HPLC（高效液相色谱）实验讲义.doc

仪器分析 高效液相色谱实验 实验一 高效液相色谱柱性能考察一. 实验目的掌握考察色谱柱基本特征的方法二. 基本原理评价液相色谱柱的性能是否优良，有不同的方法和考察指标。本实验用理论塔板数和峰对称性两个方面进行考察。（1）理论塔板数：色谱柱的分离效率（简称柱效），可定量地用理论塔板数来表示，理论塔板数反映色谱柱本身的特性，可表明柱受填料颗粒度、柱内径、流动相流速和粘度、进样方式等影响，是一个具有代表性的参数。 n = 5.54(tR/ w1/2)2 = 16(tR/ w)2 H = L /nn理论塔板数，tR组分保留时间，W1/2半高峰宽，W峰宽，L色谱柱长，H理论塔板高度。(2) 峰对称性：若色谱填充不均匀或柱子经长期使用及保存不当，都会引起色谱峰的不对称。峰不对称性用峰不对称因子（Peak Asymmtrey Factor ）表示。其计算方法见图1，由峰顶向基线作垂线，并在峰高10%处作基线平行线，得A，C，B三交点，则峰不对称因子可由下式计算求得：PAF = CB/AC 一根良好的色谱柱，峰不对称因子应在0.8-1.2范围内。图 1 峰不对称因子计算示意图三. 仪器和试剂1 HP 1100高效液相色谱仪（配DAD检测器，检测波长254 nm），超声波清洗机（流动相脱气用），50 L平头微量注射器，不锈钢色谱柱2流动相为甲醇：水= 85：15（体积比) ，实验混合物为萘联苯（1：1）四 实验步骤 1HP1100使用步骤 （1）开泵, 检测器, 柱温箱，电源 （2）开电脑，当Bootp sever 打出七行字后，打开HPLC Chematation on line （在线工作站） （3）设置流动相的比例（二元泵），流速1.00-5.00 ml/min, 打开purge阀，赶走气泡，打开柱温箱，打开 DAD 检测器。等赶尽气泡后关闭purge阀，流动相通过柱子。 （4）设置并保存方法，设置样品信息，文件保存路径。 （5）等基线平稳后，按Balance按钮，平衡后等Ready出现可进样。在下一针前先按Balance平衡同上，等Ready出现后，再进样。 （6）实验完毕用水（有盐时）或甲醇分别冲洗柱子约半小时，此时柱温箱和检测器可关闭。用水或甲醇冲洗进样器，扳动进样器几次，冲洗干净，关闭泵。 （7）关闭chemstation online后，再关闭泵，检测器，柱温箱，电源。 （8）打开chemstation offline工作站进行数据分析，作标准曲线。测量浓度。2色谱柱性能检查（1）将填好的色谱柱接入色谱系统（2）启动仪器，待基线平稳后进样（3）进样完毕后，出现完整的色谱图，保存记录数据五 数据处理根据柱长（cm），组分保留时间tR(min)，组分的半高峰宽W1/2(min)，计算每米的理论塔板数、理论塔板高度和组分的不对称因子。 六 问题讨论 1 根据数据处理的结果，评价所填充的色谱柱的性能。 2 简述评价液相色谱柱的方法和指标。实验二 稠环芳烃的高效液相色谱分析一 实验目的1 学习高效液相色谱仪的使用方法2 学会使用外标法色谱定量方法二 基本原理 采用非极性的十八烷基键合相（ODS）为固定相和极性的甲醇水溶液为流动相的反相色谱分离模式特别适合用于同系物如苯系物等的分离。苯系物和稠环芳烃具有共轭双键，但因共轭体系的大小和极性不同，因而在固定相和流动相之间的分配系数不同，导致在柱内的移动速率不同而先后流出柱子。苯系物和稠环芳烃在紫外区有明显的吸收，可以利用紫外检测器进行检测。在相同的实验条件下，可以将测得的未知物的保留时间与已知纯物质做对照而进行定性分析。由于各组分在检测波长的摩尔吸收系数不同，同样浓度组分的峰面积不一定相等，因而，在以峰面积或峰高为依据进行归一化的定量分析时，需经校正因子校正后方可达到准确定量的要求。但在以外标法进行定量分析时由于是在相同实验条件下对同一组分进行检测，因而不需要考虑校正因子，可根据试样和标样中组分的色谱峰面积（或峰高）Ai和As及标样中的质量分数ws直接计算出试样中组分的质量分数wi.wi = wsAi/As * 100%三. 仪器和试剂1 HP1100高效液相色谱仪（配DAD检测器，检测波长254 nm），超声波清洗机（流动相脱气用），50 L平头微量注射器，不锈钢色谱柱2. 流动相：甲醇：水= 85：15（体积比)3. 苯，甲苯，萘，联苯（均为AR级），甲醇为HPLC级 ，水为二次重蒸水4. 标准样品：分别配制含苯，甲苯，萘，联苯单组分及四组分混合样品各一份，组分浓度均约为0.05%，用流动相配成。5. 试样（未知）四 实验步骤 1HP1100使用步骤（同实验一） 2按要求打开计算机和液相色谱主机，调整好流动相的流量，检测波长等参数，用流动相冲洗色谱柱，直至工作站上色谱的流出曲线为一平直的基线。 3分别取苯，甲苯，萘，联苯标准样品25 L进样，记录色谱的保留时间。 4取混合物标准溶液25 L进样分析，测得标样中四组分的峰面积。 5取未知试样25 L进样，由色谱峰的保留时间进行定性分析，以色谱峰的面积进行外标法定量。 6 所有同学实验结束后按开机顺序逆序关机。五 数据处理 色谱柱： 检测器波长： nm组分名称组分含