液质联用法测定粮食作物中黄曲霉毒素研究毕业论文.doc

河南工业大学 2010届毕业论文液质联用法测定粮食作物中黄曲霉毒素研究毕业论文目 录1 引言11.1背景介绍11.1.1黄曲霉毒素的来源和种类11.1.2黄曲霉毒素的危害11.1.3 黄曲霉毒素的结构和理化性质11.1.4黄曲霉毒素的分布31.1.5黄曲霉毒素的防治31.2不同种类的粮食作物中黄曲霉毒素成份的介绍31.2.1大豆31.2.2花生41.2.3小麦41.2.4玉米41.3黄曲霉毒素检测方法51.3.1薄层色谱法(TLC)51.3.2高效液相色谱法(HPLC)61.3.3亲和柱高效液相色谱法(IAG-HPLC)61.3.4酶联免疫吸附测定法(ELISA)71.3.5液相色谱质谱联用技术(LCMS)71.4色谱条件的选择81.4.1流动相的选择81.4.2容量因子的选择81.5本课题研究的意义82 实验92.1实验仪器92.2 试剂与溶液92.3实验方法102.3.1样品前处理102.3.2 色谱条件102.3.3 质谱条件103 结果与讨论103.1 提取液的选择103.2 色谱条件的优化113.2.1 流动相的选择113.2.2 流速的选择113.2.3 进样量的选择123.2.4 色谱柱及柱温的选择123.2.5 方法的灵敏度123.3黄曲霉毒素B1的标准曲线133.4 重复性与检出限143.5样品测定143.6根据质谱图分析黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、 M1、M217结 论21致 谢22参考文献23231 引言1.1背景介绍黄曲霉毒素(aflatoxin,AF)是对人类和动物危害大的真菌毒素之一。黄曲霉毒素污染食品比较严重，尤其是对花生、核桃、玉米及其制品的污染最为严重和普遍。此外，在大豆、稻谷、通心粉、牛奶及其制品、食用油等食品中也经常发现黄曲霉毒素1。1.1.1黄曲霉毒素的来源和种类黄曲霉毒素(aflatoxin,AF)主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物2。AF是一类结构和理化性质相似的真菌次级代谢物，目前已发现有20种之多，已确定结构的有AFB1、AFB2、AFM1等18种，它们的基本结构中都含有二呋喃环和氧杂萘邻酮，前者为其毒性结构，后者可能与其致癌有关3。1.1.2黄曲霉毒素的危害黄曲霉毒素的毒性极强，是目前已发现霉菌毒素中毒性最大的一种。目前发现的18种黄曲霉菌毒素中，黄曲霉菌毒素B1毒性最强，黄曲霉菌毒素B1的毒性比氰化钾大10倍，是砒霜的68倍，诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍。其毒性因动物的种类、年龄、性别和体况以及营养状况的不同有差异，年幼动物、雄性动物较敏感。黄曲霉毒素主要危害动物的肝脏器官，有诱导突变、抑制免疫和致癌的作用，可引起人和动物的急性中毒、慢性中毒和引起癌症。慢性中毒者早期症状表现为食欲不佳、体重减轻、生产性能降低、胴体和蛋壳品质下降，后期出现黄疸、脂肪肝、肝损伤及抑制动物免疫机能和致癌作用4。1.1.3 黄曲霉毒素的结构和理化性质黄曲霉毒素均为二氢呋喃香豆素的衍生物，都含有双呋喃环和氧杂奈邻酮，前者为基本毒性结构，后者与致癌有关。迄今为止，已发现黄曲霉毒素至少包含有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM及毒醇等20种左右结构相似化合物，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1 及M2 是粮食和食品中黄曲霉毒素主要存在形式, 其中黄曲霉毒素B1的毒性和致癌性最强,相对分子质量分别为B1：312、B2：314、G1：328、G2：330、M1：328、M2：330，分子式：B1：C17H12O6、B2：C17H14O6、G1：C17H12O7、G2：C17H14O7、M1：C17H12O7 、M2：C17H14O7，黄曲霉毒素的化学结构式如下图所示： AFB2 AFB1 AFG1 AFG2 AFM1 AFM2黄曲霉毒素难溶于水、己烷、乙醚和石油醚，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙腈和二甲基甲酰胺等有机溶剂，分子量为312346，熔点为200300。