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生 物 技 术 大 实 验 编者：岳强 包英华 陈燕飞 刘静华 韶 关 学 院 英 东 生 物 工 程 学 院二OO六年二月十五日目 录第一部分 常用分子生物学实验技术及原理第一章 核酸的提取和纯化-第二章 电泳-第三章 分子生物学中常用的工具酶-第四章 核酸探针的分子标记-第五章 核酸的分子杂交-第六章 DNA的序列测定-第七章 PCR原理及其应用-第八章 重组DNA技术基本原理-第九章 生物信息学简介-第二部分 生物技术综合实验室简介第一章 实验室的基本要求和注意事项-第二章 实验室常规仪器设施及基本操作简训-第三部分 实验内容1目的基因的获得和重组载体的构建实验一 真核生物总RNA的提取、分离和纯化-实验二 PCR扩增制备目的基因- -实验三 目的基因片段与载体连接-实验四 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断-2感受肽细胞的制备和转化及筛选鉴定实验五 感受态菌的制备-实验六 细菌转化-实验七 重组菌株的筛选和鉴定-3质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定实验八 载体质粒DNA的小量制备-实验九 载体质粒DNA的酶切-实验十 酶切产物电泳鉴定-4目的基因的表达与检测实验十一 酸性磷酸酯酶的动力学分析-实验十二 细胞色素C的提取及测定-附录分子生物学常用试剂、溶液和缓冲液- 课 程 简 介生物技术大实验是生物技术专业（基础生物技术方向）第六学期开设的一门专业限选课，内容分为：常用分子生物学实验技术及原理（含理论和多媒体内容，30学时）；实验90学时；机动4学时，共124个学时，7学分。生物技术大实验主要包括对分子生物学、基因工程和生物工程下游技术等三门学科的实验技能训练和培养，这三门都是当今生物学中应用较广的实验性学科，因此对学生进行相关实验操作能力的培养时十分重要而有益的。针对生物技术专业的特点，结合实验室设备和资源的具体情况，决定开设的实验由三个学科中较常见的经典实验，如生物大分子的抽提及检验、分子克隆等组成。这些实验既可加深学生对理论知识的理解，又可培养学生的动手操作能力，还能大大提高学生对这些热门学科的兴趣。本实验课程按照四年制生物技术专业本科生的教学计划及教学培养目标设置，同时结合我校实际，符合课程要求。实验学时分配实验内容学时分子生物学实验基本操作简训2实验一 真核生物总RNA的提取、分离和纯化8实验二 PCR扩增制备目的基因6实验三 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断6实验四 目的基因片段与载体连接12实验五 感受态菌的制备20实验六 细菌转化6实验七 重组菌株的筛选和鉴定20实验八 载体质粒DNA的小量制备4实验九 载体质粒DNA的酶切4实验十 酶切产物电泳鉴定2合计90实验十一 酸性磷酸酯酶的动力学分析*2实验十二 细胞色素C的提取及测定*2注：*为选做实验第一部分：理论内容第一章 核酸的分离与提取1概述1.1 提取的含义 提取是指在一定的条件下用一定的溶剂处理样品，使欲分离的物质充分释放到溶剂中的过程.又称为抽提或萃取。常用的溶剂有水、稀盐、稀酸、稀碱或甘油等较缓和的试剂。影响提取的主要因素:提取物质的结构与性质(与其溶解度有关)：如极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂，碱性物质易溶于酸性溶剂，两性电解质在 pI时，溶解度最少。温度:一般温度升高溶解度增大溶液的粘度扩散速度；扩散面积。1.2核酸的特点核酸分为两大类：一类为核糖核酸（RNA），另一类为脱氧核糖核酸（DNA），在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些嗜菌体DNA有时为单链环状分子，RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子，不同类型的RNA分子可以具有不同的结构特点，如真核mRNA分子多数在3端带有poly(A)结构，至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状及单链线状等。95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子则主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞器中，RNA以rRNA的数量最多（80-85%），tRNA及核内小分子RNA占10%-15%，而mRNA分子大小不一，序列各异。总的来说，DNA分子的总长度一般随着生物的进化程度而增大，而RNA的分子量与生物进化无明显关系。1.3分离纯化核酸总的原则核酸提取的主要步骤，无外乎破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质，纯化核酸等。核酸提取的方案，应根据具体生物材料和待提取的核酸分子的特点而定，对于某特定细胞器中富集的核酸分子，事先提取该细胞器，然后提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。分离纯化核酸总的原则：防止核酸酶的降解，即应保证核酸一级结构的完整性：在提取分离核酸时要降低核酸酶的活性,通常加入抑制剂和去激活剂。如：加柠檬酸钠,EDTA(乙二胺四乙酸二钠)来抑制酶的活性达到目的。防止化学因素的降解：避免强酸强碱。防止物理因素的降解：核酸大分子、高温、机械作用等均可以破坏核酸分子的完整性,因此核酸提取适于在低温及避免剧烈搅拌等条件下进行。排除其它分子的污染。为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。对于核酸的纯化应达到以下三点要求：核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。为了保证分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中，应注意以下事项： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； 减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4-10的条件下进行；减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液振荡、搅拌，使溶液快速地通过狭长的孔道，细胞突然置于低渗液中，细胞爆炸式破裂以及DNA样本的反复冻贮。