标准品液连续进样 6 次 测定峰面积 标准品芦丁的 RSD 0 11 n 6 表明采用的高效液相色谱仪精密度良好 表 1 精密度试验测定结果 Table1 The res lt of the acc racy experiment 编号保留时间峰面积平均峰面积相对标准偏差 RSD NumberRetention timePeak areaAerage of concentrationRelative standard deviation 112 3093495294 212 3163370449 312 2993445063 412 3343341162 512 3343335207 612 3143160742 3357986 1670 11 2 2 2 重现性试验 取同一供试样品 平行处理 6 次 测定峰面积 标准品芦丁的 RSD 0 94 n 6 说明在该条件下数据重现性好 方法可靠 2 2 3 稳定性试验 样品测定后 密封 4 下保存 对某一浓度的样品每隔 4 h 进样一次 连续进 72 h BA 结果标准品芦丁的日内稳定性 RSD 0 86 n 6 日间稳定性 RSD 1 38 n 3 说 明样品在 24 h 和 72 h 内稳定 2 2 4 加样回收率试验 分别精确量取 1 2 3 4 5 6 mL 标准母品用某一已知浓度的样品定容至 10 mL 按 1 3 的色谱条件进行分析 每个样品平行进样 3 次 测定峰面积 计算平均值 根据外 标曲线计算加样回收率 加样回收率 测得浓度 本底浓度 加标量 100 由表 2 可 知 本法测定的标准品芦丁的平均加样回收率 99 90 n 6 其 RSD 2 67 n 6 表 2 加样回收率的测定结果 Table 2 Determination results of recovery 编号样品含量加入量测得量回收率平均回收率相对标准偏差 RSD Number Sample content g mL 1 Amount g mL 1 Measure g mL 1 Recoveries Average recovery Relative standard deviation 126 521036 050 9823 226 522046 270 9906 326 523056 821 0113 426 524065 490 9612 526 525076 821 0113 626 526087 511 0373 0 99902 6691 3 结论 本研究利用超声波提取拟南芥总黄酮 利用HPLC法进行测定 结合了两者的优点 即超声波法省时 节能 提取率高等优点 以及高效液相色谱仪器精密度高 结果准确等 特点 适于模式植物拟南芥中总黄酮含量的测定 试验确定的最优的HPLC色谱参数为 Phenomenex C18色谱柱 150 mm 4 6 mm 5 0 m 流动相 甲醇 0 4 磷酸水 35 65 v v 流速 10 mL min 1 检测波长 256 nm 柱温 35 进样量 10 L 精密度实验的 RSD为0 11 平均加标样回收率为99 90 RSD为2 67 此种方法准确可靠 测定灵 敏度高 操作便利 适用于各种拟南芥及其副产品中总黄酮含量的测定 具有推广价值 参考文献 1 Fabjan N Rode J Kosir IJ et al Tartary buckwheat Fagophrum Tataricum Gaertn J J Agric Food Chem 2003 51 22 6452 6455 2 Aedin C Bryn H Rosa M Isoflavones lignans and stilbenes origins metabolism and potential importance to human health J Journal of the Science of Food and Agriculture 2000 80 1044 1047 3 Xiong Q B Shi D W Mizuno M Flavonol glucosides in peric