黄曲霉毒素对光、热和酸稳定，耐高温，通常加热处理对其破坏很小，只有在熔点温度下才发生分解。黄曲霉毒素遇碱能迅速分解，pH为910时迅速分解成几乎无毒的盐，但此反应可逆，即在酸性条件下有复原。5%的次氯酸钠溶液、Cl2、NH3、H2O2及SO2等均可与黄曲霉毒素起化学反应破坏其毒性。在自然条件下，食品中污染的黄曲霉毒素稳定性很强。1.1.4黄曲霉毒素的分布黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果、特别是花生和核桃中。在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶及奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高，在我国，产生黄曲霉毒素的产毒菌种主要为黄曲霉。1980年从17个省粮食中分离了黄曲霉1660株，广西地区的产毒黄曲霉最多，检出率为58%。华中、华南、华北产毒株多，产毒量也大，东北、西北地区较少。1.1.5黄曲霉毒素的防治黄曲霉毒素的预防可通过推广抗黄曲霉毒素的品种、改良种植技术和收获方法、改良储藏方法、不要将受黄曲霉毒素污染的饲料喂养牲畜和适时应用防霉剂等法。自黄曲霉毒素被发现以来，人们就力图寻找脱毒的方法，迄今为止，已报道或应用的各种处理方法都有一定的局限性，这很大程度上与农产品或食品的特殊属性有关，尽管有些处理方法会影响食品的品质，但由于能有效去毒，挽回部分损失，因而也有一定的应用价值。这些方法包括挑选霉粒法、碾轧加工法、植物油加碱去毒法、加水搓洗法、吸附去毒法、高温高压去毒法、烹调去毒法和碾磨去毒法5。1.2不同种类的粮食作物中黄曲霉毒素成份的介绍1.2.1大豆原料大豆和豆粕在运输、贮藏过程中，若水分、温度控制不当，很容易受到霉菌污染，发生霉变。黄曲霉毒素影响大豆的发芽和根部的生长6。污染大豆的主要霉菌有曲霉、青霉、毛霉、根霉、镰刀霉等20余种，会产生黄曲霉毒素和赭曲霉毒素等7。大豆和豆粕被霉菌及霉菌毒素污染后，引起的危害主要有2个方面：即霉菌引起的食品变质和霉菌产生的毒素引起的中毒，大豆主要的真菌毒素污染是黄曲霉毒素和赭曲霉毒素。黄曲霉毒素主要由黄曲霉菌(Aflavus)和寄生曲霉菌(Aparasiticus)产生，其他如Aspergillus nomius和Aspergillus niger也可以产生，黄曲霉毒素产毒温度为2832，相对湿度为85%以上8。1.2.2花生黄曲霉毒素存在于所有的油料中，但在花生中的污染尤为严重。因此，至少60个国家提出限制食物中黄曲霉毒素的含量9。不同的产地、不同批次的花生及其制品主要的污染物为黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2四种，并且在一些样品中，B1的含量竟然达到了51ppb，食用这些花生及其制品必然会对人体产生极为不利的影响。同时在比较多的样品中都检测到了M1、M2，尽管M1、M2的毒性相对于B1、B2要弱一些，但是由于其在一些样品花生及其制品中竟然达到了4ppb，表明M1、M2可能不仅仅是由B1、B2在体内的代谢转化而成，仅存在于动物乳汁及乳制品中，在花生及其制品长期不良储存条件下或加工过程中，各种产毒霉菌的严重污染也有可能导致M1、M2的产生10。当晚种的花生遇到干旱和高的土壤温度，花生尤其容易受到黄曲霉毒素的污染11。1.2.3小麦我国是一个农业大国，小麦产量居世界第一，但粮食产后在整个流通领域中，时刻发生着量与质的变化，损失严重。仅虫、霉及品质劣变、损耗，每年达数百万吨。小麦是富糖类的粮食，与我国其他主要粮食作物(水稻、玉米)相比，其所含成分是最适合于霉菌生长并产生毒素的基质，我国小麦中的霉菌污染以曲霉为主，曲霉中又以黄曲霉( Aspergillusf lavus)污染最为严重，在相对湿度60%条件下，小麦中黄曲霉的最低生长温度是6.5，最高生长温度是52.7，最适生长温度是31.412。1.2.4玉米虽然黄曲霉毒素在玉米中无处不在，难以避免，但是生产中，玉米霉变程度是可见的，而且是选购中一项重要的评价指标，一般的选购标准为霉变1%以下可以采购，高于1%退货13。