微生物检验操作规程.doc

作 业 文 件编号：CX/LT80303-2004第一版第0次修改微生物检验操作规程第6页共6页1 目的对微生物检验过程进行控制，以确保微生物检验结果准确反映样品。2 范围适用于本公司啤酒生产过程中对微生物检验活动的全过程。3 职责技术质量处化验室化验员负责微生物检验的全过程，技术质量处归口管理。4 操作规程4.1微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤4.1.1一般的玻璃器皿（例如培养皿、试管、三角瓶等），可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢，然后用自来水、蒸馏水充分冲洗，直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜，即器壁既不挂水珠也无条纹，即洗涤达到标准。4.1.2 新购置的玻璃器皿用20%（m/m）的盐酸溶液浸泡数小时，再用自来水、蒸馏水充分洗涤，备用。4.1.3 用过的玻璃器皿或含有营养琼脂培养基的器皿，可先用小刀或铁丝将器皿中的琼脂培养基刮去然后用水煮沸30分钟，再用自来水、蒸馏水冲洗干净，备用。4.1.4 玻璃器皿内有污迹不能洗净时，可浸泡于铬酸洗液中，待器皿中有机物氧化分解后，取出用自来水、蒸馏水冲洗干净，备用。4.1.5 用过的吸管用回形针钩出吸管上端棉花后，放水冲洗即可。4.2玻璃器皿、吸管的干燥4.2.1 洗涤好的三角瓶、平皿倒放于洗涤架或桌子上自然晾干。4.2.2 洗涤好的吸管顶端向下，下面垫一块干净的厚布或四层沙布，使吸管水份能迅速吸去后自然晾干。4.3玻璃器皿、吸管的包扎4.3.1三角瓶包扎前瓶口和试管口需先配套的塞好棉花塞或气塞，然后外面包一层牛皮纸，用线、绳扎好呈活结，灭菌后使用。4.3.2将干燥的培养皿用牛皮纸包扎好或盒装好，灭菌后使用。4.3.3将干燥后的吸管用一条宽约45cm的牛皮纸条，以45左右的角度螺旋形卷起来，吸管的坐端在头部，吸管的另一端用剩余纸条折叠打结，不使散平，标上容量后10支左右包扎成捆灭菌，使用时在无菌室从吸管中间拧断纸条抽取吸管。4.4玻璃器皿、吸管的灭菌4.4.1把包扎好需灭菌的物品放入高压灭菌锅内。4.4.2接通电源加热，待蒸汽排放35分钟后，放下排气阀开压。4.4.3高压灭菌锅压力到0.1MPa时，开始计时灭菌30分钟。4.4.4关闭电源，自然冷却至压力降至0时，打开排气阀，将灭菌物品拿出放至105左右的烘箱内烘干备用。4.5无菌操作的准备工作及注意事项4.5.1无菌室应经常打扫、拖地板，用0.25%新洁尔灭，擦洗桌面及墙壁，用甲醛熏蒸无菌室。4.5.2无菌室使用前，应先打开紫外灯灭菌20-30min。4.5.3无菌室应备有专用开瓶器、镊子、接种针，每次使用前后应在酒精灯火焰上消毒。4.5.4无菌室应备有75%酒精棉球；新洁尔灭消毒液和来苏消毒液（甲酚皂溶液与水150混匀），内浸纱布数块，备用。4.5.5进入无菌室穿好白大褂，换专用鞋，离室时脱去工作服和专用鞋，工作服和专用鞋只准在无菌室内使用，不准穿到其它地方去，并定期洗换和消毒灭菌。4.5.6样品检验前应在原始记录本上记录生产时间、批号、罐号等内容，并在所用平皿或试管上详细记录样品序号、检验日期、班次等内容。4.5.7无菌操作前，用75%的酒精棉球擦手。4.5.8检验操作过程不离开酒精灯无菌区，取下的塞子不得乱放。4.5.9吸取带菌液时，必须用加有橡皮吸头的吸管，切勿直接用嘴吸取，使用前吸管下端必须过火焰灭菌。4.5.10操作要正确迅速，所用的器皿均应是经过严格灭菌的器皿。4.5.11检验完毕，立即清理工作台，弃去不需要物品，打扫无菌室卫生。4.6微生物检验用药品配制4.6.1配制方法参见过程、最终检验操作规程药品配制。4.6.2所配制的培养基三角瓶上应注明配制日期、配制人等内容。4.7取样方法4.7.1大罐、清酒罐取样阀取样方法（1）先从取样口放掉一些液体，关掉取样阀，然后于阀口内外用酒精（75%）擦/冲洗，然后关掉取样口。（2）重新放一些液体，关掉取样阀后，点燃酒精灯，将取样口内外烧30秒左右，开启取样瓶盖在火焰下从取样口取样。（3）取样瓶在瓶口和瓶盖经火焰灭菌后上盖封紧，关闭取样阀4.7.2大罐、清酒罐、过滤机、灌装机残水、自来水取样阀取样方法（1）先从取样阀处放掉一点液体，阀内外用酒精棉球擦净。（2）用火焰对取样阀进行灭菌。（3）重新放掉一点液体冷却取样阀，启开取样瓶盖在火焰下取样。