微生物检验其他革兰阴性杆菌及检验.doc

第二十六章其他革兰阴性杆菌及检验本章考点：1.概述：概念2.嗜血杆菌属生物学性状临床意义微生物学检查3.军团菌属、鲍特菌属、布鲁菌属一、嗜血杆菌属（一）简述：嗜血杆菌属是一类无动力、无芽胞的革兰阴性小杆菌，常呈球杆状，有时呈杆状、长丝状等多形态。嗜血杆菌属包括16个菌种，其中与临床有关的为9个种，即流感、副流感、溶血、副溶血、嗜沫、副嗜沫、杜克、埃及、迟缓嗜血杆菌。嗜血杆菌须在人工培养基中加入新鲜血液才能生长，故称嗜血杆菌。因新鲜血液中含有X和V因子。X因子是血红蛋白中的一种血红素及其衍生物，为高铁血红素，是细菌合成过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素氧化酶的辅基。V因子是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），存在于血液和某些植物组织中，是脱氢酶的辅酶。（二）流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌，简称流感杆菌，不是流感的病原菌。1.生物学性状：（1）形态与染色：大小为（1.01.5）m（0.30.4）m。急性感染标本，如脑脊液中多为短小球杆菌，恢复期病灶或长期人工传代培养后可呈球杆状、长杆状、丝状等多形态性。毒力株（粘液型菌株）在营养丰富的培养基上，68h有明显荚膜，在陈旧培养物中荚膜消失。无鞭毛，无芽胞。革兰染色阴性，但着色较浅。用石碳酸复红或美蓝单染色，呈现两端浓染现象。（2）培养特性：需氧菌。最适生长温度为35，最适pH为7.67.8。初次分离培养时，最好在5%10%C02环境中，以促进其生长。在普通培养基中须加入X和V因子，才能生长。血液中的V因子通常处于抑制状态，经8090热10min破坏红细胞膜上的不耐热抑制物，可使V因子释放，故流感嗜血杆菌在巧克力琼脂平板上生长较佳。培养1824h后生长直径为0.50.8mm、圆形、光滑、湿润、边缘整齐，呈露滴状的小菌落。48h后可形成直径1.01.5mm灰白色较大的菌落。有荚膜菌株的菌落呈轻度粘稠。当流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上共同培养时，由于后者能合成较多的V因子，可促进流感嗜血杆菌的生长。因此，在葡萄球菌菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落较大，离葡萄球菌菌落越远的菌落越小，此称为卫星现象，这有助于对流感嗜血杆菌的鉴定。 在液体培养基中，有荚膜的菌株呈均匀混浊生长，无荚膜的R型菌株则为颗粒状沉淀生长。（3）生化反应：本菌对糖发酵不稳定。一般分解葡萄糖只产酸，不分解乳糖或甘露醇，对麦芽糖、蔗糖或糊精的发酵不稳定。所有菌株还原硝酸盐。有荚膜菌株产生吲哚。典型菌株不溶血。产生自溶酶，可被胆汁溶解。根据流感嗜血杆菌产生吲哚，尿素酶及鸟氨酸脱羧酶反应，将其分为8个生化型。2.致病性：致病物质为内毒素、荚膜、菌毛和酶类。主要通过呼吸道感染，引起原发性或继发性感染。原发性感染多由b型荚膜强毒株引起，为急性化脓感染，如脑膜炎、鼻咽炎、咽喉会厌炎、化脓性关节炎、心包炎及败血症等。