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生物材料检测 一 基本术语 生物材料是生物体的体液 血液 排泄物 尿液 呼出气 毛发和试验动物脏器组织的总称 生物材料检验是研究生物材料中化学物质或其代谢产物或生物化学指标的分析测定方法的科学 生物监测是指定期 有计划 地检测人体生物材料中化学物质或其代谢产物的含量或由它们所导致的无害生物效应水平 以评价人体接触化学物质的程度及对健康的影响 正常值是指正常人 无明显肝 肾及血液系统疾病 无职业有害因素接触史 的生物样品中某种成分的含量或生化指标值 常通过对某地区的正常人抽样调查所得结果进行统计分析 取95 上限值 职业接触只引起升高的时候 或97 5 上下限之间值 过高或过低均有一定的危害的时候 生物接触限值是为保护作业人员健康 对生物材料 尿 血 呼出气 中污染物或其代谢产物所规定的最高容许浓度 或某些生物效应指标改变所容许的范围 其值相当于健康工人吸入或接触最高容许浓度的毒物时 生物材料中被测物的水平 二 生物材料检验的意义 为职业中毒诊断和治疗效果观察提供重要的参考指标 为地方病和营养素缺乏病的诊断防治提供依据 亦为制订卫生标准 正常值或生物接触限值提供资料 三 生物材料检验指标及选择 1 生物材料检验指标生物材料检验指标主要有以下三个方面 1 生物材料中化学物质的检验 如尿中Pb Hg Cd Cr Ni V Se As F I 五氯酚 杀虫脒的检验 血中Pb Cr Se Zn Cu Fe Ca Mg的检验 呼出气中苯 甲苯 氯乙烯 三氯乙烯等的检验 2 生物材料中化学物质代谢产物的检验 化学物质进入机体后 在体内被吸收 代谢产生代谢产物 需要对生物材料中某些代谢产物进行检验 如尿中酚 马尿酸 甲基马尿酸 硫撑双乙酸 三氯乙酸的检验 血中25 羟维生素D3 1 25 二羟维生素D3的测定等 3 生物效应指标的检验 化学物质进入机体后 在体内引起某些生化 生理行为或其他方面的改变 可以选择适当的效应指标作为接触有毒物质的检测指标 如铅吸收或铅中毒时 尿中d 氨基乙酰丙酸 d ALA 红细胞中游离原卟啉 FEP 血中锌原卟啉 ZPP 有机磷农药中毒时 全血胆碱酯酶活性降低 2 生物材料检验指标的选择原则 以化学物质的代谢动力学和监测目的为基础 根据其在体内的吸收 分布 代谢和排泄情况选择指标 要求所选择的指标有一定的特异性和灵敏度 与接触剂量有较好的相关关系 四 生物材料检验结果的判定 目前多采用与正常值或生物接触限值相比较进行判定 由于受地理条件 环境污染情况及不同测定方法结果间差异等因素的影响 同一成分的正常值可因地区 方法的不同而不同 因此 在选用正常值时 应注意所采用的测定方法和地区差异 某些成分的含量除受职业接触的影响外 还与受检者的年龄 性别 生理状态 饮食和用药情况等因素有关 判定结果时应加以注意 五 生物样品的收集和保存 生物样品的采集和保存是整个生物材料检验的重要操作步骤 必须注意选择适当的生物样品种类和采样时间 使生物材料检验的结果能反映真实情况 采用正确的采样和保存方法 防止样品在采样 运输及保存过程中变质 受污染 待测成分损失 保证测定结果准确可靠 1 样品的种类 生物样品的种类较多 尿液 血液 呼出气 胃液 胆汁 汗液 唾液 乳汁 粪便 毛发 指甲 骨以及动物脏器组织等均可作为不同检验目的的样品 在选择生物材料的种类时 要求 1 选用的生物材料中被测物的浓度与环境接触水平 或与健康效应有剂量反应关系 2 样品和待测成分 指标 足够稳定以便于运输和保存 3 采集生物样品对人体无损害 能为受检者所接受 目前用得最多的生物材料是尿液 其次是血液和呼出气 头发生长非常缓慢 所采集的样品实际上是不同时期的混合样 因此 其测定值与接触剂量的关系无法确定 这就失去了作为生物监测样品的意义 主要用作代谢极慢金属的定性检验 2 样品的采集和保存 1 采样时间 在很多情况下 生物材料中待测物的浓度会随时间的伸延而变化 变化的快慢与物质在体内的代谢过程有关 半衰期短 几分钟 几小时 的待测物在各种组织中的水平变化很快 因此对采用时间有严格规定 半衰期长 几十小时以上 的毒物或代谢产物 它们在各种组织中的浓度反映较长时间的接触程度 所以对采样时间的限制就不必太严格 班前 进入工作岗位前1h班中 开始工作后2h至下班前1h班末 下班前1h之内班后 下班后1h之内 2 采样环境 采样时 工人应离开生产岗位 脱去工作服 洗净手 脸及取样部位 在清洁 无污染的场所取样 3 采样用的容器 根据待测成分 样品种类及保存条件选择容器 对无机金属化合物 可选用高压聚乙烯 聚丙烯 聚四氟乙烯 石英 硬质玻璃等材料制成的容器 在采样前 将容器用酸液浸泡24h 洗净晾干 如测定有机化合物 采样用的容器应选用玻璃或聚乙烯制品 避免使用橡胶和添加有染料的制品 4 样品的保存 