环境温度为15时，处于不同水活度中的黄曲霉菌落生长都不旺盛，经过19天培养后，菌落直径不超过40mm。在20与25条件下黄曲霉菌落的生长状况较为相近，在水活度为0.95时分别用11天，5天达到最大生长值分别为50mm和80mm，但水活度低于0.90时，黄曲霉菌落生长仍较缓慢，培养15天时直径大小不超过50mm。环境温度超过30，水分活度高于0.8时，黄曲霉菌落生长都较迅速，高水活度的培养条件下在10天时间里菌丝基本覆盖90mm的培养皿，而水活度低于0.8时生长仍较缓慢。由此可得，菌落直径在一定时间内所达到的最大值随水活度和温度变化而变化，并且在一定范围内呈现出温度越高、相对湿度越高，菌落生长最大值越大的生长趋势。1.3黄曲霉毒素检测方法黄曲霉毒素是最为常见的一类毒素，主要分为B1、B2、G1、G2、M1、M2。在晒干、储存、加工原料花生的过程中，都会引入黄曲霉毒素。毒理学研究表明，黄曲霉毒素能够造成动物精神癫痫而导致死亡。甚至有证据表明：由黄曲霉毒素污染的空气中的灰尘颗粒也有可能导致肺癌的产生。鉴于各种黄曲霉毒素的易引入和比较强烈的毒性，欧盟等相应的机构已经对黄曲霉毒素的含量水平做了严格的规定：在干果中B1不得超过2g/kg，黄曲霉毒素的总量不得超过4g/kg (B1+B2+G1+G2)。因此，研究一种新的高灵敏度、高选择性的同时测定黄曲霉毒素的检测方法，对于食品的安全性检测和食品的质量控制具有十分重要的意义12。AF的检测程序可分为3个步骤：萃取、净化、测定。近几年在这几方面研究都有新的进展。萃取试剂一般为甲醇2水或乙腈2水等；净化方法有薄层法、反相分配柱法、免疫亲和柱法等3。现在应用比较广泛的黄曲霉毒素的检测方法主要有：薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、亲和柱高效液相色谱法(IAGHPLC) 、酶联免疫吸附测定法(ELISA) 和液相色谱质谱联用技术（LCMS）等。1.3.1薄层色谱法(TLC)TLC法是传统的检测AFB1最常用方法，是应用最早、最广的分离、分析技术，曾是我国测定食品及饲料中AFB1的国家标准方法之一，其原理是：样品经提取、浓缩、薄层分离后，在365 nm波长的紫外光照射下，黄曲霉毒素B1、B2产生紫色荧光，G1、G2产生绿色荧光，然后根据其在薄层板上显示的荧光的最低检出来定量。其优点是：所用的试剂、设备简单，费用低廉，容易掌握，适用大量样品的分离、筛选，一般的实验室均可开展，属于定性和半定量的功能。为了提高薄层层析法的精度，还建立薄层扫描等其他的方法来确定黄曲霉毒素，它是薄层层析法的仪器化，样品的处理和层析条件与薄层层析法相同，只是在标准品的设定和结果判定上有所不同。如卢艳杰等介绍了一种简单、微型、低功率的光度检测器用于定量薄层板上的AFT，该装置简单、便宜可代替薄层扫描仪等其他测定AFB含量的设备，最低检测限可达1ng，符合欧洲对AFB规定的限量。卢艳杰等介绍了过压薄层色谱法OPLC结合光度计，成功地对多种食品中的黄曲霉毒素B1、B2 、G1和G2进行测定，同时该方法还适用于样品的提纯和分离，一次可对十个样品进行分析，做到快速、有效、低耗地定量食品中的AFB。该法的局限性与不足之处在于薄层色谱法检测AFB的操作步骤多，样品前处理烦琐，并且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多，因而在展开时影响斑点的荧光度，导致灵敏度下降。灵敏度低、重现差、操作烦琐、时间长且安全性差等缺点，已越来越不适用现代分析的要求14。1.3.2高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法具有高效、快速、准确性好、灵敏度高、重现性好、检测限低等优点，近年来在食品、饲料和中草药材AF测定中得到越来越广泛的应用。样品经提取、净化后，选择适宜的流动相通过高效液相色谱柱，使多种AF同时分离出来，用荧光检测器检测。Akiyama H 以乙腈水 91 提取，Multisep 228 层析柱净化分离香料中四种AF，用HPLC结合荧光进行检测，回收率达 80 %85 %,灵敏度为0.5 ng/g。