谷胱甘肽发酵优化与调控分析

谷胱甘肽的发酵优化及调控分析 与制药工程学院研究生一班 1 2 3 4 Contents 谷胱甘肽的作用及代谢途径 合成谷胱甘肽限制因素 发酵条件优化及调控策略 调控策略分析 一 什么是谷胱甘肽 谷胱甘肽 glutathione r glutamylcysteingl glycine GSH 是一种含 酰胺键和巯基的三肽 由谷氨酸 半胱氨酸及甘氨酸组成 重要的功能团 1谷胱甘肽简介 1 1功能 SH 易于氧化物质和毒素结合 通过生物转化 将其排除体外 因此GSH起到抗氧化和解毒的作用 GSH 年需求量逐年上升 2015年世界需求量达到500吨 谷胱甘肽的作用 1 2谷胱甘肽代谢途径 谷氨酰半胱氨酸合成酶 GSH1 谷胱甘肽合成酶 GSH2 主要的生产菌株为酵母菌和大肠杆菌 2合成谷胱甘肽限制因素 1 半胱氨酸的量制约GSH的合成速度和合成量 比如胞内半胱氨酸量不足 则导致其合成下降 2 ATP的供给 3 GSH1和GSH2的活性 4 GSH的反馈调节机制 GSH1是一个调节酶 也是一个多功能酶 受终产物GSH的负反馈调节 当GSH在细胞中积累一定量时 GSH与酶分子的调节部位结合使酶中心变构失活 从而抑制GSH继续合成 3发酵条件优化及调控策略title 实验设计 数据分析 培养基优化 正交实验设计 中心复合实验设计 均匀实验设计 响应面法 神经网络 3 1培养基优化 Liu等对葡萄糖 蛋白胨和硫酸镁运用Box Behnken设计进行优化 考察它们对酿酒酵母产的影响 并分别用响应面法和神经网络进行分析 发现神经网络预测的生物量和产量误差更小 在优化后的培养条件下 GSH产量达到115 28mg L 比优化前提高了73 Cha等报道氨基酸 盐类物质和碳氮源对酿酒酵母FF 8产GSH的影响 通过单因素实验发现 3 0 葡萄糖 3 0 酵母粉 0 06 磷酸二氢钾和0 06 半胱氨酸对GSH生产最有效 在此YM条件下产量达到204mg L 比在基本培养基下提高了2 27倍 Clicktoedittitle 3 2培养条件优化在发酵过程中 主要优化发酵温度 溶氧 PH 压力 接种量等 来调控谷胱甘肽生产 提高产量 1 卫功元等在摇瓶和7L罐上研究了温度 pH和溶氧对产肮假丝酵母生产的GSH影响 1 较高温度促进细胞增长 较低温度更有利于GSH产量的提高 2 在分批发酵条件下 当葡萄糖30g L浓度为留且通气量控制在5L min时 搅拌转速达到300r min即可满足细胞生长和合成对溶解氧的需求 2 pH在5 5时对细胞生长和GSH合成最佳 而不控制pH比控制pH在对细胞生长和GSH合成分别降低了27 和29 3 Liang等利用环境氧胁迫策略来提高产肮假丝酵母中的GSH积累 在发酵过程中分三段对其进行氧胁迫后 使分批发酵GSH产量达218mg L 含量达到 比对照分别提高了54 6 和58 1 3 3发酵调控策略 1 补料调控 高密度发酵 补料分批发酵是目前最有效的一种方式来实现高密度培养 优点 避免底物浓度过高 防止底物浓度过高产生的细胞生长抑制 目标产物得率下降 流加培养方式 恒速流加指数流加溶氧和反馈控制流加乙醇和pH反馈控制流加等 2 比生长速率调控据质量守恒做出比生长速率和比产率的数学模型 通过控制补料发酵过程中的底物流加速率来操控比生长速率 从而获得最大产量 3 前体补加调控通过添加L 半胱氨酸 谷氨酸 