DEN2 NGC株感染BALBc小鼠TH1TH2类细胞因子产生的差异①.doc

DEN2 NGC株感染BALB/c小鼠TH1/TH2类细胞因子产生的差异【摘要】目的：通过观察2型登革病毒（DEN2）NGC株初次感染和再次感染BALB/c小鼠后小鼠血浆中TH1和TH2类细胞因子的产生及其动态变化，研究DEN2感染的免疫机制。方法：用不同量的DEN2 NGC株经皮下多点注射，建立BALB/c小鼠感染模型，间接ELISA法测定感染后不同时间小鼠血浆IL2、IFN、IL4、IL5、 IL6、 IL10的含量。结果：（1）在初、再次感染阶段，DEN2 NGC株各感染组产生IL4、 IFN、 IL2、IL5、 IL6、 IL10与正常对照组有显著差异(P0.05)。在初次感染阶段，NGC株各感染组血浆IL2、IL5、IL6于第4、6、8天出现；在再次感染阶段，各感染组产生IL2、IL5、IL6均于第1天迅速升高；IL2水平于第4天达高峰（104 448.4613 314.1 pg/ml），维持57天后迅速下降；IL5于48小时达到高峰（135.12546.75 pg/ml）；各组小鼠IL6产生的动态相似，在再次感染后第1天，达高峰（555.82344.639 pg/ml）后逐渐下降。初次感染早期，IL4水平明显升高，而IFN处于较低水平；再次感染后第1天，IL4水平达最高峰（4 294.668349.038 pg/ml），IFN则于第4天和第11天达较高水平，两者的产生彼消此长，且产生动态与感染病毒量有关。（2）在初、再次感染阶段，用不同量DEN2 NGC株感染组产生细胞因子水平有差异。结论：DEN2 NGC株初次和再次感染BALB/c小鼠后，TH1和TH2应答均可发挥一定作用，二者相互影响， TH细胞及其产生的CK在DEN感染的发病机制中起重要作用。 【关键词】 登革2型病毒 TH1 TH2 细胞因子The study for the dynamic levels of TH1/TH2 cytokines in the BALB/c mice infected with dengue type 2 virus NGC strainCHEN WenJie, ZUO Li, PAN Yu，SHANG ZhengLing.Department of Immunology，The Center of Tissue Engineering and Stem Cell Research, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, ChinaAbstract Objective:To observe the dynamic levels of TH1/TH2 cytokines from the plasma of BALB/c mice infected with DEN2 NGC strain and research immune response mechanism.Methods:The BALB/c mice plasma samples collected from different experiment groups at various time after infection were tested for IL2,IFNγ,IL4,IL5, IL6 and IL10 levels with indirect ELISA.Results:(1)The BALB/c mice could produce IL2,IFNγ,IL4,IL5,IL6 and IL10 after DEN2 infection and the correlation of cytokines with normal group(P0.05).The cytokines that appeared were IL2 on the fourth day,IL5 on the sixth day,and IL6 on the eighth day after DEN2 infection;In the reinfection phase,IL2 appeared on the first day with a rapid peak on the fourth day(104 448.4613 314.1 pg/ml) and then declined quickly after 5 to 6 days;IL5 appeared on the first day and reached a peak(135.12546.75 pg/ml);IL6 appeared on the first day with a peak on the 48 h(55.82344.639 pg/ml).The dynamic levels of IL4 and IFNγ in the plasma