Blesa J利用C链合硅石为固相分散提取法的吸附剂，以乙腈为洗脱剂，HPLC结合荧光检测器对花生中的4种AF进行测定，回收率为78 %86 %，相对标准偏差是4%7%，检测限范围达0.12g/g2.5ng/g。一直困扰人们的问题是荧光检测器对4种AF分子具有选择性，即对AFB2、AFG2 的灵敏度高 ,而对AFB1、AFG1 的灵敏度很低。因此，通常用两种方法来提高B1和G1的荧光性，一是通过改变流动相或改进检测器来降低物质荧光性的损失，二是对荧光性弱的物质进行柱前或柱后衍生以增强其荧光性。ManettaA C采用了溴化吡啶作为柱后衍生剂，HPLC 结合荧光检测器测定牛奶和奶酪中的AFM1的含量，该方法灵敏度达到1 ng/ kg5ng/kg，在实现快速、自动化的前提下达到精确和准确测定AFM1的含量。1.3.3亲和柱高效液相色谱法(IAG-HPLC)亲和柱高效液相色谱法(IAGHPLC)方法具有快速、高效、灵敏、准确、方便、安全、易于推广等优点，因此是目前最为先进的一种分析方法，国际标准化组织 ISO 已将该法列为国际标准方法。该方法的原理是利用抗原抗体的特异性吸附特性，亲和柱只能特异性、选择性地吸附AF而其他杂质则顺利通过柱子，然后再利用洗脱液将AF洗脱下来。该方法大大简化了样品的前处理过程，同时利用高效液相色谱进行定量和定性，可以同时测出AF的总量和AFM1、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2各自含量。李佐卿等采用IAG-HPLC快速测定牛奶和奶粉中的AFM1、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量。林海丹等也采用该法测定了果仁中AF。1.3.4酶联免疫吸附测定法(ELISA)ELISA法是在免疫学和细胞工程学基础上发展起来的一种微量检测技术。该方法具有快速、灵敏、特异性强、成本低等特点，适合于 AFB 大批样品的检测。ELISA从1995年起已成为AOAC检测AF的检测方法。其原理是将已知抗原吸附在固态载体表面，洗除末吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品（含有抗原）提取液的混合液，竞争培养后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合，再加入酶底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。蔡正森等对ELISA法和HPLC法测定粮油食品中AF含量进行了比较3。1.3.5液相色谱质谱联用技术(LCMS)高效液相色谱法作为基本分析方法在食品工业上应用已经十分广泛，色谱是一种高分辨率的分离技术，基本原理是利用各物质在固定相和流动相之间物理分配性质的差异，使混合物中的多种成分相互分离。质谱法是通过将试样分子裂解为分子离子和各种离子碎片的集合，并按质荷比(mz)大小进行分离、记录其信息的分析方法，是一种灵敏度高、选择性好，具有较强的定性功能的现代仪器。 液相色谱质谱联用技术解决了传统液相检测器灵敏度和选择性不够的缺点，提供了可靠、精确的相对分子质量及结构信息，简化了试验步骤，节省了样品准备时间和分析时间，特别是适合亲水性强、挥发性强的有机物，热不稳定化合物及生物大分子的分离分析，因此是对食品的生产、运输等过程进行质量监控的有效分析手段，在食品工业中一定会得到更加广泛的应用。普通的HPLC结合荧光检测的方法，黄曲霉毒素需要经过衍生化以后才能进行测定，操作繁琐，分析时间长，消耗的溶剂量比较大。普通的HPLCMS/MS分离的效果差，分析花费的时间长，因此，该方法仍然具有比较大的提升空间。近年来，由于超高压液相色谱技术的引进，色谱分析得到了比较大的提高。随着分析效率、分析时间、灵敏度在食品质量控制、毒性分析等方面显得越来越重要，UPLCMS/MS必然扮演着越来越重要的角色12。1.4色谱条件的选择1.4.1流动相的选择在反相色谱体系中，溶剂的极性越低，其洗脱能力越强，溶剂强度越高；反之溶剂极性越强，则洗脱能力越弱，溶剂强度越低。在反相色谱中，水是方向色谱中最弱的洗脱溶剂，随着水的配比的逐渐减少，溶剂的极性逐渐的减少，故溶剂的强度逐渐增加，其洗脱能力也越来越低。1.4.2容量因子的选择对于混合物，分配系数不等是分离的前提。 