采得的样品应尽快分析测定 在样品贮存及运输时 除要防止样品变质 不引进干扰物质外 还要避免样品中待测物质的挥发和在容器上吸留损失 样品的保存方法要与分析方法相配合 尿样一般在4 下可保存2周 在 20 下一般至少可保存2月 所有样品最好是在冷藏条件下运输及保存 注意需要冷冻保存的样品 不宜用玻璃瓶盛装 以免冻裂 5 采样记录 采样后应立即填写采样记录 填写的项目应包括 样品的编号 受试者的姓名 性别 年龄 工种 职业史 个人生活习惯饮食 饮酒 吸烟等 采样时间 地点 环境 方法 采样人等 同时在样品瓶是贴上标签 六 常见检验样品 一 尿样 多数物质及其代谢产物在尿中的含量与其在血中的浓度有较好的相关 尿中的含量可以较好的反映血液中物质及其代谢产物的浓度 尿样收集比较方便 因此 常采用尿液进行检验 为使收集的尿样具有代表性 使分析结果能较好地反映实际情况 用尿液作为生物监测样品时须注意以下几点 1 尿样的收集 1 某些物质随尿液排出无规律性 一日间不同时间尿中排出的量波动较大 在实际工作中 可根据测定目的 要求和条件 收集随机尿样 晨尿或全天 24小时 尿样进行分析 l随机尿样 收取方便 但由于尿中待测物的浓度波动较大 分析结果往往不能反映实际情况 l24小时尿样 收集全天24小时尿液混匀后 取适量进行分析 计算时以24小时排出某成分的总量计 故所得结果不受某些成分排出无规律的影响 也不受饮水和排汗的影响 但收集24小时尿样较麻烦 在夏天尿样易腐败 l晨尿 收集受检者早晨起床后的第一次尿样进行分析 对多数测定能反映实际情况 收集方便 应用最多 2 某些有毒有害物质的排泄速度快 当停止接触后 尿中被检物质的含量显著降低 欲了解机体接触该物质的情况 宜在工作班前 班中 班末或班后分别留取尿样进行分析 2 尿样的保存 通常将随机一次尿样或晨尿收集于清洗干净的500m1硬质玻璃瓶或聚乙烯塑料瓶中 24小时尿样收集于清洁的2L硬质玻璃瓶中 尿样的保存应根据测定项目选择条件 若测定金属元素如铅 汞等的尿样 可在1L尿样中加入5ml硝酸 以防腐 防止金属盐类沉淀 汞挥发及容器壁吸附 收集尿样后如不能及时分析 应将尿样贮于冰箱内 并根据需要加入适当试剂以增加待测成分的稳定性 3 测定结果的校正 尿中待测成分的测定结果一般以mg L表示 但这种结果表示方法易受排尿量的影响 排尿量又与饮水量和排汗量有关 为了减少饮水量和排汗量的影响 使一次尿样和24小时尿样的结果较接近 需对测定结果进行校正 校正方法有比重校正法和肌酐校正法两种 1 比重校正法 将尿中被测物浓度校正为标准比重 我国规定尿样的标准比重为1 020 下的浓度 校正公式为 式中C校 经校正后尿中待测成分的浓度 mg L C 测得的尿中待测成分的浓度 mg L 1 020 为我国采用的尿的标准比重 d 实际测得的尿样比重 K 校正尿比重到1 020的系数 2 肌酐校正法 在一般情况下饮食 饮水量和利尿剂对肌酐的排出率没有太大影响 健康人一天排尿所排出的肌酐量变化很小 一般在1 8g左右 因此 可用经尿液排出1g肌酐所相应的待测成分的量来表示尿中待测物的浓度或经尿液排出1 8g肌酐所相应的待测成分的量来代表全天尿中待测成分的含量 校正公式为 二 血液1 血作为生物检测样品 毒物无论从何种途径进入机体内 都要被吸收入血液 然后分布全身各器官或被解毒代谢 或排出体外 检测血液中毒物或其代谢产物的浓度可反映机体接触该毒物的程度 并与体内毒物吸收的量呈正相关 血样有待测成分的含量较稳定 个体差异小 取样污染机会少 不受肾功能影响等优点 因此 测定血液中毒物或代谢产物的含量更有意义 但静脉取血手续烦琐 受检者不易接受 在实际工作中 血样不如尿样应用普遍 近年来 随着分析技术的不断发展 方法灵敏度的提高 减少了血样的用量 以耳垂取血代替静脉取血 既易为受检者所接受 也给采血工作带来了方便 2 血样的采集和采样注意事项 血样可用全血 血浆或血清 全血 用注射器或取血管采集血液注入有抗凝剂的试管中 轻轻转动使血液与抗凝剂充分混匀 血浆和红细胞 将血液缓慢注入有抗凝剂的试管中 室温下放置或离心 分离后的上清液即为血浆 沉淀的红色部分为红细胞 血清 将血液缓慢注入干燥试管中 室温下放置15 30min 离心 分离后的上清液即为血清 在采集静脉血时要避免污染 防止溶血 对采血部位的皮肤应先用水洗净 采集末梢血时 不得用力挤压采血部位 要尽量让其自然流出 并弃去第一滴血 避免因组织液渗出将血液稀释 三 呼出气1 呼出气作为生物检测样品 挥发性毒物经呼吸道进人机体后 在肺泡气与肺部血液之间达到血气两相平衡 即挥发性物质在肺泡气相的分压和在肺末端毛细血管血液中的分压是相等的 因此 对呼出气或肺泡气中挥发性物质进行分析 可反映人体的摄入水平和环境空气中的水平 呼出气作为评价接触挥发性化学物质的生物监测样品 其优点是样品收集方便 可以连续采样 样品中干扰物质少 易为受试者所接受 