of BALB/c mice infected with DEN2 NGC strain were different.The levels of IL4 were significantly increasing after DEN2 infection while that of IFNγ were lower:IL4 reached a peak on the first day(4 294.668349.038 pg/ml) and then the levels of IFNγ higher on the forth and eleventh day. (2)The concentrations of cytokines produced by infected animals had been closely associated with the doses of DEN2.Conclusion:Both Th1 and Th2 responses are induced by DEN2 and play a role;while,Th2 response is more predominant than Th1 response.Th cell and Threlated cytokines are importance with DEN infective diseases. Key words Dengue virus type 2；TH1；TH2；Cytokines 登革病毒(Dengue virus, DEN)是由白纹伊蚊及埃及伊蚊传播的黄病毒属(Flaviviridae)的成员。有4种典型的血清型1。登革病毒感染人类最常见的是无明显症状的急性自限性发热性疾病登革热(Dengue fever, DF)，还可引起严重的威胁生命的登革出血热(Dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合症(Dengue shock syndrome, DSS)，其中以2型DEN感染最为常见2。近年来DEN感染在全球许多地方卷土重来，并且流行区域正在逐渐扩大，已成为世界上分布范围较广、发病率较高、危害性较大的疾病，引起国际医学界的高度重视。 DHF/DSS的发病机制，一直是医学研究的热点，国内外研究提示DEN感染诱导免疫细胞产生的细胞因子与其致病机理密切相关3。为了研究DEN感染的致病机制，本课题通过建立BALB/c小鼠感染模型，观察2型DEN NGC株初次感染和再次感染BALB/c小鼠后，小鼠血浆中TH1和TH2类主要细胞因子产生水平及其动态变化，研究DEN NGC株感染的免疫机制。1 材料与方法1.1 毒株和细胞株 登革2型病毒NGC株（New Guinea C strain）（鼠脑保存）购自中国预防医学科学院流行病所。恒河猴肾传代细胞（CV1）购自安徽医学科学研究所。以上病毒和细胞株由本室常规传代和液氮保存。1.2 动物 清洁级BALB/c小鼠140只，68周龄，1820 g/只，雌雄各半。购自云南省实验动物中心，质量合格书No.0001404。1.3 主要试剂 IFNγ（编号CG50711CA）、IL2（编号C45293CA）、IL4（编号CG49730C）、IL5（编号C148566C）、IL6（编号CF48701C）、IL10（编号CH51118C） ELISA原装试剂盒，Endogen公司产品，购自深圳晶美生物工程有限公司；TGFβELISA Kit（编号0404WK），Lifekey公司原装进口。1.4 动物的感染 将140只小鼠分为4组（每组35只，为避免过分拥挤，每组分为7笼，雌雄分笼饲养），同时设正常对照组。实验时间为秋冬季，将动物饲养于防蚊措施良好的特定房间，防止蚊虫叮咬。根据病毒TCID50滴定结果，分别用102、103、104、105 TCID50四个剂量DEN2临床株（分别以N1、N2、N3、N4组表示）以皮下多点注射感染动物，每组35只，连续3天，每天0.5 ml/只。于初次感染后第16天用100 TCID50的NGC株以相同途径再次感染动物，注射1次；正常对照组用稀释液（Hank’s液）同法注射。1.5 标本采集1.5.1 病毒分离及特异性抗体检测的标本收集 无菌操作采集各组初次、再次感染后第1周内鼠尾静脉EDTA抗凝血，分离血浆，用CV1细胞常规进行病毒分离，用间接免疫荧光法鉴定病毒。同时采集初次感染后第4、6、8、10、12、15天和再次感染后第1、2、4、8、11、18、25、31、38、45天各组鼠尾静脉血，分离血浆，用于检测特异性IgG、IgM类抗体。1.5.2 分别采集初次感染后第4、6、8、12、15天和第17、18、20、24、27、34天（即再次感染后第1、2、4、8、11、18天）各组每只实验小鼠尾静脉抗凝血，将同组小鼠血混合，用无菌PBS分别10倍稀释各组抗凝全血，4、5 000 r/min离心10分钟。