萘啶类荧光小分子在缺陷DNA腔体内荧光行为的研究毕业论文.doc

萘啶类荧光小分子在缺陷DNA腔体内荧光行为的研究毕业论文目 录摘要1关键词1Abstract .1Keywords. 21 前言32 实验部分42.1 主要试剂及仪器42.2 荧光光谱的测量43 结果和讨论53.1 非标记分子信标的设计53.2 GSMB探针的表征53.3 使用非标记分子信标检测目标DNA84 结论9参考文献11谢 辞12 1 前言DNA的杂交序列特异性的检测，已经引起了包括分子诊断、环境检测等领域的广泛关注, 因此，对敏感性和选择性探针的需求越来越多。DNA序列分析是现代分子诊断学的基础，对于各种遗传类疾病、病毒或细菌的感染、遗传与变异都有重要意义。尤其对于基因药物治疗、靶向释放等水平上的个性化用药，最终都依赖于基因测序结果。近年来，DNA测序技术的飞速发展，加速了人类基因组计划的完成，对基因结构分析和功能研究做出了巨大的贡献。长期以来由于特异性DNA探针的大量需求，各种分子工程在最近几年迅速发展起来了。包括荧光共振能量转移（FRET）探针、临近探针、荧光探针等。在这些DNA探针中，由于分子信标的稳定性和特异性的特点，受到极大的关注。传统的分子信标是有茎环结构的低核酸探针。当一个分子信标与它的遗传微粒，随着茎的曲张导致荧光恢复，它经历了一个自发的构象重组。其独特的目标识别和信号传导的能力的关系已经在许多生物化学和生物学中大量的运用，包括定量聚合酶链式反应，DNA-蛋白质相互作用，多基因分析以及信使RNA在活细胞中的表达等。从1996年第一次发现分子信标到现在，利用信标在检测盒研究的技术得到了不断地提高和进步。新类型的分子信标已经发展到了波长的移动和酶的增加与电化学信号之间的相互转化。分子信标是一种新型的可以特异识别核酸序列的荧光探针，这种荧光探针通过与核酸靶分子进行杂交后构象发生变化而发出荧光，他们将其命名为分子信标(MB) 。分子信标具有灵敏度高、背景信号低、特异性识别性强、操作简单以及可进行实时检测等优点，在近几年内得到了迅速发展，并已广泛地应用于实时监测聚合酶链反应（PCR）、基因突变的快速分析、DNA、RNA 的检测、DNA/RNA杂交的动力学研究以及DNA/蛋白质相互作用研究等，其应用领域仍在不断拓展。虽然使用了传感器系统，在许多情况下，即使是允许一个单核苷酸错配的检测，系统仍然需要特定的标记探针例如荧光染料，因此设计一个基于光学的原理来探测的方法来替代分子信标的寡核苷酸标记是使用最广泛的。利用在DNA链中嵌入染料的方式来检测在溶液中的双链DNA，作为一个简单的和无标记的探针设计方法，这种方法在分子信标的情况下有内在的局限性。这是因为染料可以嵌入在MB的干部分产生一个大的干扰。一些小的荧光分子可以通过氢键结合绑定到未配对的碱基，其中伴随着荧光小分子的猝灭。最初时分子信标应用于聚合酶链反应(PCR)的检测，由于分子信标的灵敏性，可以对扩增产物和整个扩增过程进行实时监测。近年来，随着分子信标技术的不断发展，人们通过改变分子信标的结构，构建了许多新型的分子信标来检测DNA。在分子信标结构的茎部设计一个空缺位点且空缺位点的对面是C碱基，荧光小分子ATMND能通过氢键结合到空缺位点处的未配对C碱基，从而形成非标记分子信标，使其荧光发生淬灭。当加入与分子信标环状部分互补的目标DNA后，分子信标的发卡结构打开释放出ATMND使其荧光恢复，从而实现对目标DNA链的检测。本研究的意义在于设计的非标记分子信标不需要通过共价的方式对DNA探针进行标记，因而具有结构简单，容易合成且价格低廉的特点。此外，我们研究的非标记分子信标的两端是未占据的，因而可以进行其他修饰（图1）。图1 实验原理图2 实验部分2.1 主要试剂及仪器2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶(ATMND)、二甲基砷酸钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）。实验中所用试剂均为分析纯，实验用水均为高纯水。DNA由上海生工生物工程技术公司生产合成，序列如表1所示。RF-5301荧光分光光度计(日本岛津）、PC紫外-可见分光光度计（日本岛津）。2.2 荧光光谱的测量用带有热电温度控制盒的荧光分光光度计在370到500nm波长范围内测量，荧光激发波长350nm。激发和发射狭缝宽度为0.5nm到2.0nm之间，扫描速度为100nm/min。表1 探针和目的寡核苷酸设计名称序列注释M13-CCTGCCACGCTCCGCCCCTAGCTCTAAATCACTATGGTCGCGCTAGG-5S13、- GCGGAGCGTGGCAGG-5、cDNA3、-GCGACCATAGTGATTTAGA-5、完全匹配TM3、-GCGACCATANTGATTTAGA-5、(N = A, T或者C)单碱基错配TM23 、-GCGTCCATAGTGATTAAGA-5、 两碱基错配TM43 、-GCGTCCATGATGATTAAGA-5、四碱基错配TN3、-CCGTCCCCAGTGATTAAGT-5、非互补3 结果和讨论3.1 非标记分子信标的设计如图1所示，非标记分子信标是由一个小的荧光分子组成的，含有47个核苷酸的DNA链（M1），并含有15个核苷酸的DNA链（S1）。