继发感染主要在流感、麻疹、百日咳、肺结核等感染后发生，多为无荚膜菌株引起。如慢性支气管炎、中耳炎、鼻窦炎、肺炎等。3.微生物学检验（1）标本采集：根据感染部位不同采集标本，如痰液、脑脊液、鼻咽分泌物及脓液等。（2）检验方法1）直接镜检：痰液、脓液等标本可直接涂片，脑脊液可取离心沉淀物涂片，革兰染色镜检。如查到革兰阴性短小杆菌或多形态杆菌，结合临床症状，作初步诊断。2）分离培养与鉴定：将血液、脑脊液标本先增菌培养后，再转种巧克力琼脂平板或选择性巧克力琼脂平板，经37培养2448h。根据菌落形态、涂片染色、卫星现象，X、V因子需求与否，定种，再作生化试验和荚膜肿胀试验分型。3）如何提高流感嗜血杆菌的阳性率：初次培养应在5%10%C02环境。生长需要X、V因子，故在培养基中应添加此因子。应用选择性培养基，如巧克力琼脂中加一定量抗生素，1ml培养基中含万古霉素50g，杆菌肽300g，氯林可霉素1g，嗜血杆菌分离率可达96.7%。4.治疗：若-内酰胺酶阴性则首选氨苄青霉素、阿莫西林，次选TMP-SMZ，二、三代头孢菌素，红霉素，氨曲南，-内酰胺酶阳性提示对青霉素，氨苄西林和阿莫西林耐药。（三）其他嗜血杆菌菌种因子因子溶血性致病性流感嗜血杆菌+-原发性化脓性感染及继发性感染等副流感嗜血杆菌-+-偶可引起细菌性心内膜炎、尿道炎埃及嗜血杆菌+-急性、亚急性眼结膜炎杜克嗜血杆菌+-+/-软性下疳（性传播疾病）嗜沫嗜血杆菌+-偶引起细菌性心内膜炎或脑脓肿溶血性嗜血杆菌+很少致病二、军团菌属1.命名和分类：1976年在美国费城召开的全美退伍军人会议期间，暴发流行一种严重肺炎，与会者149人，有34人死亡。从死者肺组织中分离到一种新菌，1978年美国疾病控制中心将其命名为军团菌。伯杰系统细菌学手册（1984）定为军团菌科，军团菌属。目前军团菌属包括39个种和61个血清型，从人体分离的已有19种，其中主要致病菌为嗜肺军团菌。2.生物学性状：为一群革兰阴性杆菌，常规染色不易着色，有端生或侧生鞭毛。无芽胞。属需氧菌，氧气含量减少时，生长速度减慢。最适生长温度为36，在含有2.5%5%C02环境中生长良好，营养要求较苛刻，且生长缓慢，初次分离需L-半胱氨酸，培养基中含铁盐可促进生长。在费-高（F-G）培养基上，培养3-5天可见针尖大小的菌落，在紫外线照射下可发黄色荧光，菌落周围呈现褐色。在活性碳-酵母浸出液琼脂（BCYE）培养基中培养35天形成12mm圆形凸起，灰白色有光泽的菌落。本属细菌触酶阳性，部分菌株氧化酶阳性，不分解糖类，多数菌株产-内酰胺酶。本菌具有0、H抗原，H抗原无特异性，0抗原具有特异性。本菌在自然界广泛存在，人工管道的水源中常存在此菌，如医院空调冷却水中常有此菌，对常用化学消毒剂敏感。3.微生物学检查：合理采取相应标本，如下呼吸道分泌物、胸水、活检肺组织及血液等。直接涂片意义不大。胸水和下呼吸道分泌物，可以直接接种于活性炭-酵母浸出液琼脂。血液标本可接种于双相培养基。组织标本应先以无菌手续研磨制成标本悬液后接种。环境中的标本先离心浓缩后接种，也可将标本先感染动物，然后将脏器研磨分离培养，将分离培养后的菌落进行革兰染色镜检，进行氧化酶和触酶试验，明胶液化试验及-内酰胺酶试验。