呼出气样品有混合呼出气和终末呼出气两种 尽力吸气后用最大力量呼气至不能再呼气为止所呼出的全部呼出气为混合呼出气 先尽力吸气 在平和呼气后 再尽力呼气至不能呼气为止的最后一段呼出气为终末呼出气 2 样品的采集 1 采样袋或注射器直接采样法 操作简便 适用于高含量样品 所采样品不便保存 2 活性炭吸附管在低温下吸附采样法 采样过程中待测物质被吸附而浓集在活性炭上 适用于较低含量样品 所采样品可以保存1周 3 采集呼出气时注意事项 1 所用的采样器对被测物的吸附小 在室温下的密封性好 2 从挥发性物质的呼吸排出曲线可以看出 在停止接触后 呼出气中物质的量 肺排泄率 与脱离接触后的时间呈指数关系 也就是初始肺排泄率很高 随脱离接触后时间的延长而迅速下降 因此应在接触期间或接触后短期内采样 七生物样品的预处理 生物样品的成分复杂 在分析前需对样品进行适当的预处理 以除去杂质 浓集待测成分 分离或消除干扰物质 在测定金属和非金属成分时 需将样品经过无机化处理 使其中的有机物完全破坏 待测成分转变成为某一价态 当待测成分与干扰成分共存时 或待测成分的含量较低时 需通过溶剂萃取 挥发和蒸馏 共沉淀或采取固相萃取等方法将待测成分与干扰物质相分离 达到分离 净化和浓缩的目的 一 无机化方法 破坏生物样品中有机物的方法有湿消化法和干灰化法 可根据样品及待测元素的性质选用 1 湿消化法 用强氧化性酸和其他氧化剂 结合加热 使样品中所有有机物破坏 待测成分变成易溶的盐类 常用的氧化性酸有硝酸 硫酸和高氯酸 氧化剂有高锰酸钾和过氧化氢等 1 硝酸 高氯酸法 氧化能力强 反应速度快 消化温度低 挥发损失小 由于硝酸和高氯酸的沸点均较低 过量的酸液容易挥发除去 2 硝酸 高氯酸 盐酸法 本法用于示波极谱法测定尿中铅镉等元素的测定 加入盐酸的目的是与锡生成氯化物蒸发除去 消除锡对极谱测定的干扰 3 硝酸 高氯酸 硫酸法 是应用最广泛的一种有机物破坏方法 适用于除挥发性元素外的金属毒物测定时 各种生物样品的处理 加入硫酸后 可适当地提高消化温度 充分发挥硝酸和高氯酸的氧化作用 防止烧干 1 硫酸 高锰酸钾法 利用高锰酸钾 硫酸在低温下氧化尿中有机物 再用盐酸羟胺或过氧化氢将过量的高锰酸钾褪色 此法专用于分析尿汞时样品的消化 2 干灰化法 干灰化法操作简便 加入试剂少 空白值低 特别适用于大批样品的处理 但干灰化法使用的温度高 待测成分易挥发损失 同时待测成分被坩埚材料吸留 难于溶出 使回收率降低 为了帮助灰化 降低待测成分的挥发和吸留损失 可加入适当的助灰化剂 如硝酸 硫酸 硝酸镁和氧化镁 氢氧化钾等 二 分离方法1 溶剂萃取法 利用待测成分或待测成分与螯合剂形成的螯合物在两种互不相溶的溶剂中溶解度不同 也即是在两相问的分配系数不同 通过萃取使待测成分 或螯合物 进入有机相 干扰成分仍留在水相 而达到分离 净化和浓缩目的 该法所需设备简单 应用十分广泛 但该法需使用的有机溶剂易挥发 易燃 有毒 对操作者的健康有一定影响 2 挥发法和蒸馏法 这是一类利用物质的挥发性来进行分离分析的方法 1 扩散法 在塑料扩散小盒盒底外层的一边加样品 另一边加释放剂 内层加吸收液 然后加盖 旋转摇动小盒 使外层液体接触混匀 置小盒于30 扩散数小时 取吸收液作分析 此法可用于尿氟的测定 2 静式顶空分析法 将样品装入带密封盖的小瓶中 立即盖严 将小瓶置加热器内于60 80 下保温一定时间 使瓶中气液两相达到平衡 再用注射器抽取瓶中气体注入气相色谱仪进行测定 此法比较简便 干扰少 适合于生物样品中挥发性有机物的分析 3 动式顶空法 取少量样品放在一个密闭的容器中 适当加热并向液体中连续吹人氮气 将易挥发性的成分吹出带入另一个盛有吸收液的吸收管中 或在冷阱中冷凝下来 然后进行分析 此法对样品中待测成分的分离较彻底 并有一定的富集作用 4 氢化物发生法 在酸性条件下 待测成分被新生态氢 可由锌粒或硼氢化钠与酸反应产生 还原生成气体氢化物 将氢化物用吸收液吸收显色后分光光度法测定 或直接导入原子化器中原子化进行原子吸收分光光度测定 此法可以去除大量干扰物质 已广泛用于锗 锡 铅 砷 锑 铋 硒和碲等元素的分离分析 1 蒸馏法 通过加热蒸馏或水蒸气蒸馏 使样品中的挥发性物质随水蒸气一起被带出来 收集一定的馏出液进行分析 3 固相萃取法 solidphaseextraction SPE 是一类基于液相色谱分离原理的样品制备技术 当样品溶液通过预先填充有吸着剂的小柱时 待测成分被吸着剂截留 经适当的溶剂洗涤除去可能吸附的样品基体 然后用一种选择性的溶剂将待测成分洗脱 达到分离 净化和浓缩的目的 这类方法简便快速有效 使用有机溶剂少 在痕量分析中得到了广泛应用 1 吸附SPE 此法是根据待测成分和样品基体在吸附剂上的吸附能力不同进行分离的 常用的固体吸附剂有硅胶 氧化铝 活性炭 硅镁吸附剂及聚苯乙烯树脂 2 分配SPE 