K1与K2容量因子是衡量色谱柱对某组分保留能力总的平衡常数，分配系数是反映组分与固定相，流动之间的热力学平衡常数，其中Vs/Vm称为相比，是固定相体积与流动相体积之比。容量因子k与保留时间之间有如下关系：k=tR/t0，tR1tR-t0。表示一个组分在固定相中停留的时间（tR1）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，tR10；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。容量因子越大，溶质的保留时间也越长。容量因子减小，分离度得到改善，K2最小时，分离度最好。1.5本课题研究的意义黄曲霉毒素是对人类和动物危害大的真菌毒素之一。黄曲霉毒素污染食品比较严重，许多国家制定了食品中黄曲霉毒素的限量标准，黄曲霉毒素污染问题经常成为国际食品贸易中各国纷争的焦点。因此，许多研究者在不同的领域研究。目前检测真菌毒素的国标方法主要以薄层色谱法、酶联免疫法为主。近年来,气相色谱法、高效液相色谱法已经成为现代仪器分析的应用最为广泛的方法。而色谱质谱联用技术结合了色谱、质谱两者的优点,已经成为仪器分析进展的热点。液相色谱（LC）可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白质、脂肪、多糖及多聚物等）,分析范围广，而且不需衍生化步骤。质谱( MS)作为理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度。本课题采用液质联用的方法测定花生、玉米、大豆等粮食作物中的黄曲霉毒素。近几年发展起来的液相色谱质谱联用技术(HPLCMS)，结合液相色谱对复杂基体化合物的高分离能力和质谱独特的选择性、灵敏度、相对分子质量及结构信息于一体，因此广泛应用于食品、生物、医药、环境等方面，为食品工业中原材料筛选、生产过程中质量控制、成品质量检测等提供了有效的分析手段15。2 实验2.1实验仪器1200LC6310MSD-Trap 系统，美国安捷伦公司出品。ZFI型三用紫外分析仪，上海顾村电光仪器有限公司出品。RE52旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器有限公司出品。FW100高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司出品。SHAC水浴恒温振荡器，金坛市华丰仪器有限公司出品。超声波振荡器、氮气吹干仪、电子天平、万分之一电子分析天平、具塞三角瓶、容量瓶、移液管、烧杯、分液漏斗、漏斗、量筒、烧瓶、离心管、玻璃棒、铁架台等常规器皿。2.2 试剂与溶液正己烷（分析纯），天津市可米欧化学试剂有限公司出品。甲醇（分析纯），洛阳市化学试剂厂出品。甲醇(一级色谱纯)，天津市四友精细化学品有限公司出品。氯化钠（分析纯），洛阳昊华化学试剂有限公司出品。无水硫酸钠（分析纯），洛阳市化学试剂厂出品。C18（25g，SPE0840207），Made in USA。纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司。甲醇（色谱纯），Made in USA。黄曲霉毒素B1标准品（固体），石家庄伟天科学仪器有限公司。样品：市售玉米、小麦、花生、大豆，经FW-100高速万能粉碎机研磨。2.3实验方法2.3.1样品前处理称取粉碎过筛（10目）样品20 g（精确到0.1 g）于250mL的具塞锥形瓶中，加入5g氯化钠和30mL正己烷，摇匀，在25水浴恒温振荡器中振荡30min，经15cm快速定性滤纸将正己烷滤去。每次在滤渣中加30mL正己烷经三次萃取，每次提取条件是在25的恒温振荡器中振荡30min而后将正己烷滤去。取滤渣于250mL的具塞锥形瓶中，准确加入100mL60%甲醇/水溶液（V/V）摇匀，在25水浴恒温振荡器中振荡30min，经15cm快速定性滤纸过滤，在滤液中加入无水硫酸钠干燥，用12.5cm定性滤纸过滤，滤液于100mL烧瓶中，于旋转蒸发器50蒸干。用分析纯甲醇将烧瓶壁上的残渣洗脱。用万分之一电子分析天平准确称取200mg C18，用少量脱脂棉堵住吸水管口，将C18粉装于吸水管中，制成净化柱。