S1链是15个碱基序列互补的（斜体M1由15个碱基构成）在M1末端的3、上。M1/S1合成体，是由胞嘧啶的相反的缺口位点组成，一个发夹结构（下划线基地M1）组成的6个碱基对干和19个环序列（斜体下划线的基地和M1写），是由退火溶液M1（2m）和S1（2m）构成的。把2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶（2m）添加到M1 /S1复合溶液形成更复杂的M1 / S1 / 2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶溶液。上面描述的就是非标记分子信标的设计，称之为GSMB。通过对2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的实验，不成对的胞嘧啶将会在S1/M1复杂的缺口位点紧密结合，导致其荧光猝灭。一个打开的发夹结构将会从GSMB中释放出2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶。3.2 GSMB探针的表征为了证明所示的方法的可行性，我们评估了GSMBs的荧光在遗传微粒上的缺失以及在目标基因变化后的荧光情况。图2显示了2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光光谱（2m）在含有100mM 氯化钠和1mM四乙酸二氨基乙烯的10mM的二甲胂酸钠缓冲溶液变化情况。在M1/S1分子的复杂结构情况下，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶荧光表现出的发射波段在401nm处的和最多（曲线a）。然而，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶除了比M1/S1分子结构复杂外（图2，曲线b），其荧光表现出显著的猝灭现象，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光从201u减少到11u。在2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光强度略有下降时，观察到一个ss的M1，S1或完全匹配的双链的存在。一个小的荧光分子可以通过氢键的为成对碱基结合在DNA双链上。这导致分子的荧光猝灭。这些结果表明，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶纳入M1/S1分子结构的复合物的干基部分的缺口位点中，是通过氢键来结合胞嘧啶的。在对GSMBs的其他的cDNA的反应进行研究，如图2所示，在加入1.5M的目的cDNA 后，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光强度在恢复了13倍(图2，曲线c)。当可以被分配到另外的目标时，增加回收2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶荧光的强度。图2 加入M1/S1复合物前后ATMND的荧光光谱Fig. 2. Fluorescence spectra of ATMND before (a) and after bound to M1/S1 complex to form GSMB (b). (a) ATMND alone (2.0 M); (b) GSMB (ATMND (2.0 M) in the presence of M1/S1 complex (2.0 M). Spectra (c) is uorescence spectra of GSMBs (M1/S1/ATMND complex, 2.0 M) in the presence of target cDNA (1.5M). Sample solutions were adjusted to pH 7.0 with 10 mM sodium cacodylate containing 100 mM NaCl and 1 mM EDTA.为了定量地确定2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶胞嘧啶在缺口位点的M1/S1的复杂情况，对2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光滴定法进行了研究。