是根据物质在两种互不相溶的溶剂间分配系数不同来实现分离 将适当的液体涂渍或键合到载体上制成固相材料 目前使用最多的是硅胶键合材料 如C18键合硅胶 C8键合硅胶 氰基丙基键合硅胶及氨基键合硅胶等 3 离子交换SPE 是利用不溶的固体离子交换剂与溶液中带相同电荷离子间的交换势不同来进行分离的 4 凝胶过滤SPE 凝胶是高分子物质的溶液在一定条件下形成的半固体胨状物 它具有多孔性的网状结构 分子大小不同物质的溶液通过凝胶时 大分子物质被排阻 流出速度快 而小分子物质自由扩散于凝胶颗粒的孔穴中 流出速度慢 6 螯合SPE 通过反应将螯合剂偶联到载体上制成螯合离子交换剂 如用巯基乙酸对棉花纤维素的羟基进行多相酯化反应 而将巯基连接在纤维素分子上制成巯基棉 利用巯基与不同离子形成螯合物的稳定性差异 可以用于Se As Hg Sn Cu Pb Cd Co Ni等离子的分离和富集 巯基棉的制备简单 操作方便 富集元素多 富集倍数大 吸附解析性能好 通过控制溶液的酸度或pH 可有很好的选择性 6 亲和色谱法 将对待测成分特异的抗体偶联到载体上制成亲和材料 当样品溶液通过亲和材料时 待测成分与抗体发生特异性反应被截留 与杂质相分离 然后用适当的溶剂洗脱待测成分 此法的特异性高 净化和浓缩效果好 三 制备分析样液 1 稀释 以适当溶液稀释样品后直接测定 它主要用于液体样品 也可用于固体样品 本法的特点是不需进行化学处理 大大简化了分析流程 减小了沾污危险 基体干扰严重 合理的稀释比取决于样品中待测元素的含量 测定方法的检出限以及样品组成的复杂程度 在灵敏度满足分析要求的前提下 可选择较高的稀释比 常用的稀释剂有水 稀酸溶液 含表面活性剂 如曲通x 100 或有机溶剂 如正丁醇 乙酸乙酯 的水溶液 基体改进剂的水溶液 为了减缓基体效应 多用标准加入法定量 例如 血清可用水 1 硝酸 6 正丁醇等稀释后以FAAS法测定其中的金属含量 全血多用含曲通x 100的水溶液稀释 毛发 骨 指甲等可先用四甲基氢氧化铵溶解 再适当稀释后测定 2 提取法 用酸或其他化学试剂直接从样品中提取待测元素 本法的突出优点是简便快速 缺点是有时提取不完全 使用本法时应注意 元素提取效率是否满足分析要求 共存有机物对测定是否有影响 3 加压分解 密闭容器中的湿分解方法 其特点有 1 提高了酸利用率 2 有效防止了易挥发元素的挥发损失 3 降低了试剂空白和减少了沾污危险 4 对样品的粒径要求不严 通常 1mm即可 5 可能分解不完全 6 样品处理量小 通常 0 5g 6 容器密封性有待改进 温度 150 4 微波分解 用微波炉进行样品分解 其特点是 1 处理时间短 2 样品分解完全 3 试剂用量少 4 沾污危险小 微波是指频率为300 300000MHz的电磁波 微波在传送中遇到金属等导体会发生反射作用 遇到绝缘体则主要发生穿透作用 介电物质则位于两者之间 对微波具有吸收 穿透和反射作用 样品 溶剂 水 酸等 或脂肪是吸收微波的介质 微波穿透容器直接辐射到样品和溶剂中 使分子极化 高频辐射又使极化分子快速转动 产生猛烈的摩擦 碰撞 振动和撕裂 从而使温度急剧上升 并不断更新样品与溶液的接触界面 剧烈搅拌溶液 加速了样品的分解破坏 微波溶样的设备由微波炉 溶样器皿及通风 排气防腐等组成 微波炉由磁控管 加热腔体 可旋转的负载盘和控制功率 时间等电子元件组成 操作时切忌放入金属器皿 以免损坏微波炉 也不应在负载很小或空载下使用微波炉 否则微波反射回磁控管使其发热而缩短寿命 必要时可在炉内放一个盛有50 100ml水的烧杯吸收过剩的能量 进行微波溶样时 应通过实验优化所需的时间和功率 分解富含有机物的样品时 可让易氧化的物质先分解后再用微波炉分解 或用小功率递增多步加热的方式分解 以免反应剧烈 5 酶分解 利用酶使样品分解 本法特别适于生物样品 其突出之处是作用条件温和 因而能有效防止挥发损失 他还可维持金属离子的价态 特别适于形态分析 例如将胰蛋白酶 木瓜蛋白酶和枯草蛋白酶的混合物与肉作用 于pH7 8和37 下水解蛋白 可分别测定样品中的Cr IV 和Cr III 枯草杆菌蛋白酶可从蛋白质中释放出与蛋白质结合的化合物而又不完全溶解蛋白质 枯草杆菌蛋白酶可从猪肾中释放出5mg kg水平的黄曲霉毒素 八检验项目示例 根据元素在机体内的含量 可分成宏量元素和微量元素 凡含量为机体总重量1 10000者称为宏量元素 1 10000者为微量元素 根据微量元素在机体中的作用 又可分成必需的 治疗用和有毒的三类 有关微量元素与人体健康关系的研究已成为一个活跃领域 经常进行检验的无机元素有铅 镉 汞 锰 砷 氟 碘 其次为钒 铬 镍 锌 硒等 尿铅和血铅的测定 1 接触机会 铅的工业用途很广 主要用于制造合金 铅管 铅箔 铅板 蓄电池 印刷铸字 X射线和g射线的防护等 铅的氧化物多用于生产油漆 颜料 玻璃 陶釉 防锈剂 橡胶硫化促进剂等 