也可利用PCR技术及荧光抗体染色进行鉴定。由于该菌营养要求很苛刻，培养难度相对较大，故临床上常利用血清学诊断方法检测军团菌抗体IgG、IgM。但军团菌的血清学反应与其他一些细菌，如假单胞菌属等有交叉反应，应引起注意。4.临床意义：军团菌主要为嗜肺军团菌引起军团病，轻症型类似流感，病人有发烧、头痛、无力等症状。重症型是以肺部感染为主要特征，常导致多器官损害，最终导致呼吸衰竭死亡。5.结果评价及治疗原则：从临床标本中，尤其是呼吸道标本中分离出军团菌，应确定为军团菌感染，应积极采取治疗措施，一般治疗方案为红霉素加氨曲南。氨基糖苷类抗生素、青霉素、头孢菌素类抗生素对本菌无效。三、弗朗西斯均属（略）四、鲍特菌属百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌是百日咳的病原菌，为革兰阴性小杆菌，营养要求很高，血平板及巧克力平板不生长，常用鲍-金培养基进行分离培养。具有多种毒素：即百日咳毒素、丝状血细胞凝集素、腺嘌呤环化酶毒素、气管坏死毒素、皮肤坏死毒素。不发酵糖类，不产生H2S、吲哚，不液化明胶，不能还原硝酸盐，不能利用枸橼酸盐。新分离的百日咳鲍特菌为光滑型称相菌，具有菌体（O）抗原和荚膜（K）抗原，相菌相当于粗糙型，无荚膜，无毒力，、相为过渡相。从相到相的变异是形态、菌落、溶血性、抗原结构、致病力等全面变异。该菌抵抗力弱，5630分钟、日光照射1小时可致死亡。百日咳鲍特菌主要通过飞沫经呼吸道传播，引起百日咳。传染源主要是早期患者和带菌者。主要症状为阵发性剧烈咳嗽。由于病程较长，故名百日咳。病后或预防接种后，可获得持久免疫力，再次感染少见。气管粘膜局部的sIgA抗感染作用重要。五、布鲁菌属人畜共患感染性疾病的病原菌，革兰阴性小杆菌或球杆菌无动力，无芽胞和荚膜，需氧，对营养要求较高，在血琼脂平板上培养57天可形成微小、灰色不溶血菌落。能利用葡萄糖等糖类，尿素酶阳性，硝酸盐还原试验阳性。含有A抗原和M抗原。检测：凝集反应，PCR检测，抗体检测。临床意义：布鲁菌可通过人类皮肤、呼吸道和消化道进入人体而感染，引起人布鲁菌病，主要表现为菌血症。进入人体后首先侵犯局部淋巴结，之后人血，再进入肝、脾、骨髓等器官，病人热型呈波浪热。治疗：首选多西环素，次选TMPSMZ，用药需46周。本章练习题：军团菌病的传播是经A.食物B.空气C.血液D.皮肤接触E.动物媒介答疑编号500735260101正确答案B分离流感嗜血杆菌常用的培养基为A.血琼脂平板培养基B.巧克力琼脂培养基C.SS培养基D.TCBS培养基E.麦康凯培养基答疑编号500735260102正确答案B 慢性波浪热患者分离布鲁菌阳性率最高的标本是A.血液B.粪便C.尿液D.痰液E.骨髓答疑编号500735260103正确答案E 培养分离军团菌可以采用A.血平板B.罗氏培养基C.活性炭酵母浸液琼脂D.碱性平板E.沙保弱培养基答疑编号500735260104正确答案C 对军团菌错误的是A.广泛存在于各种水环境中B.可以寄生在单核巨噬细胞内C.是引起医源性肺炎的常见病原菌D.治疗药物首选红霉素E.对外界环境抵抗力低答疑编号500735260105正确答案E 白百破三联疫苗的组成是A.白喉类毒素、百日咳类毒素、破伤风类毒素B.