在401nm处的荧光强度所产生的变化提供了一个按1:11/S1分子结构复杂/2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的测定终点，说明2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶形成了稳定的1：1的复合物与M1/S1复杂的缺口位点。结合常数K值8.1106M-1，在本实验滴定曲线测定下，得出2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶含有不共价结合的DNA。这种非标记分子信标采用“信号”的方法，重点考虑的是让灵敏度达到最高。作为常识，宏块的灵敏度可以通过增加荧光团的强度或提高猝灭剂的效率提高。一个小的荧光分子可以捆绑到一个未成对的基地，这就是侧翼的结合位点的碱基与一个未成对碱的氢键和堆叠。因此2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光猝灭效率可能会受未成对的胞嘧啶在复杂的M1/S1的缺口位点的影响，即使在2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶和胞嘧啶碱基之间有互补的氢键，也无法避免。为了检查侧翼碱基上荧光猝灭的效果，我们研究了2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶序列在一个单一的胞嘧啶M1/S1复杂干部分的依赖性结合的缺口位点。如图2所示，最强的淬灭是2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶绑定的M1/ S1复杂的具有GG碱基对在5、和3、侧间隙站点（图3），在401nm处的荧光强度猝灭高达95%，在基准2.0M处，M1/S1分子结构复杂。对于其他的侧链碱基（图3，光谱b-e），观察到的荧光猝灭是相对稳定的，在那儿的顺序是T-T(74%)C-C(76%)A-A(83%)。200a:ATMND 180 ab:-TCT-/-A.A-160荧光强度 d:-/-T.T-c:-GCG-/-C.C-140e:-CCC-/-G.G-120100 80 60 4020 0 波长 500480460440420400380图3 侧链碱基对探针识别性能影响的考察Fig. 3. Fluorescence spectra of ATMND (2.0M) in the presence of 2.0M M1/S1 complex with different anking bases.这些结果表明，虽然在2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶和胞嘧啶碱基之间互补的氢键发挥了很重要的作用，但是缺口位点依然对荧光猝灭效率产生了影响。所以在GSMs中我们选择5、和3、的GS缺口位点。在紫外线范围内的CD光谱可以用来监测DNA的构象转变。如果确定的构象发生变化，结合后的2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶在M1S1复杂的茎部分的缺口位点，镉的实验进行了M1/S1复杂之前和之后的2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶结合。在没有2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶和遗传微粒时，M1/S1分子结构的复合物显示在250nm处取得负峰值，在275nm处取得正峰值，这是在一个茎部分的螺旋特征的-构象。而添加2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶后，在M1/S1/2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶没有观察到明显的复杂诱导CD（GSMBs）,表明2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶与胞嘧啶碱基的结合，茎的部分的缺口位点不诱导M1S1复杂的的构象变化。因此，它不影响靶DNA的杂交动力学。我们推断在250nm处的CD峰值的增加是由于GSMB环遗传微粒的长螺旋线形成的。3.3 使用非标记分子信标检测目标DNA由于2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光猝灭效率与浓度和M1/S1分子结构有关系，为了优化条件，我们选择2M的浓度，实现了良好的灵敏度。在最佳条件下，在校准曲线的基础上获得三组平均测量值（图4）。