这些操作细节在实验操作中应倍加注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。对分子量小的环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子，威胁相对小些。高温如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中，一般在低温操作，但现在发现在室温快速提取与低温提取，获得核酸的质量没有太大差异。防止核酸的生物降解，细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，使用EDTA、柠檬酸盐螯合金属二价离子，基本可以抑制DNA酶活性。而RNA酶不但分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱、不易失活，所以是生物降解RNA提取过程的主要危害因素。2.核酸的提取方法 核酸是两性化合物，在一定的等电点。溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有机溶剂。细胞内的核酸常和蛋白质结合成核蛋白。核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白在不同浓度的电解质溶液中的溶解度有显著区别，有一定浓度范围的氯化钠溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度随着氯化钠浓度增加而逐渐下降，当氯化钠浓度为0.14mol/l时，其溶解度仅为水中溶解度的1/100，但当氯化钠浓度再增加时，脱氧核糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化钠浓度增加到0.5mol/l时，其溶解度与水中溶解度相似，当氯化钠浓度增加到1mol/l时，它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/l氯化钠溶液中仍有相当大的溶解度，因此常用0.14mol/l氯化钠溶液提取核糖核蛋白，而提取脱氧核糖核蛋白时，则用1mol/l氯化钠溶液。两种核糖核蛋白的溶解度与溶液的pH也有关。当pH为4.2时，脱氧糖核蛋白的溶解度最低，而pH为2.02.5时，核糖核蛋白的溶解度最低。所以调节氯化钠溶液的浓度和pH值，可使核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白分离开来。2.1 RNA的提取RNA在细胞中主要有三种类型，即rRNA（核微粒核糖核酸）、tRNA（转移核糖核酸）和mRNA（信使核糖核酸）。mRNA代谢极不稳定，提取时要求条件较严格；tRNA当细胞破碎后，用酸处理得到“pH5”沉淀，即可从中分离tRNA；rRNA占全部RNA的80%以上，比较稳定，一般提取的大分子RNA主要为此部分。核内rRNA常先将细胞核分离后， 再进行提取，可避免其他细胞组分RNA的干扰。RNA的提取，通常是用0.14mol/l氯化钠溶液将组织做匀浆并反复提取细胞质中的核糖核蛋白，而留下含有RNA的细胞核物质，用10%醋酸调至pH4.2沉淀，离心弃去上清液，先用0.5mol/l氯化钠溶液，后用水洗涤沉淀，将核糖核蛋白后溶解于0.5mol/l碳酸氢钠溶液中，离心，取上清液，调pH至4.2,沉淀以0.5mol/l氯化钠溶液洗涤，再一次除去脱氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白质可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氢钠水溶液中，加入乙醇，RNA即以钠盐形式沉淀出来。提取RNA的另一类方法，不须事先用0.14mol/l氯化钠提取核糖核蛋白，而一步将RNA的蛋白质分开，并同时把RNA抽提出来，此类方法是在破碎细胞做成匀浆时，加入去污剂十二烷基磺酸钠或二甲苯磺酸钠；而现在最常用的方法是直接加入含水苯酚与匀浆一起振荡，DNA和蛋白质沉淀于酚层中，水层中含RNA和多糖，然后用乙醇使RNA沉淀，四种物质一步便可初步分离开。苯酚法是目前提取不降解的RNA最有效的方法，其应用举例如下：肝脏rRNA的提取：按肝重（鲜）加入10倍容积苯酚-甲酚混合液（500g苯酚及70ml 甲酚于50ml蒸馏水中，另加入0.5g 8-羟基喹啉配成）及10倍容积的0.5%萘-1，5-二磺酸水溶液（g/v）做匀浆后在20搅拌20min。肝脏细胞核内mRNA的提取：先分离细胞核，再将核悬浮于3倍容积的0.5%pH6.5的萘二磺酸水溶液（g/v）中匀浆后加入等量90%（g/v）苯酚水溶液（内含0.1% 8-羟基喹啉）在2振荡提取30min。酵母tRNA的提取：100g酵母（湿重）加入200ml水，300ml 90%苯酚水溶液，振荡2h,4冰箱中过液，使之提取完全。以上介绍了用冷酚法提取各种RNA的一些实例，近来还有皂土酚法（即除苯酚外还加入皂土吸附蛋白质）提取RNA，据报道比普通酚法提取RNA的生物活性高10倍左右。但应用苯酚法提取核酸时，须注意市售苯酚常含有少量重金属和杂质，可能导致核酸降解，使用时，一般需要减压重蒸。在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。 防止RNA酶污染的措施： 所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 常用的RNA酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNAsin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNAsin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。22 DNA的提取DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA提取过程中应做到1,根据不同研究需要，保证结构的相应完整性；2,尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3,保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。下面结合不同的研究对象列出几种相应的DNA提取方法。DNA主要存在于细胞核中，天然状态的DNA绝大多数是以脱氧核糖核蛋白形式存在。