长春碱的提纯及其衍生物合成研究进展.doc

上海应用技术学院研究生课程（论文类）试卷2 015 /2 016 学年第 一 学期课程名称： 高等天然产物化学 课程代码： NX0702013 论文题目： 长春碱的提纯及其衍生物合成研究进展 学生姓名： 孙贵救 专业学号： 制药工程 156061423 学院： 化学与环境工程学院 课程（论文）成绩：课程（论文）评分依据（必填）：1. 论文结构规范，检索的文献资料经认真的综合分析整理，选材精简得当，条理清晰，语言流畅，版面整洁美观。得分为90-100分。2. 论文结构较规范，检索的文献资料经分析整理，材料组织得当，条理清晰，语言流畅。得分为80-89分。3. 论文结构基本规范，内容有小问题，检索的文献资料经一般性分类整理，条理较清晰，得分为70-79分。4. 论文结构基本规范，内容未经认真整理，一般性罗列所检索的文献资料。得分为60-69分。5. 达不到上述第4点要求的论文，得分为0-59分。任课教师签字： 日期： 年 月 日长春碱的提纯及其衍生物合成研究进展学生：孙贵救 （教师：肖繁花）（上海应用技术大学化学与环境工程学院）摘 要：利用溶剂法提取长春碱,并通过柱色谱法进一步纯化长春碱,采用正交试验法优化其工艺,通过紫外分光光度法检测其相对含量,结果显示利用溶剂法提取的长春花生物碱含量高,效果好。关键词：长春碱；提取；纯化；柱色谱法Studies on the extraction purification and derivatives synthesis of VinblastineStudent: Sun GuiJiu（Faculty Adviser: Xiao FanHua）（Department of Chemistry and Chemical Engineering ,Shanghai institude of Technology University）Abstract : Clethodim is a kind of new dry postemergence herbicides, Vinblastine was extracted from atharanthus roseus and further purified by olumnhrom atography.Orthogonal test was employed to optimize the extraction process.The content of vinblastine in the extraction was determined with ultraviolet spectrophotometry,The results show that solvent method is efficient,the content of extracting vinblastine from atharanthus roseus is high and the effect is good.Keywords : vinblastine;extraction;purification;olumnhromatography1前言长春花又名雁来红、日日新、四时春、三万花，是夹竹桃科植物长春花的全草，长春碱(vinblastine)是从长春花中提取的一种二聚吲哚类生物碱。长春碱,可用于抗癌、降压,尤其是其抗癌作用受到人们的重视并应用于临床。长春碱与醛基长春碱等,能够降低脱氧核糖核酸(DNA)与核糖核酸(RNA)及蛋白质的合成,抑制癌细胞的有丝分裂,使细胞分裂停止在中期,因而肿瘤细胞不能增值。长春碱在长春花中的含量约为万分之四,可用于治疗白血病、何杰金氏病、淋巴肉瘤,对乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、单核细胞白血病均有一定疗效。对网状细胞肉瘤、肾母细胞瘤、恶性黑色素瘤也有效,并被若干国家药典所收载。长春碱类抗肿瘤药物属于双吲哚类生物碱,即由吲哚(上半部分的长春质碱环)和双氢吲哚(下半部分的文多灵环)通过C15-C18连接构成。