四乙基铅用作汽油防爆剂 接触铅及其化合物的机会多 主要有含铅金属的冶炼 铅矿的开采提炼 造船工业的风割电焊 蓄电池铅网格板 油漆 颜料的制造 印刷铸字 电缆制造等工业 均可长期接触铅及其化合物的粉尘 烟雾或蒸气 在日常生活中接触铅及其化合物的机会亦多 如罐头食品 化妆品 某些药物 釉瓷容器等 城市大气的污染也使接触铅的机会增加 2 毒性 代谢和监测指标 铅及其无机化合物主要以粉尘 烟 蒸气形式经呼吸道进人人体 亦可经消化道吸收 四乙基铅主要以蒸气形式经呼吸道进入人体 也可经皮肤 粘膜及消化道吸收 铅及其无机化合物的毒作用主要是造成神经 造血 消化等系统和肾脏的损害 四乙基铅在肝内转变为三乙基铅 抑制脑中葡萄糖的代谢 导致脑组织缺氧 造成弥漫性脑损伤 吸收的铅进入血液后 有95 与红细胞结合被输送到人体的各部位 一部分蓄积在肝 脑 肾 肌肉及血液中 体内的铅约有75 80 随尿排出 约15 经粪便排出 尿铅可以反映铅从体内排出情况 能间接反映机体吸收铅的量 但由于尿铅排出受许多因素的影响 有时体内虽有大量铅蓄积 尿铅排出量并不高 经驱铅试验才明显增高 因此尿铅是铅中毒的辅助诊断指标 血铅能直接反映近期机体吸收铅的量 与空气铅浓度密切相关 被认为是目前最好的铅接触监测指标 铅对许多酶系统有不利的影响 造成体内物质代谢改变 如接触铅后 尿中d 氨基乙酰丙酸 d ALA 红细胞中游离原卟啉 FEP 和血中锌原卟啉 ZPP 会增多 测定它们的含量 均有助于铅吸收和铅中毒的诊断 3 检验方法 生物材料中铅的测定方法较多 主要有双硫腙比色法 原子吸收光谱法 示波极谱法等 也有用阳极溶出伏安法和电位溶出法 双硫腙比色法是测定尿铅的经典分析方法 该法灵敏度较低 干扰较多 操作复杂费时 而且使用的氰化钾 三氯甲烷等试剂毒性较大 对人体健康有影响 但该法试剂易得 不需要特殊仪器设备 目前仍为基层单位广泛采用 原子吸收光谱法包括萃取 火焰原子吸收光谱法 氢化物发生 原子吸收光谱法和石墨炉原子吸收光谱法 使用萃取 火焰原子吸收光谱法时 样品经过消化后 铅离子与吡咯烷二硫代氨基甲酸铵 APDC 形成配合物 再用甲基异丁酮 MIBK 进行萃取 取有机相测定 氢化物发生 原子吸收光谱法通过生成氢化物将铅与样品机体分离 用电热石英管原子化 该法的灵敏度高 操作简便快速 干扰少 石墨炉原子吸收光谱法的最大优点是灵敏度高 血样 尿样不需消化 经适当稀释或加入基体改进剂后即可测定 示波极谱法灵敏度较高 采用国产示波极谱仪 价格便宜 易于普及 4 双硫腙比色法测定尿铅 1 原理 用硝酸 高氯酸破坏尿中有机物 使铅转变为离子状态 然后在pH8 5 11 0的条件下 让铅离子与双硫腙反应生成红色螯合物 萃取后根据颜色深浅比色定量 2 双硫腙的溶解性 溶剂溶解度 g L 溶液颜色水5x10 6碱性水溶液 20橙黄乙醇0 3蓝绿四氯化碳0 64绿色三氯甲烷17 8蓝绿双硫腙易溶于三氯甲烷等有机溶剂 难溶于水 在碱性条件下双硫腙生成盐而易溶于水 难溶于有机溶剂 利用此性质 可进行萃取液中过量双硫腙的洗除 3 双硫腙易受卤素 高价金属离子 如Fe3 过氧化氢等氧化剂氧化 生成黄色的二苯硫代偕二腙 干扰测定 反应式为 日光 高温会加速此氧化过程 所以双硫腙应避光贮存在阴凉处 双硫腙的氧化产物不能与金属离子配位 也失去了酸性 不能与碱作用生成盐 即不溶于碱性水溶液 易溶于有机溶剂 而双硫腙能溶于碱性水 根据此性质可进行双硫腙的提纯 为了防止消化尿样残渣中高价金属离子及其他氧化性物质氧化双硫腙 应先在消化液中加入盐酸羟胺等还原剂使这些物质还原 4 双硫腙是一种广泛的配位剂 除能与铅配位外 还能与20余种金属离子配位 在测定铅时 应设法避免其它金属离子的干扰 提高方法的选择性 常采用的方法是 加入掩蔽剂 加入氰化钾与Cu2 Ag Au Zn2 Cd2 Hg2 Fe2 Co2 Ni2 等离子生成配位化合物 作掩蔽剂 降低干扰 加入柠檬酸铵与Ca2 Mg2 A13 等离子作用 防止其在碱性条件下生成沉淀吸附Pb2 注意 在加入氰化钾前 应先将溶液调为碱性 以免氰化钾在酸性条件下放出剧毒的氰化氢气体 控制溶液pH 利用金属离子在不同pH下萃取率的差异来分离除去干扰离子 如Ag Hg2 Sn2 Bi3 等离子与双硫腙的配位能力强 在pH 4的条件下也能配位完全 并被三氯甲烷萃取 此时Pb2 不被萃取仍然留在水相 可以通过在酸性条件下预萃取的方法除去干扰 亦可以先在弱碱性溶液中将Pb2 与干扰离子一起萃取入三氯甲烷中 然后用稀硝酸反萃取Pb2 此时Ag Hg2 Sn2 Bi3 等离子仍留在有机相而达到分离的目的 改变离子的价态 低价的T1 和Sn2 离子在弱碱性条件下能与双硫腙配位 但经消化后 T1 和Sn2 被氧化成Tl3 和Sn4 高价的Tl3 和Sn4 离子在弱碱性条件下不与双硫腙配位而避免了干扰 2 比色方法 用双硫腙比色法测定铅时 可用混色法 