利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来。也可用0.15M NaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1M NaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白。两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些（即浓盐法）。 以稀盐溶液提取DNA 时，加入适量去污剂,如SDS或二甲苯酸钠可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用0.15M NaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA（即阴离子去污剂法）。应用苯酚法也可以提取DNA而且不用经过脱氧核糖核蛋白这一步骤，苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。例如大鼠肝匀浆在6%对氨基水杨酸盐溶液内，加入同体积90%苯酚水溶液，室温下提取1h，再经进一步提纯可获得98%99%纯度的DNA。苯酚法也是目前提取DNA最常用的方法之一。 也可利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% 、80%和95%乙醇以及丙酮洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。（即水抽提法）2.3 常用的沉淀分离法核酸（nucleic acid）是生物体内一类含有磷酸基团的重要的生物大分子，担负着生命信息的储存和传递。核酸蛋白质复合物叫核蛋白。核 碱性蛋白（加氯仿-异戊醇可使之变性沉淀）酸 核酸：RNA（核糖核酸）、DNA（脱氧核糖核酸） 核酸溶于水而不溶于有机溶剂,所以核酸一般采用水溶液提取,而沉淀分离则可采用有机溶剂沉淀法.有机溶剂沉淀法: 加乙醇或2乙氧基乙醇使DNA或RNA沉淀。等电点沉淀法: DNA的 pI4.2 RNA的 pI2.02.5 tRNA的 pI5钙盐沉淀法: 加入一定体积比(一般为110)的10%氯化钙溶液,再加1/5体积的乙醇，DNA以钙盐形式沉淀析出。选择性溶剂沉淀法: 氯仿戊醇或氯仿辛醇除(沉淀)蛋白质,异丙醇沉淀DNA.。3.核酸的鉴定3.1紫外吸收法鉴定嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值，其吸光率（absorbance）以A260表示，A260是核酸的重要性质，在核酸的研究中很有用处。在230nm处为吸收低谷，RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的核酸溶液，测定A260，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1gmL的核酸水溶液在260nm处的吸光率，天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020，变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。通常以1OD值相当于50gmL双螺旋DNA，或40gmL单螺旋DNA（或RNA），或20gmL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又相当准确，而且不会浪费样品。3.2电泳法鉴定（见第二章）。3.3 PCR扩增法鉴定（见第七章）等。第二章 电泳1.电泳技术概论电泳法是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可用于分离不同分子量的核酸片段。凝胶电泳操作简便、快速，可以分辨用其它方法(如密度梯度离心)所无法分离的核酸片段，是分离、鉴定和纯化核酸的一种常用方法。 2.电泳技术的发展简史电泳现象早在1890年就被发现，1907年有人曾在琼脂中电泳，研究白喉毒素； 1937年由Tiselius制成界面电泳仪，并开始用于蛋白质的研究。从此，人们才逐渐认 识到电泳技术对于生物科学研究是一种重要工具。然而，界面电泳结构复杂。价格昂 贵难于普及。1940年左右。以纸为支持物的电泳问世后，电泳技术得到迅速发展。电泳技术以支持物分，可分为纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳，琼 脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。经凝胶形状分有水平平板电泳，园盘柱 状电泳及垂直平板电泳。各种类型的电泳技术概括如表。表 电泳技术的种类类 别名 称用支持体的电泳技术1.纸上电泳2.醋酸纤维薄膜电泳3.薄层电泳 4.非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)5.凝胶支持体区带电泳 淀粉液 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂（糖）凝胶不用支持体的电泳技术1.Tiselius或微量电泳2.显微电泳 3.等电点聚焦电泳技术4.等速电泳技术5.密度梯度电泳 各类电泳技术已经广泛地用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。例如用醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白，用琼脂对流免疫电泳分析病人血清，为早期诊断原发性肝癌提供资料。用高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构。用高压电泳和层析结合研究核酸的一级结构。凝胶龟泳技术在分离分析酶，蛋白质，核酸等生物大分子方面具有较高的分辩力，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。3.电泳技术的基本原理在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。FQE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F6r式中r为质点半径，为介质粘度，为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：FF即QE6r。