第四章-色谱分离法

第四章色谱分离法 知识目标 掌握各种色谱分离技术的特点及适用范围 理解色谱分离方法的基本原理 了解色谱分离方法的分类 能力目标 能够熟练应用氧化铝色谱法 硅胶色谱法 聚酰胺色谱法 离子交换色谱法 薄层色谱法 纸色谱法对天然药物提取液进行分离 学会活性炭色谱法 凝胶色谱法 大孔吸附树脂法 电泳技术 干柱色谱法 气相色谱法和高效液相色谱法的操作技术 概述基本知识色谱技术本章小结 本章内容 如果天然药物的提取物中含有一些结构相似 性质相近的化学成分 用一般分离方法无法获得分离 那么 使用色谱分离法往往能获得较好的分离效果 色谱分离法具有试样用量少 分离效率高的特点 是目前被广泛应用的分离纯化和鉴定化合物的一种有效方法 具体应用时 可根据被分离化合物的性质和各种色谱分离法的特点 选择合适的色谱方法 概述 一 概念 二 色谱分离法的分类 三 色谱分离法的原理 四 色谱分离法的应用 基本知识 概念 色谱分离法 Chromatography 是一种分离 纯化和鉴定化合物的现代理化分离分析方法 色谱分离法的分类 色谱分离法的基本原理 利用混合物中各成分在固定相和移动相中吸附 分配及其亲和力的不同 当两相作相对运动时 这些成分在两相间进行反复多次的吸附或分配 从而得到分离 色谱分离法的基本原理 1 吸附色谱的原理 利用作为固定相的吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的大小不同 使各成分得到相互分离 常用的吸附剂有 硅胶 氧化铝 聚酰胺和活性炭 常见一些化合物官能团的极性大小顺序如下 色谱分离法的基本原理 2 分配色谱的原理 利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数的不同而获得分离 两相溶剂中的一相需作为固定相 常以某种惰性固体吸住该相溶剂 使之固定 这种吸着了固定相溶剂的固体物质称为支持剂 也称载体或担体 另一相溶剂则作为移动相 色谱分离法的基本原理 3 离子交换色谱的原理 利用离子交换树脂上的功能基能在水溶液中与溶液的其他离子进行可逆性交换的性质 以离子交换树脂作为固定相 使混合成分中离子型与非离子型物质 或具有不同解离度的离子化合物得到分离 色谱分离法的基本原理 4 凝胶色谱的原理 以凝胶作为固定相 选择适当的溶剂作为移动相 随着移动相的流动 由于受凝胶颗粒中网孔半径的限制 被分离试样中比网孔小的化合物可自由进入凝胶颗粒内部 而比网孔大的化合物不能进入凝胶颗粒内部被排阻 只能通过凝胶颗粒外部的间隙 使混合物中分子量大小不同的化合物移动速率不同而得到分离 色谱分离法的应用 天然药物化学成分种类繁多 各有其特定的性质 可选择不同的色谱方法进行分离 氧化铝色谱法 是利用作为固定相的氧化铝对混合物中各种成分吸附能力的大小不同 使各成分得到相互分离的方法 一 氧化铝色谱法 氧化铝是一种吸附力很强的亲水性吸附剂 有酸性 碱性 中性三种规格 其吸附活性与含水量有关 随着含水量的增加 吸附能力减弱 氧化铝的吸附能力大小 可根据含水量用不同的活度级别来表示 见表4 1 通过活化或去活化的操作得到不同活度级别的氧化铝 一般在400 左右加热6小时 即可得 级的氧化铝 表4 1氧化铝活度与含水量关系 氧化铝色谱法 操作步骤 1 色谱柱的选择 2 装柱 3 上样 4 洗脱 5 氧化铝的再生 氧化铝色谱法 氧化铝色谱法 提示 1 氧化铝适用于碱性或中性的亲脂性成分的分离 尤其是对生物碱的分离应用最多 