药用微生物学综述.docx

微生物生物转化在药物合成中的应用摘要：微生物在药物的合成开发中具有十分重要的作用，除了其次级代谢产物成为疾病的药物来源外，微生物的酶在药物合成中的应用也越来越多，微生物的酶生物转化具有反应温和、立体选择性强和效率高的优点，已成功地应用于甾体药物和手性药物的合成中，在某些中药的开发中也有广阔的前景。微生物对药物合成的贡献越来越大，仍然具有更深的潜力。关键词：微生物； 生物转化； 甾体； 手性药物 The Applications of Microbial Biotransformation in Pharmaceutical SynthesisAbstract：Microorganisms play a very important role in the development of synthetic drugs. In addition to their secondary metabolites as a new medicine source, the application of microbial enzymes in drug synthesis is also increasing. The microbial transformation has been successfully applied to the synthesis of the steroid drugs and chiral drugs, and has broad prospects in the development of Traditional Chinese Medicines because of the advantages of mild reaction, stereo selectivity and high efficiency. Microorganisms make a bigger and bigger contribution to drug synthesis, and still have a greater potential.Key Words: Microorganism; Transformation; Steroid; Chiral drugs微生物生物转化是指利用生物体系，如细胞和酶等作为催化剂，实施有机合成目的的合成方法，具有传统化学合成不可比拟的优点，如选择性好、催化效率高、反应条件温和、环境友好等。微生物转化提供了许多常规化学方法不能或不易完成的合成方法1。现代生物转化研究一般认为始于巴斯德时代，但工业化生物转化最重要的里程碑应该是二十世纪 50 年代利用微生物对甾体化合物的结构改造。此后，一些重要生物技术的发展导致了有些传统的化学反应工艺被由生物催化剂催化的生物转化反应所代替，目前微生物生物转化已在复杂分子药物（典型如甾体药物）的合成或半合成、手性药物拆分或不对称合成以及中药现代化合成等方面有了较为成功的巨大发展，大大简化了生产路线，降低了成本。微生物转化与复杂分子药物合成分子结构较为复杂的药物，如甾体药物等，依靠传统的化学工艺进行合成，不仅合成路线复杂，一些特殊位点上的反应也难以进行，如甾体C11位羟化反应，化学法很难进行，而采取微生物转化法则比较容易。1.1 甾体药物的微生物合成甾体药物的微生物合成是微生物转化法在医药合成领域的一大重要成功典范，促进了甾体合成药物的发展。目前对甾体激素类药物的合成比较重要的反应有氧化反应（主要为甾体骨架上的羟基化反应）、还原反应和水解反应。实验室主要研究2个甾体药物的羟化反应：去氢表雄酮的C7和C15位羟基化和坎利酮的C15和C11位羟基化反应1。表1为常见催化甾体羟基化的微生物。1.1.1 去氢表雄酮的双羟化反应Peart2等人利用尖孢镰孢变种病菌UAMH 9013对去氢表雄酮等11个底物进行培养，通过雄甾烷-3，17 -二酮、雄甾烷-4,6-二烯-3,17-二酮和3,5-cycloandrost-6-en-17-one对结果进行探讨，证明了可能存在的C7和C15羟化酶。Hu, Haifeng3等人通过利用炭疽菌（Colletotrichum lini (AS 3.4486)）对去氢表雄酮底物进行生物转化，合成了7, 15-二羟基雄烯醇酮。实验结果表明，该方法的产率约为90%，去氢表雄酮的转化率可达到75%。