取各组血浆小管分装，用于细胞因子检测，-30冻存，1个月内使用。1.6 检测方法1.6.1 病毒分离及特异性抗体的检测 将采集标本分离血浆，CV1细胞常规进行病毒分离，间接免疫荧光法鉴定病毒。同时将采集标本用间接ELISA法检测抗DEN特异性IgG、IgM类抗体。1.6.2 细胞因子的检测 用双抗体夹心ELISA法分别检测感染后不同时间IL4、IFNγ、IL5、IL6、IL10、IL2和TGFβ的浓度。按说明书操作。1.7 统计学处理 根据标准曲线通过OD值计算细胞因子浓度（pg/ml），用方差分析、t检验等进行统计学处理。统计学处理用Microsoft Excel 2000和SPSS 10.0完成。2 结果2.1 病毒分离及特异性抗体的检测 初次和再次感染后小鼠无死亡，能从感染小鼠外周血血浆中分离到DEN2并能诱导抗DEN2特异性IgM、IgG抗体产生4。2.2 细胞因子的检测2.2.1 IL2的动态变化 在初次感染阶段，NGC株各剂量感染组于第4天产生IL2但水平较低,维持到第68天后逐渐下降，四个剂量组产生IL2动态相似。 再次感染第1天各感染组小鼠产生IL2迅速升高，于第4天左右达到高峰，维持57天后迅速下降。正常对照组IL2维持在相对较低水平，各感染组与正常对照组存在显著性差异(P0.05)。用DEN2 NGC株病毒感染实验小鼠后产生IL2的水平及动态见图1。2.2.2 IL4的动态变化 在初次感染阶段，NGC株各感染组产生IL4较早，于第4天已产生。在再次感染阶段，各感染组于第12天IL4水平即达高峰，见图2。正常对照组IL4维持在相对较低水平，各感染组与正常对照组存在显著性差异(P0.05)。2.2.3 IFNγ的动态变化 NGC株初次感染BALB/c小鼠后，不同剂量病毒感染小鼠产生IFNγ时间有差异，N4组产生最早（第4天）；N1组出现最晚（第12天），见图3。再次感染后，各组小鼠产生IFNγ水平于第14天内上升并达到高峰。 正常对照组IFNγ水平在初次感染早期高于各感染组。在再次感染后期较N4组高。2.2.4 IL5的动态变化 各组实验小鼠于初次感染后第6天开始产生IL5，并于第1215天达到高峰，而后逐渐下降。在再次感染阶段，各组于第1天IL5水平开始升高，于第12天达高峰。在初、再次感染阶段，NGC株各感染组产生IL5的水平，各组之间有显著差异(P0.05)；各感染组与正常对照组存在显著性差异(P0.05)。NGC株感染各组后产生IL5的水平及动态见图4。图1 NGC株再次感染后BALB/c小鼠血浆中IL2的动态（略）Fig.1 Dynamic curves for levels of IL2 in the plasma of BALB/c mice after secondary infected with DEN2 NGC strainNote:↑ shown infection time.图2 NGC株初再次感染后BALB/c小鼠血浆中IL4的动态（略）Fig.2 Dynamic curves for levels of IL4 in the plasma of BALB/c mice after primary and secondary infected with DEN2 NGC strain图3 NGC株初再次感染BALB/c小鼠血浆中IFNγ的产生动态（略）Fig.3 Dynamic curves for levels of IFNγ in the plasma of BALB/c mice after primary and secondary infected with DEN2 NGC strain2.2.5 IL6的动态变化 在初次感染阶段，N1组始终未检测出IL6，其余各感染实验小鼠产生IL6较晚，在感染第812天才出现，其中N3和N4组IL6水平较高。在再次感染后第1天，各组小鼠迅速产生IL6并达高峰，而后逐渐下降，各组小鼠IL6产生的动态相似。正常对照组IL6维持在相对较低水平，各感染组与正常对照组存在显著性差异(P0.05)。NGC株感染后各组小鼠产生IL6的水平及动态见图5。图4 NGC株初再次感染后BALB/c小鼠血浆中IL5的动态（略）Fig.4 Dynamic curves for levels of IL5 in the plasma of BALB/c mice after primary and secondary infected with DEN2 NGC strain图5 NGC株初再次感染后BALB/c小鼠血浆中IL6的动态（略）Fig.5 Dynamic curves for levels of IL6 in the plasma of BALB/c mice after primary and secondary infected with DV2 NGC strain图6 NGC株初再次感染后BALB/c小鼠血浆中IL10的动态（略）Fig.6 Dynamic curves for levels of IL10 in the plasma of BALB/c mice after primary and secondary infected with DEN2 NGC strain2.2.6 IL10的动态变化 在初、再次感染阶段，各感染实验组产生IL10的时间相差较大。