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医学论文-成骨细胞对人工关节金属磨损微粒的体外生物学反应 作者：蔡贤华，陈安民，陈庄洪【关键词】 成骨细胞磨损微粒引起的假体周围骨溶解、无菌性松动是严重影响人工关节置换术中、远期临床疗效的重要因素14。大量研究证实，关节置换术后产生的磨损微粒数量惊人，每年在体内产生约51013亚微粒释放入关节腔1、5。金属微粒是重要磨损微粒之一3、6，与其他无法降解消化的微粒（如聚乙烯或骨水泥等）一样，当其持续刺激假体周围细胞（包括成骨细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和破骨细胞等）时，正常吞噬反应将引起病理改变1、4。 鉴于成骨细胞在假体周围骨代谢中具有重要地位3、7，阐明金属微粒对成骨细胞的影响极其重要。为此，本文将就近年来成骨细胞对金属微粒（包括其离子状态）的体外生物学反应研究进展作一综述。 1 金属磨损微粒与成骨细胞 金属微粒主要有钴铬合金、钛合金、钛、不锈钢及其它金属等8、9，从假体周围界膜中分离出的微粒一般粒径小于3 m，平均1 m10。金属微粒通过有效关节间隙进入假体周围，分布于骨髓腔中，直接与成骨细胞接触，为吞噬反应的发生提供了可能性8。成骨细胞吞噬微粒并产生有害生物学反应，引起细胞功能改变，导致骨溶解吸收8、11、12。目前体外实验主要研究了这些微粒对成骨细胞活性、增殖及其功能改变的影响。 11 金属微粒与成骨细胞骨形成及其表型 成骨细胞最重要的功能之一是产生有机骨基质，而有机骨基质的90为型胶原（由1和2链连接而成），因此，型胶原表达的变化是微粒影响成骨细胞骨形成的重要指标3、13。钛合金、磷酸铬及钛微粒能抑制人成骨样细胞（包括MG63、SaOS2、HOS细胞）及成人骨髓源性原代成骨细胞前胶原（procollagen）1及1基因表达并降低型胶原合成，其抑制前胶原1基因表达的作用强于聚乙烯3、13、14，但对成骨细胞其他特异性基因如骨钙素（osteocalcin，OCN）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）及骨桥素（osteopontin，OPN）等的表达无明显影响3、9、14。高浓度的铝微粒（648 m）能引起ALP活性增加，而其他粒径微粒如钛（1699 m）、锆（507 m）、铌（1418 m）、钽（832 m）、铬（2327 m）对此无作用15。钴微粒抑制成骨细胞型胶原、ALP及OCN的产生，而钴铬合金无此作用，但高浓度（10 mgml）钴铬合金及铬能阻止OCN的表达，铬微粒还能抑制ALP表达11。这意味着金属微粒能引起假体周围以型胶原合成减少为代表的骨基质形成障碍，部分微粒或在高浓度时将影响成骨细胞其他表型。 12 金属微粒与成骨细胞源性因子释放 在金属微粒的刺激下，原代成骨细胞或成骨细胞系细胞对IL63、IL816、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）17、转化生长因子1（transforming growth factor1，TGF1）3及单核细胞化学趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein1，MCP1）16等因子释放增加。其中，PGE2的释放呈微粒成分依赖性，即钴铬合金工业纯钛钛合金18。现已证明，IL6和PGE2能激活假体周围破骨细胞或促进其分化，导致骨溶解吸收3、14；IL8是中性粒细胞的幕集因子，MCP1能吸引单核细胞巨噬细胞，这些浸润细胞可放大假体周围细胞对微粒的反应，交替启动无菌性炎症，导致假体周围界膜形成，增加骨溶解16；而TGF可促进成骨细胞增殖及型胶原合成，其释放可能是成骨细胞的一种代偿性保护反应3。这表明在金属微粒的作用下，成骨细胞源性因子的作用以引起假体周围无菌性炎症、促进骨溶解为主，但仍有逆转这些反应的因素存在。 13 金属微粒与成骨细胞活力、增殖 小于3 m钛、钛合金及正磷酸铬微粒对MG63细胞活力无明显影响，即使当暴露时间长达7296 h或浓度在0012502（vv）时，细胞活力仍保持在95以上3；与之相反，上述微粒抑制成骨细胞增殖，且呈时间与浓度依赖性，其抑制作用较聚乙烯强；但细胞在低浓度（如00125005）中暴露达48 h时，这种抑制作用消失3，其他研究也有类似结果19。较大粒径的铝（648 m）、钛（1699 m）和锆（507 m）微粒降低细胞活性的浓度低于铌（1418 m）、钽（832 m）、铬（2327 m）15。钛微粒通过触发凋亡来降低成骨细胞活性20，在抑制新生鼠成骨细胞的活性和增殖方面，以154 m粒径作用最强21。这表明，成骨细胞活性、增殖与金属微粒浓度、粒径及成分密切相关，而成骨细胞数量的减少也是其引起型胶原合成减少的原因之一。 14 成骨细胞吞噬金属微粒与其功能改变的关系 虽然一般认为成骨细胞为非吞噬细胞，但体外研究证实这种细胞具吞噬功能，而且能大量吞噬钛、钴、铬、钛合金及钴铬合金等微粒3、11、18。