白喉类毒素、百日咳死菌苗、破伤风类毒素C.白喉死菌苗、百日咳死菌苗、破伤风类毒素D.白喉死菌苗、百日咳死菌苗、破伤风死菌苗E.白喉类毒素、百日咳类毒素、破伤风死菌苗答疑编号500735260106正确答案B第二十七章衣原体及检验本章考点：1.概述（1）概念（2）命名与分类2.生物学性状（1）繁殖周期与形态染色（2）抗原成分（3）分离培养（4）抵抗力3.临床意义（1）沙眼衣原体（2）鹦鹉热衣原体（3）肺炎衣原体4.微生物学检验（1）直接镜检（2）抗原检测（3）核酸检测（4）分离培养（5）抗体检测5.治疗原则概述一、概述（一）概念衣原体是一群体积较小，能通过细菌滤器，细胞内专性寄生，并有独特发育周期的原核细胞型微生物。由于它具有一些与细菌类似的生物学特性，现归属于广义的细菌范畴。（二）分类与命名1.传统分类法：按第九版Bergey细菌学分类手册，衣原体属于衣原体目、衣原体科、衣原体属。二、生物学性状1.发育繁殖周期与形态染色：衣原体在宿主细胞内生长繁殖有独特的发育周期，可见到两种形态结构不同的颗粒。（1）原体：呈球形或椭圆形，直径约0.3m，外有胞壁，内含致密的核质，为成熟的衣原体。姬姆萨染色呈紫色，Maechiavello染色呈红色。在细胞外较为稳定，无繁殖能力，但有高度的感染性。（2）网状体又称始体：呈球形或椭圆形，直径0.51m，无胞壁，胞浆内无致密的核质，而有纤细的网状结构。姬姆萨染色和Maechiavello染色均呈蓝色。为衣原体发育周期中的繁殖型，代谢活泼，不能自胞外存活，无感染性。衣原体原体和始体的性状比较性状原体始体大小0.3m0.51m细胞壁+-致密的核质+-姬姆萨染色紫色蓝色Maechiavello染色红色蓝色代谢活性-+胞外稳定性+-感染性+-繁殖能力-+衣原体的发育周期：2.抗原成分：衣原体的抗原性相当复杂，有属、种、型等特异性抗原。（1）属特异性抗原：衣原体细胞壁LPS为属特异性补体结合抗原。其与革兰阴性菌LPS结构不同，缺乏O-多糖和部分核心多糖，无典型内毒素生物学活性。长期应用于衣原体血清学诊断。（2）种特异性抗原：位于主要外膜蛋白（MOMP）上，可鉴别不同种衣原体。（3）型特异性抗原：也位于MOMP上，用单克隆抗体作微量免疫荧光试验可识别衣原体各血清型。3.分离培养特性：衣原体专性细胞内寄生。绝大多数能在68日龄鸡胚卵黄囊中生长繁殖，并可在卵黄囊膜中找到包涵体、原体和始体颗粒，也可在传代细胞（如He-La-299和McCoy等细胞株）中培养。4.抵抗力：衣原体抵抗力弱，沙眼衣原体感染材料在3537条件下，经48小时左右即失去活性。不耐热，加热50经30分钟或5660 510分钟可杀死，但耐寒，在冰冻条件下可存活数年。鹦鹉热衣原体比沙眼衣原体稳定。对四环素、青霉素、红霉素、螺旋霉素、利福平较敏感。三、临床意义人类衣原体病主要包括：（一）沙眼衣原体1.沙眼：由沙眼生物亚种A、B、Ba和C四个血清型引起。主要通过眼-眼或眼-手-眼（常通过公用毛巾等媒介）的途径进行直接或间接接触传播。2.包涵体结膜炎：由沙眼生物亚种B、Ba、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K血清型引起。包括婴儿及成人两类。婴儿经产道时该亚种可致包涵体（化脓性）结膜炎和婴幼儿肺炎。