220200荧光强度1802M160140 12050nM1008060 40 200 500480460440420400360 波长图4 目标链的浓度与ATMND荧光强度关系图Fig.4. Fluorescence spectra of a GSMB after hybridization with (from up to down) 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, and 0 M of cDNA, respectively.如上图所示，正如预期的那样，当信号增强时，观察到荧光强度在50nM到1.5M的范围内，与cDNA浓度成正比。线性回归方程为I = 11+81c(M)(r=0.9923),检测限为20nM，经过多次重复测量，得出用7个测量值的相对标准偏差小于5%。对GSMB的观察报告表明，分子信标的选择性一般是归因于茎环结构的构象。对GDSMB选择性研究测量分别为1.5M遗传微粒(cDNA)杂交后的GSMBs荧光，1.5M单碱基错配的DNA(TM)，1.5双碱基的寡核苷酸（TM2），1.5M四个碱基不匹配的寡核苷酸（TM4）和1.5M全匹配DNA。所有的结果都显示在图5中。对于全匹配DNA，几乎没有观察到什么响应（数据未显示）。该GSMBs回应的单碱基错配，但反应明显小于全匹配DNA（图5）。对应背景荧光GSMNs上观察到的发光强度，杂交的全匹配DNA和在溶液中的单碱基错配的DNA分别提高了13倍和4倍，这表明对目标序列的选择性比较高。两个碱基错配寡核苷酸（TM2）显现出了一个接近五分之一分子信标中加入与环状区互补的目标链Target后，分子信标可与目标链Target形成相对刚性并且更加稳定的体系，使茎状部分碱基互补链被拉开，分子信标茎状部分中的空缺位点遭到破坏，ATMND荧光恢复。从四个碱基错配寡核苷酸的响应（TM4）是可以忽略的，就像是从完全互补的寡核苷酸的响应。380400420440460480500020406080100120140160180200220荧光强度 1: ATMND2: MB+Target+ATMND3: MB+Target1c+ATMND4: MB+Target1b+ATMND5: MB+Target1a+ATMND6: MB+ATMND16波长 图5 含有双碱基错配的目标链对ATMND荧光强度的恢复Fig 5. Fluorescence quenching of hybridization solution includes fluorescence intensity of solution includes double basic group mispairing target is lower than the complementary target.4 结论在这次试验研究中，将传统的分子信标结构改变，延长分子信标茎状部分并在其中设计一个空缺位点，使得荧光杂环小分子ATMND可以与空缺位点对面的C碱基特异性结合，来构建非标记信号增强型荧光分子信标。在这个过程中，由于与C碱基结合后，ATMND结构发生变化，使得ATMND的荧光会发生淬灭。向分子信标体系加入与环状部分完全互补的目标链，通过荧光检测，发现ATMND荧光有一定的恢复。同时也考察了含有错配碱基的目标链对ATMND荧光的恢复。实验结果表明，完全互补的目标链可以很明显的与含有错配碱基的目标链区分。当非标记分子信标增加时与全匹配DNA杂交产生强烈荧光现象，然而，荧光强度稍微一点点的增加都会导致得到不匹配的DNA序列。因此，非标记的分子信标在这项研究中是有用的探针，可以用来区分他们的目标和单碱基错配的DNA序列。不同于传统的分子信标，在这项研究中的非标记的分子信标和其他有用的功能的测试效果都是比较显著的。在使用分子信标进行碱基错配分析时，对错配位点的位置没有特别的要求，改变错配碱基的位置，并不能改变分子信标的特异性，也不会影响反应结果的准确性，同时证明了分子信标比普通线性核酸探针的应用具有更大的灵活性，所以分子信标的应用前景是非常广阔的。参考文献1 G. T. Hwang, Y. J. Seo, B. H. Kim. A highly discriminating quencher-free molecular beacon for probing DNAJ. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126(21): 6528-6529.2 T. Matsuo. In situ visualization of messenger RNA for basic fibroblast growth factor in living cellsJ. Biochim. Biophys. 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