MG63细胞及原代人成骨细胞或新生鼠成骨细胞吞噬微粒后，微粒位于胞浆内、胞核周围，胞膜呈不规则皱褶，内质网退化，线粒体肿胀，胞核呈锯齿状，伴囊泡状包涵体形成，此时，微粒与细胞骨架蛋白质结合成复合物，引起纤维增厚并几乎使细胞失去胞质流动性及粘附力18、21，这可能是微粒对细胞直接毒性作用的结果11。当可吞噬微粒暴露于MG63细胞24 h时，成骨细胞即变得饱满，单个细胞吞噬微粒高达4060粒，而松胞菌素（cytochalasin）D能阻止其吞噬作用，这种现象也出现在成人骨髓源性原代成骨细胞3。成骨细胞吞噬金属微粒后，可表达具巨噬细胞特异性标志蛋白CD68蛋白22。 如此之多的金属微粒被成骨细胞吞噬，是否引起成骨细胞活性及功能改变?Pioletti等20发现，成骨细胞吞噬钛微粒可引起细胞凋亡，这源于吞噬微粒引起的细胞直接毒性反应及在吞噬过程中或吞噬后，成骨细胞释放的炎性因子对其他成骨细胞的毒性反应（属间接作用）。Vermes等3证实，成骨细胞吞噬钛微粒引起的型胶原合成抑制效应可长达细胞暴露微粒后13 d，而具有阻断细胞吞噬作用的松胞菌素D，虽然能显著地降低这种抑制效应，但并不能完全消除此作用；细胞无法吞噬的钛质大颗粒（粒径大于20 m）也具抑制效应，但逊于粒径小于3 m的小微粒。其它研究结果与之相似21、23。这表明，成骨细胞吞噬微粒是抑制其增殖、活性及有机骨基质合成方面的主要原因，但独立于这种吞噬效应的介导机理仍起部分作用，后者源于微粒与成骨细胞间相互作用，在无吞噬效应存在时或在吞噬发生之前发挥抑制骨基质合成的作用。 15 金属微粒引起成骨细胞功能变化的信号转导机理 鉴于微粒与成骨细胞相互作用在吞噬发生之前即启动细胞的生物学反应，产生抑制效应，Vermes等24对暴露于钛微粒的MG63细胞进行了观察，结果发现，成骨细胞对可吞噬钛微粒的最初反应是通过蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）途径的蛋白酪氨酸磷酸化作用，使核因子B（nuclearfactor B，NFB）激活，引起成骨细胞释放细胞因子、化学趋化因子等，通过自分泌或旁分泌的方式来影响细胞的功能3、12、24；大微粒通过细胞与微粒间相互作用也能激活NFB24，而成骨细胞吞噬微粒后被持续激活并释放转导信号，通过激活PTKNFB径路，导致成骨细胞基因表达的改变3、24；NFB与前胶原1基因启动子结合，导致前胶原1基因转录的下调，而采用PTK和NFB径路阻滞剂能明显降低钛微粒对前胶原1基因表达的抑制作用，这意味着金属微粒对成骨细胞PTK信号的刺激作用与NFB激活及胶原基因表达密切相关，在酪氨酸磷酸化、NB激活及胶原基因表达之间存在着直接功能联系24。 2 金属磨损微粒离子状态与成骨细胞 尽管研究表明，假体源性金属微粒能改变体外成骨细胞功能，但尚不十分清楚这些微粒的离子状态是否与假体周围骨溶解的病理过程相关。文献显示，体内金属微粒的存在状态各不相同，从纳米至微米粒径的微粒到无机金属盐、氧化物、自由金属离子或与蛋白结合呈胶状复合物等多种形式，金属离子可直接由假体表面产生或源于磨损微粒2527。不同的金属假体，即使其功能状态良好，在体内均将产生不同浓度的金属离子如钛、铬、钴、镍等，而且其在体液中浓度明显超标2527。假体周围的这种离子环境，极可能影响其周围成骨细胞功能2628，相关体外研究虽然不多，但其结果均支持这种推测。 21 金属离子与成骨细胞增殖及活力 Hallab等26采用8种不同浓度（0001100 mmol/L）的假体材料金属离子氯化物溶液干预MG63细胞，结果发现，金属离子不同程度地影响成骨细胞活力与增殖，以活力降低50为标准，金属离子毒性从小到大依次为：钠铬镁钼铝钽钴镍铁铜锰钒；金属离子抑制成骨细胞增殖作用与毒性排名相似。Anissian等发现27，当钴+2高于10 mgL或017 molL时，其抑制人成骨样细胞增殖呈浓度依赖性。这说明金属离子对成骨细胞增殖及活性的影响与其毒性及浓度密切相关。 22 金属离子与成骨细胞表型及基质合成 Sun等28发现，铝+3在中毒与非中毒浓度均明显抑制ROS 1728细胞ALP、OCN及OPN基因的表达；钴+2在中毒浓度时抑制ALP的表达；而铬+3和镍+2只有达细胞中毒浓度时，才能抑制OCN、OPN及ALP基因表达；钛+4和钒+3对此无抑制作用。当培养液中加入1,25（OH）2D3时，钴+2呈浓度依赖性降低OCN的产生，但浓度低于10 mgL或017 molL时，无此作用27。这意味着，大部分金属离子在非中毒或较低浓度时不影响成骨细胞表型，只有当中毒及较高浓度时，才出现相关的改变，而且离子不同，其作用也不相同。而非中毒或低浓度金属离子对成骨细胞前胶原1基因或型胶原表达无影响，但当其达到中毒或较高浓度时，呈抑制效应26、27。 23 金属离子与成骨细胞相关因子的释放 毒性较大的金属（如钒、锰、铁及镍）离子刺激48 h后，能引起IL6释放，但对IL1、TGF1及TNF表达无明显影响；而毒性小的金属（如钴、铬）则无此作用，即使高浓度也如此26。但最近发现，富含钴+2的培养液能引起成骨细胞IL6分泌增加，不过当浓度低于10 mgmL或017 molL时，无此作用，且在培养液中未检测到TNF227。