1.1.2 坎利酮的生物转化通过对坎利酮进行结构修饰可得到临床治疗心血管疾病的药物Eplerenone，其中的C11羟化反应可经过微生物转化来完成。为了获得其新的结构衍生物，人们通过赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus）羟化酶转化系统对坎利酮进行转化研究，发现了不同的酶系转化形成多个转化产物，包括15-羟基坎利酮、11-羟基坎利酮和11-羟基-6,7-二氢坎利酮等化合物4。Bie, Songtao5等人利用赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus）对底物坎利酮进行生物转化培养，使得坎利酮转化为关键中间体11-羟基坎利酮，最终获得了很高的转化率。1.1.3 甾醇侧链的降解6微生物选择性降解植物甾醇侧链获取甾体药物合成的重要中间体雄-4-烯-3, 17-二酮 ( 4-AD) 和雄甾-1, 4-二烯-3, 17-二酮 ( ADD) 对于我国制药行业 具有重要意义。对 4-AD和 ADD的活性部位进行结构改造, 可以合成出多种甾体药物。微生物对甾醇作用产生 4-AD 和 ADD主要包括侧链的降解, C-3位羟基氧化成酮基以及 C-5, 6位双键的氢化。其中, 起决定作用的是侧链的降解。甾醇侧链的降解开始于 C-27位的羟化, 然后经过氧化, 最终截断于 C-17位。选择性控制微生物降解侧链的途径主要有以下两种: 加入酶抑制剂以及利用诱变技术。诺卡氏菌、分枝杆菌、节杆菌和假单胞杆菌等微生物都能将甾醇类化合物作为碳源利用, 而使甾醇降解。其中分枝杆菌应用最为广泛。1.2 其余复杂药物的合成除甾体药物外，一些分子结构较为复杂，难以通过化学法全合成的中药，如青蒿素，也可通过微生物转化来合成。青蒿素是我国从中药中自主开发的抗疟药物，许多科研工作者都试图通过结构改造，以提高青蒿素的资源利用率。迄今已制备了数百个青蒿素的衍生物，并筛选出双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿虎酯及青蒿酯钠等几个高效抗疟衍生物，但是由于青蒿素的有效活性基团过氧桥的不稳定性，使得对青蒿素结构改造无法在酮基以外的部位进行，目前可用的化学改造方法都停留在对酮基的还原及对羟基的取代反应上。1 Chris7等人依次利用改造筛选过的高产大肠杆菌（Escherichia coli，25g/L）和酵母（Saccharomyces cerevisiae，40g/L）发酵来半合成青蒿素，通过大肠杆菌合成中间体紫穗槐二烯，然后转移到酵母中发酵，最后进行简单地化学修饰，得到抗疟疾药青蒿素。下图为主要合成流程。C. J. Paddon8等人利用基因修饰的酵母菌进行发酵生产青蒿素，得到高水平产率的产物，为青蒿素的工业化扩大生产提供了新的途径。微生物转化与手性药物合成在自然状态下, 手性药物的两种形态虽然化学组成一样, 但它们各自的毒性、生理活性和药理作用往往存在着差别。合成手性药物的生物转化反应大致可分为两类：一类是把外消旋体拆分为两个光活性的对映体；另一类是从外消旋或前手性的前体出发，通过催化反应得到不对称的光活性产物9。通过微生物酶催化不对称合成反应或拆分外消旋体合成医药手性中间体具有独特的优势。常用的微生物酶主要为脂肪酶，典型的包括细菌脂肪酶，如来自绿脓杆菌(P. aeruginosa)、荧光假单胞杆菌(P. fluorescens)、假单胞菌(Pseudomonas)、洋葱伯克氏菌(B. cepacia)、染色粘性菌(C. viscosum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等以及来自真菌的南极假丝酵母(C.antarctica B)和皱褶假丝酵母(C. rugosa)的脂肪酶，在这方面已有大量的报道10。2.1 手性药物的外消旋体拆分通过微生物酶选择性拆分（Enantioselective resolution）外消旋体得到手性药物，就是利用生物酶或含有活性酶的微生物菌体作为生物催化剂，将其中一个对映体进行选择性转化，达到外消旋体拆分的目的。微生物酶选择性拆分反应具有高度的立体专一性，副反应小，产率高，产品分离提纯简单，产物光学纯度很高，而且反应过程大多在温和的条件下进行，可以弥补化学拆分法拆分消旋体的许多不足11。