用甲醇活化净化柱，再用60%甲醇水溶液（V/V）多次润洗净化柱。溶解液通过净化柱，收集于指形管。将滤液用氮气吹干仪吹干。用1mL色谱纯甲醇润洗指形管。最后用0.45m微孔虑头过滤，LCMSD分析。2.3.2 色谱条件 Agilent C18柱（5m，4.6150mm）；柱温40；流动相：甲醇：水42：58；纯净水。流速：1.0mL/min。进样体积：7L。二极管阵列检测器（DAD），检测波长364nm。2.3.3 质谱条件 电离源：ESI；采用正离子模式，利用保留时间和碎片信号判断定性结果，扫描范围m/z 100-2200；毛细管电压：4574V；毛细管出口压力：197V；雾化器压力：15psi；干燥气流速：10L/min；干燥温度：350。3 结果与讨论3.1 提取液的选择提取黄曲霉毒素B1的溶剂有多种，其中最常用到的有丙酮、氯仿、甲醇、乙醇与水的混合溶液。称取四份样品，分别加入100%的丙酮、氯仿、甲醇、乙醇，结果表明用甲醇提取的效果较好，分离效果较好。本课题拟定利用甲醇-水溶液和正己烷不互溶的特性，同时提取黄曲霉毒素和油脂。3.2 色谱条件的优化3.2.1 流动相的选择根据黄曲霉毒素B1的理化性质和相应的资料，对AFB1进行色谱分离，有机溶剂一般采用乙腈或甲醇。甲醇价格较为便宜，而且对实验人员的伤害较小，本文采用甲醇/水为流动相，以甲醇/水不同配比对保留时间的影响，以此获得最佳的流动相配比。以不同比例的甲醇/水（40/60；42/58；45/55； 50/50；55/45）进行试验，结果见表2-1：由表1可见，随着流动相中水的比例的递减，黄曲霉毒素B1的保留时间也随之减少。所以，随着流动相中水的比例的增加，黄曲霉毒素B1的保留时间逐渐减少。保留时间太短易有杂质干扰，分离效果不好；保留时间太长，分析效率下降，综合考虑甲醇/水（42/58，V/V）定为流动相。表1 不同比例甲醇/水为流动相的试验结果甲醇/水()保留时间(min)40/6013.18842/5810.64945/557.94750/505.19655/453.5653.2.2 流速的选择本文比较了不同的流速对分析结果的影响，以阴性样品加AFB1标准工作液为例，在流速小于0.7mL/min时，虽然分离效果好，但AFB1的保留时间延长，分析效率低；流速大于1.0mL /min，AFB1保留时间减小，但不易于杂质分开；流速在0.71.0 mL/min时，AFB1与杂质有较好的分离效果，并峰高、出峰时间、峰面积综合考虑，最终选1mL /min。3.2.3 进样量的选择 本文考察了进样量1、3、5、7、10、13L时对色谱峰峰形的影响，结果表明进样量为7L时，黄曲霉毒素B1的分离效果及峰形最好，因此选择进样量为7L。3.2.4 色谱柱及柱温的选择根据AFB1的分子结构可知，它属于中等极性的化合物，适合反相色谱分离系统，并根据相关资料，本文采用Agilent C18柱（5m，4.6150mm）色谱柱可以得到满意的分离结果。柱温是一个重要的色谱操作参数，它直接影响到分离效能和分析速度。柱温不能高于固定液的最高使用温度，否则会造成固定液大量挥发流失。本论文通过考察柱温对黄曲霉毒素B1的保留时间，容量因子影响，从而确定最佳柱温，结果见表2所示。从表2可见，在试验温度范围内，随着色谱柱温度的升高，组分的容量因子随之增加，保留时间相应的减少。综合考虑，色谱柱温度定为40，k值接近5时两组分分离好，故本论文确定40为最佳柱温进行实验。表2 色谱柱温度实验结果柱温（）保留时间（min）容量因子（k）2016.2009.832513.7858.223012.1307.11359.9075.62409.2005.153.2.5 方法的灵敏度取浓度为139g/mL标准储备液，用纯甲醇稀释，应用所建立的方法进行分析，以AFB1产生3倍噪声信号所需的标准浓度为检出限，本方法检出限为0.0248g/mL（3倍信噪比），检出量0.174ng。