甘氨酸提高谷胱甘肽生产量 4发酵条件优化及调控策分析 1 添加碳氮源 葡萄糖 蛋白胨等 GSH是一种胞内产物 提高细胞密度 对提高GSH的总产量有着重要作用 2 提高溶氧 增加DO值 同样可以使细胞数量增加 并且在葡萄糖量提高 加快TCA循环 提高ATP的生成量 从而促使合成谷胱甘肽速率加快 3 添加前体 按1 1 1的比例Glu Cys Gly增加反应速率 TCA ATP ATP 4 添加金属离子 Mg2 或Mn2 提高GSH1和GSH2活性 减小GSH1反馈抑制作用 提高酶活 Li等比较了恒速流加 人工反馈控制流加和指数流加这三种补糖策略对重组大肠杆菌高密度培养产GSH的影响 发现指数流加最为理想 生物量达到80g L 产量达到0 88g L Wen等在酿酒酵母T65发酵生产GSH时通过正交设计和均匀设计优化了三种前体氨基酸的添加浓度 补料分批发酵后使GSH最高产量达到2190mg ml Wang等在发酵过程中优化在一次添加三种前体氨基酸的量 使发酵在38小时达到最高的GSH产量2020mg ml 同一细胞间 不同细胞间 5 几种新型的代谢途径调控方式分析 耦合通过糖酵解途径产生ATP来生产GSH 酵母细胞胞外表达GSH GTP 谷氨酰转肽酶Opt1 寡肽转运体1Gxa1 谷胱甘肽转出ABC蛋白1Gex1 Gex2 谷胱甘肽质子交换器1 进行过表答 LOGO ADP1 GSH1 GSH2 12 7mg l增加了4 3倍 高于ADP12 4倍 和6 9倍 2 98mg l OD GSH1 GSH2 5 40mg l OD 亲代菌株 1 83mg l 亲代菌株 0 34mg l OD GSH1 GSH2 0 53mg l OD 1 6倍ADP1 1 51mg l OD 3 8倍ADP1 GSH1 GSH2 5 80mg l OD 17 1倍 以下的条形图是表示对该菌株的GSH1 GSH2过量表达 ADP1的过量表达和ADP1 GSH1 GSH2同时过量表达后的GSH产量与原始菌株产GSH量进行比较 GSH1 GSH2 2 21mg lADP1 3 47mg lADP1 GSH1 GSH2 11 4mg l分别是亲代菌株GSH产量 1 41mg l 的1 6倍 2 5倍 8 1倍 总产量 GSH1 GSH2 亲代菌株浓度相同ADP1 亲代菌株55 ADP1 GSH1 GSH2 亲代菌株47 细胞干重 腺苷酸的代谢途径耦合系统 ATP再生系统 Ado 腺苷 AMP 腺苷一磷酸 Ino 肌苷 Hx 次黄嘌呤 研究结果表明 较低的谷胱甘肽生产ATP再生系统的耦合不是因为ATP利用的低效率ATP再生的效率低 腺苷 Ado 转变成次黄嘌呤 Hx 不可逆转大肠杆菌JM109 pBV03 不能利用酿酒酵母WSH2ATP再生的糖酵解途径 添加腺苷脱氨酶抑制剂块转换HX到Ado ATP的数量再生是增加 因此 生产谷胱甘肽显著增加 结果将会扩大 LOGO LOGO 添加腺苷脱氨酶对谷胱甘肽的影响 双功能谷胱甘肽合成酶从嗜热链球菌中发现一种双功能谷胱甘肽合成酶 GshF 具有GCS和GS的活力 该酶对GSH不敏感 所以将其基因转入到毕赤酵母中表达不受GHS的反馈抑制该研究结果谷胱甘肽产量提高2 29倍 过表达GSH1和GSH2利用基因工程技术将酿酒酵母控制GSH合成酶的基因拷贝 转化入毕赤酵母中过表达产量可以达到4 15g l 在发酵过程中没有用添加前体的方式调控的GSH的产量 产量并不