Yousefi12等人利用固定在辛基琼脂糖凝胶上的皱褶念珠菌脂肪酶（CRL）和米根霉脂肪酶（ROL）对水解后外消旋的布洛芬酯进行手性拆分，可明显地分离出S-（+）-布洛芬（ee值95%），也证明了微生物酶手性拆分的可行性。酶法拆分外消旋体在实验室制备和工业生产中都已取得长足的进步，但是仍然有其局限性。比如菌种筛选困难、酶制剂不易保存、产物后处理工作量大，以及通常只能得到一种对映体等缺点。尽管如此，利用微生物进行手性药物的合成及对映体的拆分仍是当前研究热点13。2.2 手性药物的不对称催化合成微生物酶催化不对称合成（Asymmetric synthesis）是指一个有机反应，其中底物分子整体中的非手性单元由反应剂以不等量地生成立体异构产物的途径转化为手性单元。应用生物催化转化技术进行不对称合成与化学合成法相比较具有的优越性9有：转化底物某一基团的专一性强，即对不需要转化的基团无需保护；通过对用于某一转化的微生物进行菌种选育和转化条件的优化，可以得到极高的转化率；生物催化转化的反应条件温和对环境的污染很小。赵秋堂14比较了5种不同的R-沙美特罗的合成方法，其中以深红酵母（Rhodotorula rubra）为催化剂不对称合成R-构型的环氧化合物，进一步得到目标分子。它利用了酶促反应的高立体选择性、区域选择性和化学选择性将化学合成的外消旋体、前体或潜手性化合物转化为单一光学活性产物。但该法对化学和热不稳定、与有机溶剂不相溶等因素造成其难以推广使用。其合成路线如下：近年来人们越来越多地筛选得到可降解有机卤化物的微生物，并从中分离得到卤醇脱卤酶，经研究发现卤醇脱卤酶不但可以催化碳卤键的断裂进行脱卤反应，而且可以高选择性地催化接受除卤离子外的一系列非自然亲核试剂，如N3、NO2、CN等所介导的环氧化物开环反应，用以生成一系列光学纯的-取代醇。因此，卤醇脱卤酶在手性药物合成方面的应用备受瞩目15。微生物是我们重要的医药资源之一，目前微生物已在医药合成领域取得了不错的成就，在一些复杂药物或手性药物的合成上具有巨大的优势与特点，可以大大地简化生产流程，降低生产成本，但是，微生物转化在医药合成中也存在副产物分离复杂、对某些反应条件不适应等问题。然而，随着现代科学技术的进一步发展，我们对微生物的进一步认识，必定会促进药物研究的快速发展。References: 1.胡海峰与朱宝泉, 微生物在药物开发中的应用. 中国天然药物, 2006(03): 第168-171页. 2.Peart, P.C., et al., Hydroxylation of steroids by Fusarium oxysporum, Exophiala jeanselmei and Ceratocystis paradoxa. Steroids, 2011. 76(12): p. 1317-1330. 3.Hu, H., R. Tao and Q. Zhang, Production of 7,15-dihydroxyandrostenolone by Colletotrichum lini and solvent extraction. 2008, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Peop. Rep. China . p. 10pp. 4.胡海峰, 李晓敦与朱宝泉, 微生物甾体羟化技术及其应用. 国外医药(抗生素分册), 2006(02): 第76-78+95页. 5.Bie, S., J. Wang and F. Lu, High-efficiency preparation of 11-hydroxy canrenone from canrenone with Aspergillus ochraceus. 2013, Tianjin University of Science & Technology, Peop. Rep. China . p. 5pp. 6.张裕卿与王东青, 植物甾醇微生物转化制备甾体药物中间体的研究进展. 微生物学通报, 2006(02): 第142-146页. 7.Paddon, C.J. and J.D. Keasling, Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. 2014. 12(5): p. 355-367. 8.Paddon, C.J., et al., High-level semi-synthetic production of the pote