这表明，离子毒性及其浓度与某些成骨细胞源性因子的释放相关。 3 展 望 金属微粒（包括其离子状态）对成骨细胞的生物学作用表现在：通过炎性介质（如IL6、IL8、PGE2）等的释放，引起无菌性炎症级联反应，导致骨溶解；同时使其骨形成能力明显下降。两者将导致假体周围骨形成与骨吸收之间的动态平衡被打破，最终导致假体松动。但不同的磨损微粒及炎性介质在体内构成了一个复杂的网络，可单独或联合作用于假体周围细胞，炎性介质最后究竟是通过何途径导致破骨细胞功能增强并引起骨溶解，到目前为止，这种机理尚未完全阐明2、5。阐明其机理是假体周围骨溶解的防治及无菌性松动的预防研究取得根本突破的的重要途径。 值得注意的是，在促炎性介质释放的同时，成骨细胞表达的TGF1具有改善成骨细胞功能等作用，可部分逆转金属磨损微粒引起的骨溶解反应3。这意味着在假体周围骨溶解作用存在的同时，骨形成、骨保护作用仍能得到一定程度的表达，因此，利用这些积极因素开展假体松动的预防研究，将是一项很有意义的工作。 参考文献： 1 Wooley PH,Schwarz EM.Aseptic looseningJ.Gene Ther,2004,11（4）:402407. 2 Goodman SB,Trindade M,Ma T,et al.Pharmacologic modulation of periprosthetic osteolysisJ.Clin Orthop,2005,（430）:3945. 3 Vermes C,Chandrasekaran R,Jacobs JJ,et al.The effects of particulate wear debris,cytokines,and growth factors on the functions of MG63 osteoblastsJ.J Bone Joint Surg（Am）,2001,83（2）:201211. 4 Wang ML,Tull R,Manner PA,et al.Direct and indirect induction of apoptosis in human mesenchymal stem cells in response to titanium particlesJ.J Orthop Res,2003,21（4）:697707. 5 Wang ML,Sharkey PF,Tuan RS.Particle bioreactivity and wearmediated osteolysisJ.J Arthroplasty,2004,19（8）:10281038. 6 Campbell PA,Wang M,Amstutz HC,et al.Positive cytokine production in failed metalonmetal total hip replacementsJ.Acta Orthop Scand,2002,73（5）:506512. 7 Crotti TN,Smith MD,Findlay DM,et al.Factors regulating osteoclast formation in human tissues adjacent to periimplant bone loss:expression of receptor activator NF B,RANK ligand and osteoprotegerinJ.Biomaterials,2004,25（4）:565573. 8 Lohmann CH,Dean DD,Koster G,et al.Ceramic and PMMA particles differentially affect osteoblast phenotypeJ.Biomaterials,2002,23（8）:18551863. 9 Giant TT,Jacobs JJ,Mikecz K,et al.Particulateinduced,prostaglandinand cytokinemediated bone resorption in an experimental system and in failed joint replacementsJ.Am J Ther,1996,3（1）:2741. 10 Maloney WJ,Smith RL,Schmalzried TP,et al.Isolation and characterization of wear particles generated in patients who have had failure of a hip arthroplasty without cementJ.J Bone Joint Surg（Am）,1995,77（9）:13011310. 11 Allen M J,Myer BJ,Millett PJ,et al.The effects of particulate cobalt,chromium,and cobaltchromium alloy on human osteoblastlike cells in vitroJ.J Bone Joint Surg（Br）,1997,79（3）:475482. 