均含有3个叔胺基、1个仲胺基,呈弱碱性。它们都易溶于氯仿、乙醇等有机溶剂,不溶于水;药用为水溶性硫酸盐。本文利用溶剂法提取长春碱,并通过柱色谱法进一步纯化长春碱。除此之外，自证实此类化合物具有抗肿瘤活性1以来，现已正式用于临床的有长春碱（vinblastine）、长春新碱（vincristine）、长春地辛（vindesine）及长春瑞宾（vinorelbine）。处于临床研究的还有长春氟宁（vinflunine）、长春甘酯（vinglycinate）及脱水长春碱（anhy-drovinblastine）。2 抗肿瘤机制长春碱具有抗肿瘤作用,主要用于何杰金氏病、绒毛膜癌(对氨甲蝶呤已产生抗药者,则需用较大剂量);此外,对淋巴肉瘤、蕈样霉菌病(Mycosis fungoides)、白血病、横纹肌软骨瘤、黑色素瘤、精母细胞瘤、畸胎瘤、星形细胞瘤、肉织细胞肉瘤、癌(胸、肺、口腔、胃、结肠、直肠、卵巢、颈部、子宫、膀胱、肾等部位)等的抗肿瘤作用还需进一步肯定。疗效出现较快,用药后3d内肿瘤明显缩小或发热消退,但缓解期较短,有的在用维持量或停药后23周又趋复发。对实验性肿瘤的作用如下:对DBA/2小鼠的移植性淋巴细胞白血病P-1534有显著治疗效果,可以延长小鼠的生存时间,但很少获“治愈”。对DBA/1小鼠乳房肿瘤有明显抑制作用。在临床上对乳腺癌有一定的治疗效果。长春碱对小鼠白血病L1210、小鼠移植性淋巴细胞白血病P-1534、AKP-白血病、大鼠W258、IRC741/1398白血病、小鼠肉瘤S180、艾氏腹水癌和移植性及自发性乳腺癌都有实验治疗作用,并可防止AKP小鼠的自发性白血病,能使患IRC741白血病的Fisher大鼠血流中存在的瘤细胞迅速消失。长春碱的作用机制与秋水仙碱相似,能抑制肿瘤细胞如艾氏腹水癌、腹水癌L1210和人的单核细胞性白血病以及正常动物骨髓细胞的有丝分裂,使停止于中期。长春碱能干扰微管蛋白的合成,从而阻止微管蛋白装配成有功能的纺锤丝。与秋水仙碱不同之处为该抑制作用较强,且可被谷氨酸和色氨酸所对抗。早期的体外实验未能证明长春碱于治疗浓度下对DNA和RNA的合成有明显影响,但后来的体内实验发现艾氏腹水癌小鼠给长春碱(2mg/kg)一剂,即能减少3H-尿嘧啶核苷掺入癌细胞的RNA。体外实验如果药物与艾氏腹水癌细胞一起较长时间(1h)温育后,3H-尿嘧啶核苷掺入RNA亦显著被抑制,于210-4M 即产生明显抑制,且被大剂量谷氨酸所对抗。对大鼠瓦克肉瘤,长春碱能明显抑制3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入DNA,对瘤细胞核仁的DNA合成的抑制作用比非核仁的DNA要强。近有报道长春碱能抑制艾氏腹水癌细胞的DNA依赖性RNA聚合酶，总的来说，研究表明长春碱类药物可干扰细胞周期的有丝分裂阶段（M期），从而抑制细胞的分裂和增殖。其细胞毒性是通过与微管蛋白的结合实现的，它们在微管蛋白二聚体上有共同的结合位点，可抑制微管聚合，妨碍纺锤体微管的形成，从而使分裂于中期停止，阻止癌细胞分裂增殖23 长春碱的提取及纯化3.1 长春碱的提取法长春碱的提取方法主要有生物技术提取法，超临界流体萃取法，溶剂提取法这三种，提取方式的优劣各有不同。3.1.1生物技术提取法目前主要从天然植物中提取长春碱，但它们在植物中的含量极低，而化学合成法和半合成法的制备效果也不太理想。为了更有效地生产长春花生物碱，科学工作者正致力于将生物技术应用于长春花的研究与开发。组织培养：张秀省等3以长春花叶和子房诱导的愈伤组织为材料，进一步通过化学诱变得到2种变异细胞株，并对4种不同愈伤组织的生长以及吲哚生物总碱、阿玛碱、长春质碱的生物含量进行了分析比较，期望为今后长春花细胞工业化生产药物的开发提供比较理想的细胞株。细胞工程：用不同质量浓度的乙烯利、乙酰水杨酸、色氨酸溶液分别处理温室盆栽长春花植株，于2d后测定叶片中的总吲哚生物碱含量，并采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定长春质碱的含量，结果发现经处理后植株中成分的含量有明显提高，并确定了最合适的处理质量浓度4。