具有分离效果好 再生容易 对杂质的吸附能力及分离试样的用量均优于硅胶等优点 但对醛 酮 酯 内酯等类型化合物的分离不宜采用 2 柱色谱中氧化铝用前应过筛处理 使粒度均匀 常以100目左右大小为宜 3 柱色谱中氧化铝的用量一般为样品量的20 50倍 如果氧化铝对样品的吸附力较弱 则适当增加用量至100 200倍 硅胶色谱法 二 硅胶色谱法 是利用作为固定相的硅胶对混合物中各种成分吸附能力的大小不同 使各成分得到相互分离的方法 硅胶是一种微呈酸性的多孔性物质 常用SiO2 xH2O表示 为硅氧烷交链结构 其骨架表面具有很多硅醇基 使硅胶能与许多化合物形成氢键而产生吸附作用 若含水量达17 以上 硅胶的吸附能力极弱 不能用作吸附剂 可作为支持剂用于分配色谱 若将含水硅胶在100 110 温度下加热30分钟 能使硅胶恢复吸附能力 表4 2硅胶活度与含水量关系 硅胶色谱法 操作步骤 基本氧化铝色谱法基本相同 硅胶色谱法 提示 1 硅胶的活化不宜在较高温度下进行 当温度升至500 时 硅胶失去吸附能力 2 有时硅胶色谱具有吸附色谱和分配色谱的双重性质 甚至还有极弱的离子交换作用 硅胶色谱法 提示 3 硅胶作为一种酸性 亲水性的吸附剂 适用于中性或酸性成分的分离 包括非极性化合物和极性较小的化合物 如挥发油 黄酮 蒽醌 强心苷 皂苷 有机酸及酚性化合物 氨基酸等 具有吸附容量高 机械强度好 分离范围广等优点 应用最为广泛 但对碱性成分的分离不宜采用 4 在分配色谱中 常用的支持剂有硅胶 硅藻土 纤维素粉和滤纸等 硅胶色谱法 提示 5 以极性大的溶剂 如水或亲水性溶剂 为固定相 极性小的溶剂为移动相的分配色谱称为正相分配色谱 常用于分离极性较大的成分 如生物碱 糖类 苷类 有机酸等 而以极性小的溶剂 如氯仿 石油醚等亲脂性有机溶剂 为固定相 移动相溶剂却极性较大的分配色谱则称为反相分配色谱 常用于分离极性小的成分 如油脂 高级脂肪酸 游离甾体等 6 选择适当的溶剂系统 可提高分离的效率 常用纸色谱摸索具体的分离条件 寻找合适的溶剂系统 活性炭色谱法 三 活性炭色谱法 是利用作为固定相的活性炭对混合物中各种成分吸附能力的大小不同 使各成分得到相互分离的方法 活性炭是一种非极性吸附剂 具有较强的吸附能力 其吸附能力受溶剂的影响 在水溶液中的吸附力最强 在有机溶剂中吸附力较弱 在一定条件下 对不同物质的吸附力也有差别 活性炭色谱法 对化合物的吸附力 极性基团多的化合物 极性基团少的化合物芳香族化合物 脂肪族化合物分子量大的化合物 分子量小的化合物 活性炭的分类 粉末状活性炭颗粒状活性炭锦纶活性炭 操作步骤 装柱上样洗脱 提示 活性炭色谱法 1 此法适用于分离水溶性成分如氨基酸 糖类及某些苷类等 具有试样上柱量大 分离效果好等特点 且活性炭价廉易得 适用于大量制备性分离 2 目前尚无测定活性炭吸附力级别的理想方法 其吸附力不易控制 故活性炭的具体应用受到一定的限制 聚酰胺色谱法 四 聚酰胺色谱法 聚酰胺色谱法是利用作为固定相的聚酰胺分子内存在的许多酰胺基 能与酚类的羟基 酸类的羧基及醌类的醌基形成氢键而产生吸附使混合物中各成分得到相互分离的方法 聚酰胺色谱法 聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类高分子化合物 色谱分离常用聚己内酰胺 绵纶6 和聚己二酰己二胺 绵纶66 其中聚己内酰胺可用结构式表示为 移动相 聚酰胺吸附色谱的原理 固定相 聚酰胺色谱法 聚酰胺色谱法 