12 Roebuck KA,Vermes C,Carpenter LR,et al.Downregulation of procollagen alphal messenger RNA by titanium particles correlates with nuclear factor kappaB（NFkappaB）activation and increased rel A and NFkappaB 1 binding to the collagen promoterJ.J Bone Miner Res,2001,16（3）:501510. 13 Kuroda S,Takeda S,Nakamura M.Effects of six particulate metals on osteoblastlike MG63 and HOS cells in vitroJ.Dent Mater J,2003,22（4）:507520. 14 Yao JL,CsSzabo G,Jacobs JJ,et al.Suppression of osteoblast function by titanium particlesJ.J Bone Joint Surg（Am）,1997,79（1）:107112. 15 Kuroda S,Takeda S,Nakamura M.Effects of six particulate metals on osteoblastlike MG63 and HOS cells in vitroJ.Dent Mater J,2003,22（4）:507520. 16 Fritz E A,Giant TT,Vermes C,et al.Titanium particles induce the immediate early stress responsive chemokines IL8 and MCP1 in osteoblastsJ.J Orthop Res,2002,20（3）:490498. 17 Dean DD,Schwartz Z,Liu Y,et al.The effect of ultrahigh molecular weight polyethylene wear debris on MG63 osteosarcoma cells in vitroJ.J Bone Joint Surg（Am）,1999,81（4）:452461. 18 Lohmann CH,Schwartz Z.,Koster G,et al.Phagocytosis of wear debris by osteoblasts affects differentiation and local factor production in a manner dependent on particle composition J.Biomaterials,2000,21（6）:551561. 19 Kwon SY,Takei H,Piolletti DP,et al.Titanium particles inhibit osteoblast adhesion to fibronectincoated substrates J.J Orthop Res,2000,18（2）:203. 20 Pioletti DP,Takei H,Kwon SY,et al.The cytotoxic effect of titanium particles phagocytosed by osteoblasts J.J Biomed Mater Res,1999,46（3）:399407. 21 OConnor DT,Choi MG,Kwon SY,et al.New insight into the mechanism of hip prosthesis loosening:effect of titanium debris size on osteoblast function J.J Orthop Res,2004,22（2）:229236. 22 Heinemann DE Lohmann C,Siggetkow H,et al.Human osteoblastlike cells phagocytose metal particles and express the macrophage marker CD68 in vitro J.J Bone Joint Surg（Bt）,2000,82（2）:283289. 23 Kwon SY,Lin T,Takei H,et al.Alterations in the adhesion behavior of osteoblasts by titanium particle loading:inhibition of cell function and ge