单色法和回返法 混色法 Pb2 与双硫腙配位后 用三氯甲烷萃取 则Pb2 双硫腙配合物和部分双硫腙被同时萃取入有机相 利用双硫腙铅配合物在510nm波长处有最大吸收 而双硫腙本身在此波长下有最小吸收 可直接在510nm处测定双硫腙铅的吸光度 此法较简便 但各管间双硫腙浓度差异大时会造成比色误差 单色法 利用双硫腙能溶于稀碱的特性 用10g L氰化钾溶液或稀氨水将萃取入三氯甲烷中的双硫腙洗去 使混色中的蓝绿色成分除去 而保留双硫腙铅的红色 目视比色或在510nm波长处测定吸光度 单色法的灵敏度较高 加入双硫腙的量不需严格控制 回返法 双硫腙的三氯甲烷溶液在620nm波长处有最大吸收 而在此波长下双硫腙铅配合物几乎无吸收 可先在620nm测定萃取液中双硫腙的吸光度 然后加无机酸将Pb2 离子反萃取入水相 再在620nm处测定加入无机酸使双硫腙铅配合物解离释放出的双硫腙和原有双硫腙的总吸光度 增加的吸光度系释放出的双硫腙产生 与尿样中铅的含量成正比 5 说明 1 尿样的采集时间不限 但采样时必须避免来自现场环境 工作服及接触部位等的铅尘污染 2 双硫腙的纯度如不够 应进行提纯 方法是 取O 05g双硫腙 溶于三氯甲烷中 如有不溶物应过滤 将溶液转入分液漏斗中 用100m1稀氨水溶液 1 分4次提取双硫腙 合并氨提取液于另一个分液漏斗中 用稀盐酸酸化至有双硫腙沉淀析出 用三氯甲烷萃取2 3次 每次20m1 此时双硫腙进入三氯甲烷层 用蒸馏水洗涤三氯甲烷萃取液2次 弃去洗涤液 加三氯甲烷至100m1 使成为约0 5g L的双硫腙三氯甲烷液 放棕色瓶中 贮于冰箱内 亦可将双硫腙配制成0 5g儿的三氯甲烷贮备液 临用前 取一定体积的双硫腙贮备液与等体积的1 氨水于具塞棕色瓶中振摇 静置分层后 取上层溶液使用 3 三氯甲烷应不合氧化物 检查方法是 取三氯甲烷10m1加新鲜煮沸的水25m1 振摇3min 静置分层后取水溶液10ml 加100g L碘化钾溶液和5g L淀粉溶液各数滴 振摇后应不显蓝色 4 测铅所用试剂 如盐酸羟胺 柠檬酸铵等 应不含干扰金属离子 否则应预先提纯 方法是 取试剂20g 加50ml水溶解 加酚红指示剂2滴 用 1 1 氨水调节pH至8 5 9 0 指示剂由黄色变为红色 用双硫腙三氯甲烷溶液提取 至三氯甲烷层绿色不变为止 再用三氯甲烷洗涤2次 弃去三氯甲烷层 水层加水稀释至100ml 氢化物发生 原子吸收光谱法 1 原理 尿液经硝酸 高氯酸 硫酸消化破坏有机物后 铅以二价离子形式存在 在一定浓度的硫酸和铁氰化钾介质中 以硼氢化钾作还原剂 将铅还原成铅化氢 被氮气流带入电热石英管中原子化 于283 3nm波长处进行原子吸收光谱测定 以标准曲线法定量 2 测定方法 1 样品处理 吸取10ml混匀尿样于锥形瓶中 加入2 5m1硝酸 高氯酸 硫酸 9 9 2 混合消化液 在电热板上加热消化至透明或白色残渣 继续加热至高氯酸分解完全 瓶内出现三氧化硫白烟 取下放冷 用20ml水溶解三角瓶内容物 并定量转入25ml比色管中 加2 5m1100g L铁氰化钾溶液 加水稀释至刻度 混匀备用 2 测定 预热仪器 吸取2 0ml样品溶液或标准溶液于反应瓶中 加30g L硼氢化钾溶液 测定吸光度 3 说明 1 铁氰化钾的作用是提高测定灵敏度 消除干扰 在酸性条件下 直接用硼氢化钾还原 铅化合物产生铅化氢的效率很低 即测得铅的吸收信号极小 加入铁氰化钾 铅的吸收显著提高 铁氰化钾的浓度为2 50g L时 铅的吸收信号最大且不随铁氰化钾浓度的改变而改变 故测定液中铁氰化钾的浓度选用10g L 除铁氰化钾外 重铬酸钾 过氧化氢 过硫酸铵等也可用来增强铅的吸收信号 但灵敏度和抗干扰能力不如铁氰化钾 2 酸度的影响 铅化氢的发生受酸度的影响较大 酸度过大过小 铅的吸收信号均降低 只有当硫酸的浓度为0 8 1 1 时 铅的吸收信号最大且受酸度改变的影响小 为了得到最高灵敏度和可靠的结果 采用硝酸 高氯酸 硫酸消化尿样 并要求在消化完时 将过量的硝酸 高氯酸除去 使消化液定容后的酸度恰为发生铅化氢的最佳酸度 3 硼氢化钾浓度的影响 硼氢化钾浓度较低时 随着其浓度的增加 铅的吸收信号增大 当硼氢化钾的浓度为30 50g L时 铅的吸收信号最大且恒定 故采用30g L硼氢化钾溶液 4 方法灵敏度 检出限和线性范围 在分析条件下 1 吸收灵敏度为0 13ng ml 0 26ng 检出限为0 22ng ml 0 44ng 标准曲线在0 25ngPb2 ml 石墨炉原子吸收光谱法测定尿铅 1 原理 尿样经基体改进剂稀释后 直接注入石墨管中 用无火焰原于吸收分光光度计测定吸光度 与铅工作曲线比较定量 2 测定方法 1 基体改进剂 称取4g磷酸二氢铵和6g抗坏血酸 加水溶解并稀释至1000ml 混匀 2 石墨管的处理 在普通石墨管中加入20m110g L钼溶液 在气体流速为100ml min下 于45 70 