聚酰胺与各种化合物形成氢键的能力不同 决定了聚酰胺对其吸附力的强弱 形成氢键的能力首先与溶剂的种类有关 在聚酰胺柱色谱中常用作洗脱剂的各种溶剂洗脱能力顺序如下 水 甲醇或乙醇 丙酮 稀氢氧化钠液或稀氨溶液 甲酰胺或二甲基甲酰胺 尿素水溶液 聚酰胺色谱法 其次 与在含水溶剂中 化合物分子结构对氢键缔合的影响有关 大致如下 1 化合物分子中能形成氢键的基团数目越多 被聚酰胺吸附越强 如 聚酰胺色谱法 2 形成氢键的基团所处位置不同 被吸附的强度也不同 如 3 分子中芳香核 共轭双键越多 被吸附强度越大 如 聚酰胺色谱法 4 化合物若能形成分子内氢键 则被吸附强度减小 如 操作步骤 装柱上样洗脱聚酰胺粉的回收 提示 聚酰胺色谱法 1 如果选用三氯甲烷装柱 为避免聚酰胺浮起 上样时需放出柱底端的三氯甲烷层并立即上样 上样后顶端以棉花塞紧 提示 聚酰胺色谱法 2 聚酰胺色谱法常选用含水溶剂系统和非极性溶剂系统两类溶剂系统进行分离 含水溶剂系统适用于各种苷类 糖类 有机酸等水溶性成分的分离 非极性溶剂系统适用于萜类 甾体 黄酮体苷元 酚类 醌类等极性不太高的化合物的分离 3 此法常用于分离黄酮类 酚类 醌类等化合物 分离效果好 对鞣质的吸附因几不可逆 则常用于粗提物中鞣质的除去 此外 对生物碱 萜类 甾体 糖类 氨基酸等成分的分离也有广泛的应用 因聚酰胺吸附容量大 故特别适合于化合物的制备性分离 离子交换色谱法 五 离子交换色谱法 是利用离子交换树脂上的功能基能在水溶液中与溶液的其他离子进行可逆性交换的性质 以离子交换树脂作为固定相 使混合成分中离子型与非离子型化合物 或具有不同解离度的离子化合物得到分离的一种色谱方法 离子交换色谱法 离子交换树脂是一类含有解离性功能基团的特殊高分子化合物 可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两类 在水溶液中 前者能通过 SO3H COOH或酚羟基中解离的H 与溶液中的阳离子进行可逆性交换 后者能通过伯 仲 叔 季铵基中解离的OH 与溶液中的阴离子进行可逆性交换 而其本身却不溶于水 酸 碱和有机溶剂 阳离子交换树脂 RSO3 H Na Cl RSO3 Na H Cl 阴离子交换树脂 RN OH Na Cl RN Cl Na OH 具体选择离子交换树脂时 应综合考虑被分离物质所带电荷种类及其解离能力强弱 分子的大小与数量 若以R代表离子交换树脂的母体 则其色谱分离的基本原理可表示为 离子交换色谱法 离子交换色谱法 操作步骤 树脂的预处理装柱上样洗脱再生 提示 1 离子交换树脂的选择 综合考虑被分离物质所带电荷种类及其解离能力强弱 分子的大小与数量具体选择 2 树脂的交换容量及颗粒的大小 通常均选用交换容量大的树脂 3 此法常用于分离具有解离能力的酸性 碱性及两性化合物 如生物碱 氨基酸 有机酸 酚类 肽类等天然药物化学成分 大孔吸附树脂法 六 大孔吸附树脂法 是一种利用大孔吸附树脂具有的吸附性能及分子筛作用 使分子量的大小及吸附力的强弱不同的混合物中各成分获得分离的方法 大孔吸附树脂法 大孔吸附树脂是一种化学结构与离子交换树脂类似却不含交换基团 具有大孔结构的有机高聚物吸附剂 形态多为白色球形颗粒 粒度通常为20 60目 根据聚合材料的不同 可分为非极性 中极性和极性三大类型 大孔吸附树脂的理化性质稳定 不溶于酸 碱及有机溶剂 对有机物有较好的选择性 不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响 