成人引起滤泡性结膜炎。3.泌尿生殖道感染：主要由沙眼生物亚种D-K血清型引起，是经性接触传播引起的非淋菌性泌尿生殖道感染的主要病原。衣原体感染是男性尿道炎最常见的病因之一。未经治疗者多数转为慢性，周期性加重，或可合并附睾炎、前列腺炎等。在女性可引起尿道炎、宫颈炎、阴道炎、盆腔炎，也可与妇女不孕症有关。衣原体常与淋病奈瑟菌混合感染，淋病奈瑟菌对衣原体的繁殖起激活和促进作用。4.性病淋巴肉芽肿：由沙眼衣原体LGV生物亚种L（L1、L2、L2a、L3）血清型引起，主要通过性接触传播。引起以化脓性腹股沟淋巴结炎为特征的性病，又称第四性病。主要侵犯淋巴组织，女性以累及会阴、肛门、直肠及盆腔淋巴结多见，男性以累及腹股沟淋巴结为常见，发生化脓性炎症和慢性肉芽肿，有些可形成瘘管。（二）鹦鹉热衣原体主要引起鸟类或家禽感染，由感染该衣原体的鸟类等动物的粪便污染环境，以气溶胶形式传给人。使人发生上呼吸道感染、肺炎和毒血症。典型临床表现为非典型肺炎。也有引起心内膜炎的报道。（三）肺炎衣原体其传播方式主要是人与人之间经飞沫或呼吸道分泌物传播。引起青少年急性呼吸道感染，以肺炎为主，常可呈地方性、散发性流行，也可引起支气管炎、咽炎等。该衣原体也可引起慢性感染，其与急性心肌梗死和慢性冠心病的关系越来越引起注意。四、微生物学检验1.标本采集与处理（1）沙眼衣原体：沙眼和包涵体结膜炎的病人，取眼穹隆部及睑结膜病灶作刮片。子宫颈炎，取子宫颈刮片上皮细胞或分泌物作涂片。性病淋巴肉芽肿病人可取腹股沟淋巴结脓液，也可取直肠拭子或活检材料送检。（2）鹦鹉热衣原体：采取病人血液、痰或咽喉含漱液，痰标本用约210倍左右的灭菌肉汤或组织培养液洗脱附着在标本上的病原体，用力振摇，制成悬液，置室温12小时后，低速离心取上清接种。尸检材料取肝、脾、肺等组织，也可采腹腔和心包渗出液。（3）肺炎衣原体：一般利用拭子经鼻前庭插入鼻咽部，旋转后取出，利用转运培养基，冷藏送检。也可采集气管内痰液或肺泡灌洗液。要求24小时内接种或置-70保存。2.直接显微镜检查：染色镜检，寻找上皮细胞细胞浆内的包涵体。根据包涵体的形态、在细胞内的位置及染色性等特性，对鉴别衣原体有意义。（1）姬姆萨（Giemsa）染色：原体呈紫红色，始体呈蓝色，包涵体呈深紫色。（2）碘液染色：标本经甲醛固定后，用Lugol碘液染10min，水洗后镜检。因包涵体的基质含有丰富的糖原，可被碘液染成深褐色，而细胞的其他部分呈黄色。沙眼衣原体含糖原，碘染色阳性。鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体碘染色阴性。（3）可利用抗LPS单抗进行直接法荧光抗体染色检测上皮细胞内的衣原体抗原。3.分离培养：各种衣原体均可在鸡胚卵黄囊和组织细胞内生长繁殖，鹦鹉热衣原体常用小鼠分离。（1）鸡胚卵黄囊接种：将检查标本加适当抗生素（如链霉素等）处理后接种于鸡胚卵黄囊分离培养。（2）细胞培养：目前常用的细胞有两种：即经X线照射的McCoy细胞和HeLa细胞。不同种的衣原体有各自最适合的培养细胞系。沙眼衣原体多用McCoy细胞，鹦鹉热衣原体适合用Hela 229细胞系进行培养。肺炎衣原体适合用HEP-2和HL细胞系进行培养。为了达到较好的