干燥50s 450 灰化30s l950 原子化7s 重复此操作10次 处理后石墨管内壁底部呈灰白 3 工作曲线 取不同体积的铅标准溶液 0 2mgPb2 ml 以基体改进剂稀释 加基体改进剂至0 20ml 各加正常人混合尿液0 20m1 混匀 4 测定 取0 20m1混匀尿样 加入0 20ml基体改进剂 混匀 取10ml注入石墨管中 按下列仪器工作条件 测定吸光度 波长283 3nm干燥45 75 40s狭缝l 3nm灰化450 30s灯电流7 5mA原子化1950 7s清除2050 3s载气 氩 150ml min 原子化时停气背景校正塞曼效应或氘灯 3 说明 1 用石墨炉原子吸收光谱法测得尿铅的最大优点是只需将尿液稀释便可直接测定 但尿液组成成分复杂且变化大 不能忽略基体效应的影响 常采用以下三种方法解决 用标准加入法定量 用基体改进剂和石墨炉平台技术 以工作曲线法定量 用基体改进剂消除基体干扰 石墨管涂钼降低背景吸收 以工作曲线法定量 2 基体改进剂的作用 磷酸二氢铵可以提高灰化温度 防止铅的挥发损失 使基体组分在原于化前挥发 从而提高测定灵敏度 抗坏血酸能有效地降低背景吸收 3 背景吸收的减免 将石墨管作涂钼处理 可以有效地降低背景吸收 如用普通石墨管测定尿铅时 使用30次背景吸收值即达到0 5Au 经涂钼处理后 开始的背景吸收值约为0 05A 使用100次约为O 3A 150次后 背景吸收仍在0 6A以下 4 于标准系列溶液中加入正常人尿液 绘制工作曲线进行定量 既可使标准与样品的基体组成接近 得到与标准加入法相同的结果 又不会使工作量增加 示波极谱法测定尿铅 1 原理 尿液经硝酸 高氯酸 盐酸消化后 Pb2 离子在底液中产生灵敏的吸附催化极谱波 根据峰电流与溶液中Pb2 离子含量成正比 用工作曲线法定量 2 测定方法 1 样品处理 取混匀尿液25m1于锥形瓶中 加7ml硝酸 高氯酸 5 2 2ml盐酸 置电热板上消化至瓶口无白烟 残渣为白色 2 工作曲线 取不同体积铅标准溶液于锥形瓶中 各加25ml模拟尿 同样品处理进行操作 3 测定 用5 0ml底液溶解样品或标准消化残渣 倒入电解池中 在示波极谱仪上 采用三电极系统 测定铅的峰电流 峰高 铅的峰电位在 0 5V 对饱和甘汞电极 左右 以标准的峰高对相应的浓度作图绘制工作曲线 用样品的峰高从工作曲线查出铅含量 3 说明 1 尿液的消化 应掌握消化至白色残渣 瓶口无白烟 消化温度不要太高 如有酸液残存 会出现畸形峰 如温度太高 蒸得过干 铅会有损失 造成结果偏低 2 底液及各成分的作用 底液 称取5 0g碘化铵 7 5g柠檬酸 1 Og抗坏血酸 用水溶解 加入25m1盐酸 用水稀释至500m1 混勾 碘化铵 或钾 碘离子能与Pb2 离子配位 形成PbI42 配离子 在酸性条件下吸附于滴汞电极表面 产生灵敏的吸附催化极谱峰电流 提高铅的测定灵敏度 抗坏血酸 为还原剂 可避免碘离子在酸性条件下被氧化 失去与Pb2 离子的配位作用 延长底液的保存时间 有效地消除氧和其他氧化剂的干扰 柠檬酸 也可用酒石酸 与干扰离子配位 起掩蔽作用 盐酸 保持底液有一定的酸度 是铅吸附催化波出现的必要条件 3 模拟尿 称取11 6g氯化钠 2 0g磷酸氢二铵 溶于适量水中 加1ml硫酸 用水稀释至1L 混匀 加入模拟尿的作用标准与样品的基体组成匹配 尿镉和血镉的测定一 概述 1 性质 镉为银白色 略带淡蓝色光泽的金属 质软并富有延展性 原子量为112 4 比重8 65 熔点320 9 沸点767 镉不溶于水 可与硫酸 盐酸 硝酸作用生成相应的镉盐 对碱和盐溶液有良好的抗腐蚀性 镉在空气中加热时能燃烧并生成氧化镉 镉的化学性质和锌相似 镉离子易与氨 氰化物 氯离子 碘离子等形成配离子 也易与双硫腙 吡咯烷二硫代氨基甲酸铵等配位 2 接触机会 一般人群通过食物 水 空气和吸烟接触镉 职业接触镉的机会主要有 铅锌矿的开采 冶炼 镉的生产 镉化合物在工农业生产中的应用 如镉作金属涂层用于电缆工业 镉颜料的生产和使用 镍镉蓄电池或矿灯的制造等 3 毒性 代谢和监测指标 职业接触镉主要是吸入镉的蒸气或粉尘 被人体吸收后经血液转移 大部分浓集于肾脏和肝脏 急性镉中毒的靶器官是肺 主要临床现为呼吸道刺激 呼吸困难 肺水肿及急性肺心病等 亦伴有呕吐 腹泻等 慢性中毒的靶器官是肺和肾 临床表现除呼吸道刺激 肺水肿 食欲不振 恶心等外 尚可见肾功能障碍 骨软化 全身骨痛 这即是痛痛病的主要症状 镉接触者的血镉和尿镉含量明显升高 可作为生物监测的常用指标 血镉可以反映近几个月接触镉的情况 近期接触镉量较多 血镉升高 当接触情况稳定时 血镉可反映在工作环境中的接触情况 是近期接触镉和急性中毒诊断的指标 尿镉是估计体内镉负荷和慢性镉中毒的生物监测指标 美国官方工业卫生家协会 ACGIH 规定接触镉时 血镉的生物接触限值为10mg L 尿镉为10mg