一方面 大孔吸附树脂通过范德华引力或形成氢键等分子间力吸附有机化合物 另一方面 其本身的多孔性网状结构决定了具有筛选性分离的特点 大孔吸附树脂法 操作步骤 树脂的预处理装柱上样洗脱树脂柱的清洗树脂的再生 提示 1 一般极性树脂用于吸附极性化合物 非极性树脂用于吸附非极性化合物 极性较大的成分适宜在中极性的树脂上进行分离 而极性小的成分则适宜在非极性树脂上进行分离 化合物分子体积较大者 宜选用较大孔径的树脂 大孔吸附树脂法 2 湿法装柱 树脂装填高度小于3米 3 通常可在上样溶液中加入适量无机盐 如氯化钠 硫酸钠 硫酸铵等 以增大树脂的吸附量 4 对于非极性的树脂 洗脱剂的极性越小 其洗脱能力越强 对于中极性和极性树脂 则宜选用极性较大的洗脱剂 5 改变洗脱剂的pH值 可使某些被树脂吸附的成分形成较强的离子化合物 易被洗脱 提高洗脱效率 6 大孔吸附树脂由于具有选择性好 能快速吸附且吸附容量大 机械强度高 再生容易等特点 树脂柱吸附分离示意图 大孔吸附树脂法 凝胶色谱法 七 凝胶色谱法 凝胶色谱法是以凝胶作为固定相 选择适当的溶剂进行洗脱 使混合物中分子量大小不同的化合物得到分离的方法 凝胶色谱法 凝胶是具有多孔性网状结构的高分子化合物 选择合适的凝胶 是凝胶色谱法分离的关键 商品凝胶的种类很多 常用的有 1 葡聚糖凝胶 又称为交联葡聚糖 是由葡聚糖和甘油通过醚桥 OCH2CHOHCH2O 相交链而成的多孔性网状结构物质 具有亲水性 但不溶于水 稀酸 碱和盐溶液 能在水中溶胀成胶粒 在pH3 10内稳定 适用于分离水溶性成分如蛋白质 肽 氨基酸 糖及苷类等 应用最为广泛 凝胶色谱法 交联葡聚糖的化学结构 2 葡聚糖凝胶LH 20 葡聚糖凝胶LH 20分子中引入了亲脂性基团 除了能在水中溶胀外 也能在许多有机溶剂如醇 甲酰胺 丙酮 三氯甲烷等溶剂中溶胀 在乙酸乙酯 甲苯中溶胀不多 并在pH 2的无氧化剂溶液中呈稳定状态 增大了应用范围 不仅可用于分离水溶性化合物 还可用于分离一些难溶于水或具一定程度亲脂性的化合物 如黄酮 蒽醌 香豆素等 凝胶色谱法 此外 还有聚丙烯酰胺凝胶 在pH2 10内稳定 使用情况与葡聚糖凝胶相似 琼脂糖凝胶 适合于分离分子量在百万以上的特大分子化合物 以及结合了不同离子交换基团的葡聚糖凝胶衍生物等 凝胶色谱法 凝胶色谱法分离机理示意图 代表凝胶颗粒 代表大分子物质 代表小分子物质 被分离试样中比网孔小的化合物可自由进入凝胶颗粒内部 而比网孔大的化合物不能进入凝胶颗粒内部被排阻 只能通过凝胶颗粒外部的间隙 随着移动相的流动 被分离试样中大分子化合物阻力较小 流速较快 先被洗脱 而小分子化合物阻力较大 流速较慢 则后被洗脱 从而使试样中大小分子化合物获得分离 操作步骤 装柱上样洗脱再生 提示 凝胶色谱法 1 上样前 装好的色谱床至少要用3倍于色谱床体积的洗脱液平衡 2 试样上柱前要滤过或离心 3 用凝胶色谱收集得到的水溶液组份 若为对热不稳定物质 需进行冷冻干燥 4 此法具有设备简单 易于操作和所得结果准确等特点 现已发展成为天然药物化学和生物化学研究中一种常规的分离方法 薄层色谱法 八 薄层色谱法 薄层色谱法 thinlayerchromatography TLC 是一种将适宜的固定相均匀涂布于平面载板上成一薄层 欲分离的试样于薄层板上点样 随着展开剂的移行 混合物中各成分根据吸附性能或分配系数的不同而获得分离的方法 薄层色谱法 常用于薄层色谱的固定相有氧化铝 硅胶 聚酰胺等吸附剂和硅藻土 