N3在整个感染阶段，只在初次感染末期出现一个小峰，然后在再次感染初期继续下降消失。各感染组与正常对照组存在显著性差异(P0.05)。NGC株感染各组后产生IL10的水平及动态见图6。2.2.7 TGFβ的动态变化 在初次感染阶段除N3外，各感染实验组于812天产生TGFβ达高峰。N3在整个感染阶段，只在再次感染末期出现一个小峰，见图7。图7 NGC株初再次感染后BALB/c小鼠血浆中TGFβ的动态（略）Fig.7 Dynamic curves for levels of TGFβ in the plasma of BALB/c mice after primary and secondary infected with DV2 NGC strainNote:↑ shows infection time.3 讨论 登革病毒感染所致疾病的发病机制至今仍未完全阐明。虽然细胞因子在登革病毒的致病过程中的重要作用已得到普遍认同，但各种细胞因子在DEN感染过程中的具体作用以及其对TH1和TH2应答优势之间转化的调节机制尚未完全明了。研究显示，抗原刺激后TH0细胞选择性地向TH1或TH2细胞的分化受多种因素的影响，如抗原递呈水平产生细胞因子的微环境、抗原的性质种类及剂量、抗原提呈细胞及其他一些mRNA水平的调控影响5。病毒作为抗原由于其数量、质量、分布范围、存在的部位等方面都可以不断地发生变化，决定了其诱发的免疫应答表现为多重应答和应答的持久性。 有研究表明，DEN感染后病情较轻时机体往往以TH1应答优势为主，而病情较重时则主要是TH2应答优势；登革热患者体内TH1应答占优势，在登革出血热患者则转化为TH2应答优势6。DEN2可主动在B细胞中复制，诱导B细胞产生IL67。IL6的水平上升与DHF/DSS患者的血液浓缩、浆液渗漏和腹水等临床症状有关，导致严重性DEN2感染性疾病。且IL6在再次感染抑制TH1细胞的分化，并在启动TH2细胞分化中起十分重要的作用，可加重疾病的发展。本研究结果显示在初次感染阶段即产生IL4，在以相同剂量(100 TCID50/0.5 ml)再次感染后，在第17、18天IL4上升到高峰时IFNγ处于最低水平，而当第20天IL4下降后IFNγ开始上升，并迅速达到峰值。提示登革病毒感染小鼠后，可引起TH2应答优势，产生IL4、IL5、IL6等细胞因子。各感染组中，N4和N3组产生IL4、IL6的水平较高，并与其他感染组存在显著差异(P0.05) 。 结果提示病毒抗原进入机体，刺激机体发生免疫应答。随着疾病的发展，IL4水平处于高峰，抑制TH1应答，表现为TH2应答优势。可能由于初次感染阶段后期，病毒进入靶细胞，如单核细胞、Kupffer细胞等，引起一定水平的细胞免疫，表现为IFNγ水平上升，同时对TH2应答起抑制作用，使病情有一定好转。在再次感染阶段早期，记忆性体液免疫对进入机体的病毒，迅速发挥作用；在再次感染阶段中期，细胞免疫发挥一定作用，抑制TH2应答，特异性CTL可通过溶解感染细胞来清除DEN，使病情好转；再次感染阶段后期，可能是DEN2感染的靶细胞被溶解破坏，释放小剂量病毒，引起的一定程度的体液免疫和细胞免疫应答。 TGFβ对于不同的靶细胞具有多种免疫调节作用。在不同浓度下，TGFβ可能发挥促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的作用。TGFβ可抑制TH1类细胞因子产生，而促进IL10等TH2细胞因子产生。对于登革病毒感染性疾病，TGFβ与病情严重程度及疾病持续时间均有关系。病情持续9天以上的DHF 级患者体内TGFβ水平最高。通过对血清中TGFβ1和IL12水平检测后发现，两者在DF和各级DHF中呈反相关7。高浓度的TGFβ可能抑制炎性细胞因子IL6的产生，中低浓度则促炎性细胞因子的产生。各N1、N2、N3组在再次感染阶段第27天IFNγ水平处于高峰，第28天TGFβ再次升高后IFNγ水平迅速下降，提示TGFβ可抑制IFNγ的产生。 本研究证明在DEN2 NGC株引起的登革病毒感染小鼠模型中，体液免疫和细胞免疫均发挥了一定作用并相互影响。TH细胞和其CK在DEN感染疾病的发病机制中起重要作用。【参考文献】 1Vaughn D W, Green S, Kalayanarooj S et al. Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity J. J Infect Dis,2000；181（1）:29.2Leitm