发酵工程：通过对长春花叶内生真菌进行分离，筛选出1株无孢菌群菌株，并对其发酵提取物进行薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱（HPLC）法分析，结果表明此菌株能够产生VCR5真菌易于培养，可以通过育种手段和控制培养条件等措施来大幅度提高其有效成分的含量，便于组织工业化生产。遗传转化工程：遗传转化系指利用重组DNA、组织培养或种质系统转化等技术将外源基因导入植物细胞或组织中获得转基因植物的技术。孙敏等6用发根农杆菌感染长春花，诱导出毛状根，通过离体培养、株系筛选，提取出了长春碱，为长春花生物碱的工业化生产和产业化开发奠定了基础，同时也为应用转化毛状根技术获得药用植物次生代谢产物开辟了一条新的有效途径。随着培养技术的改进和合理反应器的设计，以及控制 长春碱、文多灵合成的关键酶基因克隆出来并转化成功，寻求高产的长春花植株或细胞株一定会成为现实。化学诱变：用不同质量浓度的甲基磺酸乙酯（EMS）处理长春花愈伤组织， 挑选成活愈伤组织块继代扩大培养。结果发现，用EMS处理的长春花愈伤组织发生了突变，与对照组相比，不仅生长快，而且总吲哚生物碱含量高7化学诱变是人工获取突变体常用的手段之一，EMS又是较常用的化学诱变剂，可筛选高产吲哚生物碱的稳定细胞系， 并利用细胞工程技术获取药用成分。 它有可能成为一种理想的方法。3.1.2 超临界流体萃取法这方面的研究较少。Stahl等8初步研究了长春碱的超临界流体萃取，结果表明在压力为80-200bar（8-20Mpa）、提取温度40下的萃取效果不佳，N2O萃取效果比CO2稍好。Choi等9研究表明，CO2-甲醇-三乙胺（80:18:2）超临界萃取能有效地提取长春花草中的长春碱。在80、34Mpa下的萃取率是甲醇萃取的76.4%，而不加夹带剂或改变其它夹带剂的条件下萃取率不及甲醇萃取的25%。超临界萃取无毒、无污染，萃取时间短、能耗低，但需要高压设备，成本较高，进行大规模原料萃取的生产条件还不成熟。3.1.3 溶剂提取法醇类溶剂提取法：Kalman10等和Javanovics11将全草用氨水浸润后再用甲苯提取，但此法会使生药中的一些中、强生物碱以游离形式被提取出来，导致纯化难度加大。随后改为含水甲醇浸提，再用硫酸酸化，所得生物碱含量比碱水浸取高30-40倍。利用甲醇使得成本降低，也减少了提取步骤，但甲醇极性较大，因此其选择性不够理想。醇提取液中含有生物碱及其盐，尚含大量脂溶性杂质，且稀醇提取液含水溶性杂质，尚需进一步处理。亲脂性有机溶剂提取法：由于大多数游离生物碱极性低，可用氯仿、二氯甲烷苯等提取。为了只提取药材中的弱碱性生物碱，可采用水甚至稀有机酸水代替碱水润湿药材，再用有机溶剂提取。长春碱在总生物碱中含量极微，若提出总生物碱后再行分离，不仅操作烦琐，而且得率极低，故生产上采用药粉用水湿润后用苯提取，使大部分碱性较强的生物碱未被提出，这样有利于进一步纯化12。酸水提取法：常用0.5%-1%的乙酸、硫酸、酒石酸等为溶剂。此法提取所得溶液体积较大，浓缩困难，故可配合离子交换树脂法或有机溶剂萃取法进行处理。Gedeon13等用含少量硫酸的90%的甲醇提取全草，因其等成分可转化为盐，更易被甲醇提出，提取率也有所增加。Gunasekera14等将甲醇改为乙酸水溶液提取，再用氨水碱化，最后用二氯甲烷萃取。该法提取率高、步骤简单、有机溶剂用量少，增加了操作安全性，利于环保，但提取物中杂质较多，需有成熟的柱色谱方法配合，方可得到高纯度产品。酸提液中含有树脂、 叶绿素等杂质，若碱化后直接用氯仿、二氯甲烷等萃取，易形成乳化层，使VLB(不易被萃取完全；若先用石油醚脱脂，然后碱化再萃取，则乳化现象将大为改观。长春生物碱对光和热不稳定， 在提取和储存过程中注意避光与避热。3.2 长春碱的纯化长春碱的主要纯化方法为柱色谱法。3.2.1柱色谱法纯化法一次过柱：长春碱的柱色谱纯化一般是过一次碱性氧化柱，除去极性较低的碳氢化合物及部分中性、酸性物质。氧化铝用前要经过100-150活化处理，降低含水量，提高活性；但活性也不宜太高，否则产品不易洗脱。