（4）取样瓶在瓶口和瓶盖经火焰灭菌后上盖封紧，关闭取样阀。4.7.3空气、氮气等气体的取样方法将气体阀打开，排空1分钟，逐渐将阀门关小。以酒精棉球灼烧气体排放口，排气12分钟，再擦洗，再排放，如此重复34次。在火焰旁打开已盛营养琼脂平皿的盖子，使气体直对着培养皿吹23分钟，取样品至培养皿间距离保持25左右，盖上平皿，将其用牛皮纸包住后拿回化验室培养。4.7.4取样时注意问题：（1）所有的取样阀都有其优缺点，理想的取样阀是没有的，这就要求车间在每次清洗大罐、清酒罐、过滤机、灌装机等设备时，走热水或通蒸汽时用手打开取样阀，让汽或液流通过，从而将取样阀这段死区彻底清洗干净。（2）检验员到各车间取各设备的洗涤残水时，洗涤残水温度应不大于30。4.8检验方法4.8.1细菌总数的测定方法（1） 做样前，将杀菌好的吸管、培养皿等放入操作台上，操作台、无菌室紫外线灭菌30分钟，然后关紫外线灭菌灯，间隔30分钟后开始做样。（2） 成品样品准备，先将瓶颈部分及起瓶器在酒精灯上火焰灭菌，启开瓶盖，将瓶口在火焰上灭菌，用搪瓷杯在火焰上方倒出酒液保留100ml样液，用75%酒精纱布盖住瓶口，摇荡酒瓶除气充分，放置（不得放置于操作台内）。（3） 样品转移：先松开绳子，在火焰旁摘去牛皮纸及瓶塞，放置操作台顶（成品样品除外），将瓶口在火焰上灭菌。在火焰旁打开吸管过火焰灭菌，瓶口斜朝外与口及鼻呈一定角度（不能对直吸样呈一条线），吸取样品，然后将取样瓶或啤酒瓶放置操作台顶，在火焰旁打开平皿，将吸入的样液移至平皿内，将吸管置于操作台顶。（4） 倒平皿：待琼脂完全融化以后冷却至45保温；在火焰旁摘去牛皮纸置于操作台外，将塞子及琼脂瓶口火焰灭菌，然后用右手的小指及无名指夹住塞子，同时用右手拿住琼脂瓶，瓶口斜朝外（不能摇荡瓶子，以免产生气泡）。在火焰旁打开平皿倒入琼脂浸满平皿底部，左手用75%酒精棉球擦净瓶口琼脂，然后将瓶口及塞子分别火焰灭菌，塞紧塞子盖上牛皮纸扎紧绳子。（5） 转动倒好琼脂的平皿，使培养基与样品均匀。待琼脂凝固后，将平皿倒置于361培养箱内，培养242小时后取出读数，结果表示方法：n个/ml。（6） 空气、氮气等气体取样回化验室后打开牛皮纸拿出平皿倒置于361培养箱内培养242小时后取出读数，结果表示方法：n个/分钟.压力。4.8.2大肠菌群的测定方法4.8.2.1 检验程序 检样 稀释乳糖胆盐发酵管361、242h产气不产气伊红美蓝琼脂平板361、1824h大肠菌群阴性报告乳糖发酵管361、242h革兰氏染色革兰氏阴性无芽孢杆菌革兰氏阳性产气不产气大肠菌群阳性大肠菌群阴性报告报告大肠菌群阴性报告4.8.2.2 操作步骤4.8.2.2.1 检样稀释 以无菌操作将检样25ml放于含有225ml灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内,经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。 用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管均匀，作成1：100的稀释液。 用1ml灭菌吸管，按上项操作依次10倍递稀释液，每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌吸管。 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管。4.8.2.2.2 将待检样品接种于乳房糖胆盐发酵管内,接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每稀释度接种3管，置361恒温内培养242h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气管，则按下列程序进行。4.8.2.2.3 分离培养将产气的发酵管分别转种在伊美蓝琼脂平板上,置361恒温箱内培养1824h,然后取出观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实实验。4.8.2.2.4 证实实验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361恒温箱培养242h，观察产气情况，凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为菌群