g肌酐 4 检验方法 生物样品中镉的测定方法主要有原子吸收光谱法和电化学分析方法 常规火焰原子吸收光谱法的灵敏度较低 且受样品中盐及能与镉形成难解离络合物的其它金属离子的干扰 常需要采用络合萃取法使样品中的镉浓缩并与基体成分分离后测定 近年来 采用巯基棉选择性吸附和解吸镉 达到消除干扰和富集的目的 石墨炉原子吸收光谱法测定镉的灵敏度高 但由于镉的沸点低 不能采用较高的灰化温度使大部分样品基体预先除掉 会有较高的背景吸收干扰 近年采用的解决办法是 加酸除去血样中的蛋白质 取上清夜分析 尿样加基体改进剂 提高镉的热稳定性 使用最佳的灰化条件合较低的原子化温度 使镉信号与基体信号分开 使用高效能的背景校正器 采用基体匹配标准和标准加入曲线等 电化学分析方法中 示波极谱法 阳极溶出伏安法 电位溶出法等方法均具有较高的灵敏度 仪器价格低廉 但后两种方法要求操作条件严格 重现性较差 二 巯基棉分离 火焰原子吸收光谱法测定尿镉 1 原理 在弱酸性条件下 尿中镉被巯基棉吸附富集后 用稀盐酸解吸 于228 8nm波长下 用空气 乙炔火焰原子吸收光谱法测定镉的浓度 2 尿样的采集和保存 用聚乙烯瓶收集尿样 测定比重 按尿样总体积加入1 的盐酸 于4 下可保存两个月 3 测定方法 取100m1酸化后的尿样 加入到活塞下装有0 1g巯基棉的分液漏斗中 用1mol L氢氧化钠溶液和1mol L盐酸调pH至5 0 6 0 以小于6ml min的速度过滤 加5ml水洗涤巯基棉 待水滤尽后 加入10m10 2mol L盐酸解吸 速度与富集时相同 收集解吸液于10m1容量瓶中 混匀 测定 波长228 8nm乙炔流量0 9L min狭缝0 4nm空气流量5 5L min灯电流2mA 4 说明 1 巯基棉是棉花纤维素的羟基在酸性介质中与硫代乙醇酸发生多相酯化反应的产物 制备方法是 取100m1硫代乙醇酸 70m1乙酸酐 32ml乙酸 0 3m1硫酸混合 加入30g优质脱脂棉 浸泡 密闭后于40 保温3天 取出 用耐酸抽滤漏斗抽虑 蒸馏水冲洗至中性 置35 烘干 于棕色瓶中保存 2 尿液的酸度对巯基棉的富集和解吸效率有明显的影响 最佳的吸附pH为5 0 6 0 解吸时 0 l 0 2mol L盐酸可使99 8 的镉解吸下来 尿汞的测定一 概述 1 性质 汞 Hg 是一种银白色的液体金属 原子量为200 6 比重13 6 熔点 33 9 沸点357 2 汞能溶解除铁和铂外的许多金属生成汞齐 汞不溶于水 硫酸 盐酸及有机溶剂 易溶于硝酸和王水 能溶于类脂质 汞盐大部分能溶于水 如硝酸汞 硫酸汞 氯化汞等 但氧化汞 氯化低汞 硫化汞等几乎不溶于水 汞易挥发 温度越高 挥发性越强 0 时汞在空气中蒸发达到饱和浓度2 18mg m3 已是卫生标准0 01mg m3的209倍多 20 时 则可达卫生标准的1300余倍 汞的挥发除与温度和气压有关外 还与室内空气交换的速度以及汞的暴露面积有关 因此 在使用汞时 必须注意不要将汞暴露于空气中 在汞的表面加水封 可有效地防止汞的挥发 溅洒到桌面或地面的汞应用吸管吸起来 金属汞及其无机化合物在环境中受微生物的甲基化作用 可以转变成毒性更大的甲基汞 2 接触机会 人们接触汞的机会较多 如汞矿的开采 冶炼 用汞齐法提炼贵金属 金属汞广泛用于电器器材和测量仪表的制造 化工 轻工等工业使用汞的化合物 工业三废如处理不好 可污染大气 水源 土壤和食物 增加人们接触汞的机会 3 毒性 代谢和监测指标 汞及其化合物是有强烈毒性的化学物质 世界上已有多起汞中毒事件发生 如日本的水俣病 汞及其化合物可以通过呼吸道 消化道或皮肤等途径进入体内 在生产环境中主要是经呼吸道吸入金属汞蒸气 汞化合物的气溶胶或粉尘 汞蒸气经呼吸道进入机体后 可通过肺泡壁的毛细血管吸收75 85 溶解度高的汞盐可经消化道迅速吸收 被吸收的汞在细胞内氧化成二价汞离子 汞离子与蛋白质的巯基结合 抑制一系列合巯基酶的活性 引起机体功能障碍 主要损伤神经系统和肾脏 职业性慢性汞中毒的主要临床表现为口腔炎 易兴奋性和汞中毒震颤 汞接触者尿汞含量明显升高 因此尿汞含量可以作为监测汞接触的常用指标 4 检验方法 尿汞的测定方法常用双硫腙比色法和冷原子吸收光谱法 双硫腙比色法的灵敏度低 影响因素多 冷原子吸收光谱法的灵敏度高 特异性好 操作简便 是目前尿汞测定最常用的方法 尿汞的冷原子吸收光谱测定法 冷原子吸收光谱法是用氯化亚锡作还原剂将尿样中的汞还原成元素态汞蒸气 被载气流带入吸收管道 汞蒸气吸收253 7nm紫外线 且吸收的程度与汞含量成正比 用标准曲线法或比较法测定尿汞含量 根据所加氯化亚锡的酸碱性不同 可分为酸性氯化亚锡还原法和碱性氯化亚锡还原法两种 一 碱性氯化亚锡还原法 1 原理 在强碱性 pH l4 和有镉离子存在的条件下 用高浓度氯化亚锡将尿中的有机汞和元机汞还原成元素态汞 用测汞仪在253 7nm处测定汞含量 2 尿样的采集