所以一般选择的氧化铝活性为IV级，含水量为6%-10%。由于长春碱是中极性物质，流动相的极性不宜太高，一般用苯-石油醚15苯-氯仿16、苯-二氯甲烷、二氯甲烷-氯仿、乙酸乙酯-石油醚等以不同的比例梯度洗脱。洗脱液中依序主要含有长春碱，长春次碱和2的混合物，2。利用碱性氧化铝柱一般可以从碳氢化合物中除去含氧化合物，能完全将仅相差一个基团的长春碱和2分开，但是长春碱难以和异常春碱等一些杂质分离17，此方法目前大规模生产，缺点是产品的纯度不够。两次过柱：一次氧化铝柱色谱往往不能得到较高纯度的长春碱，如作为注射剂或者用以制备近年来开发成功的抗癌作用更强的药品-长春瑞滨的原料，则均需纯度95%的长春碱硫酸盐。Gunasekera14等采用两次过柱的方法，将粗提的总生物碱粗品4.6g先经过羟丙基交联葡聚糖凝胶Sephadex LH20柱，二氯甲烷-甲醇或氯仿-甲醇作流动相，分段收集馏分，含长春碱部分合并浓缩，然后过二次硅胶柱进一步纯化，硅胶需经去活处理，用1%-10%甲醇-氯仿梯度洗脱，含长春碱部分蒸除溶剂，在无水乙醇中结晶，得到含量较高的长春碱硫酸盐。这种方法第一次过柱时所用的固定相价格较贵，且多次使用会造成不可逆吸附，分离效果变差。所以尽量减少污染凝胶。如果能处理好凝胶的再生和保护问题，经济上也可以，将是一个很好的获得高纯度的长春碱的活化方法。多次过柱：Atta-ur-rahman18等经过3次过柱纯化得到高纯度长春碱，粗提取的总生物碱先过氧化铝柱，再过硅胶柱，用制备型HPLC分离，军用乙酸乙酯-石油醚梯度洗脱，得到最终产物。4 长春碱衍生物的合成研究自1958年加拿大人Noble和Beer19，20等首次分离得到了长春碱至今，由于长春碱类化合物具有的光谱抗癌活性，使得世界各国都热衷于研究该类化合物的合成和其各种衍生物的合成，以从中筛选到疗效更好、毒副作用更低的新型药物。到目前为止，据已公开的资料统计，人们合成的长春碱类衍生物有数百个之多。而在这其中，已经成为临床抗癌药物的有：长春地辛（vindesine）、长春瑞滨（vinorelbine）和长春氟宁（vinflunine）4.1 长春地辛的合成1978年，美国Eli Lilly and Company的Gerzon等人对长春碱的C-3位处的甲酯基进行了修饰，通过氨解或肼解、还原的方法，得到了长春地辛，并对其药理活性进行了研究，发现其对急性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病有显著疗效。对小细胞及非小细胞肺癌、乳腺癌也有较好疗效。长春地辛合成步骤如下图所示：NH.3.MeOH Vinblastine VindesineN2H4 MeOH Raney Ni Vindesine124.2 长春瑞滨的合成1979年，法国的Potier等人在其已有的研究基础上，又进一步合成了7-nor-anhydrovinblastine，至1989年，法国Pierre Fabre公司研制成了它的酒石酸盐，取名长春瑞滨。目前主要用于治疗非小细胞肺癌（Non-Small-cell Lung Cancer,NSCLC）。长春瑞滨合成步骤如下图所示：m-CPBA (CF3CO)2O ,CHCl2THF,H2O Vinorelbine 13 4.3长春氟宁的合成研究继1989年法国的Pierre Fabre公司将长春瑞滨上市以后，至1997年，法国的Fahy等人又合成了anhydrovinblastine和长春瑞滨的C20位的亚甲基双氟带衍生物，其中后者的衍生物就是长春氟宁。目前还在进行后期的临床实验，主要用于治疗乳腺癌和除罕见的间皮瘤外的非小细胞癌。5 结论 总之利用长春碱制成的药物已经广泛用于癌症的治疗，但由于神经系统的毒性和局部刺激性较大的限制了其使用，科学工作者应该加快对长春碱进行更深层次的研究、开发和利用，以便制成高效低毒的新剂型，并结合临床实际开发出更好的药剂，更好的服务于皇者。参考文献 Uffelie, O. 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