3.3黄曲霉毒素B1的标准曲线准确吸取1、2、4、6、8、10L6.619g/mL AFB1标准使用液（相当于6.619、13.238、26.476、39.714、52.952、66.19ng）进样分析，以AFB1标准工作液中AFB1的质量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制的标准曲线，结果见表2-3和图2-4，结果显示AFB1进样质量与色谱峰峰面积呈较好的线性关系，线性回归方程为Y=23.035X+5.2643，相关系数为R2=0.9997表3 AFTB1标准系列测定结果进样量（L）绝对量（ng）峰面积（mAUs）保留时间（min）16.619149.30299.286213.238308.74599.218426.476620.09429.231639.714932.1329.330852.9521229.929.2991066.191518.0079.251从图1中可以看出，进样量与色谱峰面积呈显著的线性关系，随着进样量的增加峰面积的值也相应增大。标准曲线方程为Y=23.035x+5.2642，相关系数为R2=0.99973.4 重复性与检出限将配置好的浓度为6.619g/mL标准品B1进样，进样量为7L，共9次，以测定进样的重复性，DAD1 A检测器，检测波长为364nm，甲醇水为流动相，结果见表4。重复进样9次的标准偏差为0.435ng，RSD为0.947%，该法的重复性很好。其测定值为0.174ng。表4 重复性与检出限AFB1标准品123456789保留时间（min）9.0119.5939.1349.2359.3319.269.0989.2789.235峰面积（mVs）1062.81054.61050.31071.21079.51072.710581063.71052.4测定值（g）45.91045.55445.36746.27546.63546.34045.70245.94945.458相对偏差%（ng）0-0.775-1.1820.7941.5790.936-0.4540.085-0.983平均峰面积（mVs）1062.8平均测定值（ng）45.910标准偏差（ng）0.435RSD（ng）0.947检出限（ng）0.1743.5样品测定准确称量20g（精确到0.1g）受损大豆、无损大豆、小麦、玉米、花生10份，具体所加的溶剂见表5。根据黄曲霉毒素B1标准品的出峰时间，见图2可知黄曲霉毒素的出峰时间大约在9.235min左右，在所测得的样品色谱图中找相近的时间处的峰，10个样品均未测出黄曲霉毒素。表5 样品中黄曲霉毒素B1的测定结果样品有机溶剂比例保留时间(min)峰面积（mv.s)峰高(cm)测量值(ng)样品中含量（g/kg）无损大豆甲醇60%无无无无无玉米甲醇60%无无无无无小麦甲醇60%无无无无无小麦甲醇80%无无无无无小麦甲醇90%无无无无无花生甲醇80%无无无无无受损大豆甲醇60%无无无无无受损大豆甲醇90%无无无无无受损大豆甲醇80%无无无无无受损大豆甲醇70%无无无无无图2 进样量为7L时黄曲霉毒素标准品B1的保留时间从表5中可以看出，样品都没检测出黄曲霉毒素B1，经过分析造成这样结果主要是由于样品前处理实验没有做好，得出有以下几种可能原因：（1）由于正己烷易挥发造成油脂没有除净而残存在旋转蒸发的烧瓶中，致使甲醇萃取不完全。为了解决这个问题重复三次用正己烷萃取油脂，这样就要过滤三次，每次过滤黄曲霉毒素都可能粘在滤纸上造成黄曲霉毒素的损失。（2）由于振荡器的速度过快，少量的样品洒在瓶子外面和粘在瓶盖上，这样造成了黄曲霉毒素损失，后来把速度调慢了些，这样可能使黄曲霉毒素提取不完全，又造成了黄曲霉毒素损失。（3）用漏斗过滤加60%甲醇的速度太慢可能是由于水和有机溶剂混合在一起，再加上有少量油脂存在的缘故，致使在过滤的过程中需要更换滤纸，这样又会使少量的样品残存在滤纸上而造成黄曲霉毒素的损失，为了改进这种现象，我们后来用了抽滤，但抽滤的速度也很慢。（4）旋转蒸发后，用少量有机溶剂萃取的时，会有少量沾在瓶壁上萃取不净，且由于瓶子体积大有机溶剂不能完全倒出，也会造成黄曲霉毒素损失。（5）加入无水硫酸钠干燥时会带走一些有机溶剂且过滤时滤纸上也会有有机溶剂的残留，这些都会造成黄曲霉毒素的损失。本实验本来就是微量检测，虽然黄曲霉毒素在花生、玉米中含量较高，但其含量也是很微量的，所以要求实验的各个步骤都要严谨，而本实验在前处理过程中很多方面无法做到完善，致使实验结果较差。