纤维素等支持剂 因硅胶 氧化铝的吸附性能好 适用于多种化合物的分离 故又最为常用 薄层色谱所用的展开剂可根据被分离物质的溶解性 酸碱性 极性等性质及溶剂的极性 结合考虑所选吸附剂的吸附性能 选择单一溶剂或混合溶剂 操作步骤 薄层色谱法 薄层色谱装置示意图 薄层色谱法 当需要分离微量混合物或天然化合物的降解产物时 则选择制备性薄层色谱 制备薄层色谱法中收集色带操作 经制备性薄层色谱分离 可获得毫克量的纯品 近年来 随着薄层色谱技术的不断发展 出现了烧结薄层色谱法 高效薄层色谱法 有浓缩区的薄层色谱法 双波长薄层色谱扫描定量法等新技术 大大提高了分离的效能 薄层色谱法 CD60薄层色谱扫描仪 薄层色谱扫描仪 提示 薄层色谱法 1 根据被分离物质的性质 选择合适的吸附剂和展开剂是薄层色谱分离的关键 2 软板由于无黏合剂 只能用倾斜上行的展开方法 3 分离某些酸性或碱性成分 可在所选展开剂中加入少量的酸 如甲酸 醋酸 或碱 如氨水 二乙胺 或将一小杯挥发性酸或碱放置色谱缸内 以提高分离效率 4 在薄层色谱分离中能使各组分Rf值达到0 2 0 3的溶剂系统 可选为柱色谱的洗脱条件 纸色谱法 九 纸色谱法 是一种以滤纸为支持剂 滤纸上吸着的水 或根据实际分离的需要 经适当处理后滤纸上吸附的溶液 为固定相 用一定的溶剂系统为移动相进行展开 而使试样中各组分达到分离的方法 纸色谱法 操作步骤 点样 展开 显色 测定比移值 提示 纸色谱法 1 通常定性用较薄的滤纸 较厚的滤纸供制备用 2 所用滤纸应质地均匀平整 具有一定机械强度 必须不含影响色谱效果的杂质 也不应与所用显色剂起作用 以免影响分离和鉴别效果 必要时可作特殊处理后再用 3 点样不宜太集中 若与标准品对照 点样量最好大致相当 4 展开可选择上行 下行 径向 单向二次展开 双向或多次展开等 电泳技术 十 电泳技术 电泳技术是一种利用混合物中各成分所带电荷性质 电荷数量及分子质量的不同 一定的时间内 各成分在同一电场中泳动的方向和速度不同 使各自移动距离不同而获得分离的技术 广泛应用于生物碱 有机酸 氨基酸 蛋白质 糖类等天然药物化学成分的分离和鉴定 电泳技术 常用的电泳技术有纸电泳 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 操作步骤 电泳技术 电泳系统的组成包括电源 电泳仪 电泳槽 恒温装置和观察 成像装置等 操作步骤 制板 电泳技术 操作步骤 电泳技术 干柱色谱法 十一 干柱色谱法 干柱色谱法是指将干燥的填充剂直接装入色谱柱后进行色谱分离的方法 此法具有分离效果好 设备简单 溶剂消耗量少 可以直接套用薄层色谱的最佳分离条件等优点 但填充剂的消耗量较大 适用于制备性分离 气相色谱法 十二 气相色谱法 气相色谱法 gaschromatography GC 是一种以气体作为流动相 利用混合物中各组分在气体与固定相之间吸附能力的不同或分配系数的差异而获得分离的色谱分离方法 根据固定相的不同 可分为气 固吸附色谱及气 液分配色谱两类 其中 以气 液分配色谱的应用最为普遍 气相色谱法 气路系统 进样 分离 温控系统 检测 记录系统 操作步骤 气相色谱仪结构 气相色谱法 气相色谱法具有分离效率高 分析速度快 试样用量少 选择性好 应用范围广等优点 目前已广泛应用于石油化工 食品卫生及药物分析等领域 但气相色谱法也存在一些不足之处 如不适宜分离高沸点 热稳定性差 高极性的化合物 柱的载样量较小 无法进行大规模制备性分离等 在一定程度