其中未检测到黄曲霉毒素的花生、玉米、小麦、无损大豆的色谱图如下：图3 60%甲醇提取花生的色谱图（甲醇/水为流动相）图4 60%甲醇提取玉米的色谱图（甲醇/水为流动相）图5 60%甲醇提取小麦的色谱图（甲醇/水流动相）图6 60%甲醇提取无损大豆的色谱图（甲醇/水流动相）3.6根据质谱图分析黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、 M1、M2黄曲霉毒素的相对分子质量分别为B1：312、B2：314、G1：328、G2：330、分子式：B1：C17H12O6、B2：C17H14O6、G1：C17H12O7、G2：C17H14O7、M1：C17H12O7、M2：C17H14O7，黄曲霉毒素可以与H、Na、K结合形成不同的有机化合物，两分子的黄曲霉毒素也可以与H、Na、K结合，具体分子量见下表：表6 不同分子式的黄曲霉毒素分子量黄曲霉毒素M+H+M+Na+M+K+2M+H+2M+Na+2M+K+B1313335351625663647B2315337353629651667G1329351367657679695G2331353369661683699M1329351367657679695M2331353369661683699在样品质谱图中查找上表中所给的分子量，看样品的质谱图中是否含有黄曲霉毒素的准分子离子峰，根据这些条件，判断样品中是否含有黄曲霉毒素，质谱图如下：图7 60%甲醇提取玉米中黄曲霉毒素B2（分子量353）的质谱图图7显示，在玉米（60%甲醇）质谱图中，正离子ESI在m/z 353.2处的离子峰可能为黄曲霉毒素B2（分子量353）的准分子离子峰M+K+ 峰，提示该样品中可能含有黄曲霉毒素B2。图8 60%甲醇提取小麦中黄曲霉毒素B2（分子量337）的质谱图图8显示，在小麦（60%甲醇）质谱图中，正离子ESI在m/z 337.2处的离子峰可能为黄曲霉毒素B2（分子量337）的准分子离子峰M+Na+峰，提示该样品中可能含有黄曲霉毒素B2。图9 60%甲醇提取无损大豆中黄曲霉毒素B2分子量（337）的质谱图图9显示，在无损大豆（60%甲醇）质谱图中，正离子ESI在m/z337.2处的离子峰可能为黄曲霉毒素B2（分子量337）的准分子离子峰M+Na+峰，提示该样品中可能含有黄曲霉毒素B2。图10 60%甲醇提取花生中黄曲霉毒素G1或M1（分子量367）的质谱图图10显示，在花生（60%甲醇）质谱图中，正离子ESI在m/z 367.2处的离子峰可能为黄曲霉毒素G1或M1（分子量367）的准分子离子峰M+K+ 峰，提示该样品中可能含有黄曲霉毒素G1或M1。结 论通过对粮食作物样品提取溶剂、振荡时间的分析研究，确定了样品中黄曲霉毒素B1的提取净化方法。采用正己烷同时提取脂溶性成分，在25的水浴恒温振荡器提取30min，共提取三次，再采用甲醇水溶液提取黄曲霉毒素，在25的水浴恒温振荡器提取30min。在实验过程中，特别是在样品的前处理过程中，由于操作和仪器的不准确性，导致样品中的黄曲霉毒素提取不充分，提取量可能低于液质联用法的检出限，造成在实验结果中无黄曲霉毒素的检出。同时由于样品中杂质较多，可能存在有与黄曲霉毒素分子量相同的物质存在造成分析误差。本实验净化的时候用的是C18反向柱，甲醇为洗脱剂，这样只是除去了一些非极性的物质，以免在进样时损坏柱子，而一些极性大的物质被洗脱了出来，结果造成出峰较杂，黄曲霉毒素浓度更小，低于最低检出限而不出峰。本实验一次性处理完所有样品，然后才去进样，结果发现实验结果不理想，但由于时间已经不够了，其正确的做法应该是样品前处理与进样测定同时进行，一边发现问题一边解决。在本方法选择的最佳条件下，黄曲霉毒素B1在6.61966.19g/mL的质量浓度范围内，与其色谱峰面积呈显著线性相关，标准曲线方程为Y=23.035x+5.2642，相关系数为R2=0.9997。重复测定的标准偏差为0.435ng，变异系数为0.947%。在所测得10份样品中，均未测出了黄曲霉毒素，造成这种结果的原因可能是由于前处理有很多误差造成的。本实验主要用质谱来定性，通过样品的质谱图可以了解在样品中还存在黄曲霉B2、G1、G2、M1、M2。从实验中可以看出液质联用的测定方法是一种高效的定性定量方法。致 谢感谢导师韩小贤老师，实验过程中她总是耐心的指导我们的实验操作，解答我们的每个问题。韩老师精益求精，事实就是的研究态度让我受益匪浅，韩老师学识渊博，无论是在理论学习阶段，还是在论