可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。3.1影响电泳迁移率的因素同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同。常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下泳的速度。影响泳动度的主要因素有： 首先决定于带颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反 之则慢。泳动度还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，泳动度与颗表面电 荷成正比，与介质粘度及颗粒半径反比。带电荷的高分子在电解质溶液中把一些带有 相反电荷的离子吸引在其周围，形成一离子扩散层。加以电场时，颗粒向符号相反的 电极移动即带阳电荷颗粒移向负极，带阴电荷颗粒移向正移；离子扩散层由于带有过 剩的与颗粒符号相反的电荷，可以向相反方向移动。结果颗粒与离子扩散之间的静电 引力使颗粒的泳动度减慢，另外，高分了颗粒表面有一层水，在电场影响下，它与颗 粒一起移动，可以认为是颗粒的一部分。电场强度电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那么电场强度为200V/20cm10V/cm。当电压在500V以下，电场强度在2-10v/cm时为常压电泳。电压在500V以上，电场强度在20-200V/cm时为高压电泳。电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。溶液的pH值溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。例如蛋白质分子，它是既有酸性基团（-COOH），又有碱性基团（-NH2）的两性电解质，在某一溶液中所带正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，蛋白质在电场中不再移动，溶液的这一pH值为该蛋白质的等电点（isoelctric point，pI）。若溶液pH处于等电点酸侧，即pHpl，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。若溶液pH处于等电点碱侧，即pHpl，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。溶液的离子强度电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其周围，形成一个与运动质点符合相反的离子氛（ionic atmosphere），离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。然而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关。可用离子强度I表示。电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。4.凝胶电泳技术类型电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较广泛。本节仅对常用的几种区带电泳分别加以叙述。以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广，分别介绍如下：4.1琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。 在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：（1）琼脂含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附 极微。（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3） 电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（5） 区带易染色，样品易回收，有利于制止备。然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。 琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。离子强度过 高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结 晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。 为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液，混匀后再用。琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术 在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA直线DNA开环双链DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。 设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。仪器设备应包括凝胶电泳槽及其配套电泳梳、稳压电泳仪、微波炉或普通电炉。同时配备紫外线检测仪和照相系统。 试剂包括琼脂糖、电泳缓冲液、溴化乙锭溶液、凝胶加样缓冲液。 电泳缓冲液常用TBE(1 000ml中含5.4g Tris，2.75g硼酸，2ml 0.5 mol/L EDTA，pH8.0或0.08mol/L TrisHCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/L EDTA) 和TAE（0.04mol/L TrisHCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸钠，0.0018mol/L EDTA）。 溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，它可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在电泳过程中随核酸片段迁移，将凝胶置紫外光下，插入核酸链中的EB在紫外线激发下产生红色荧光，可清楚显示各核酸片段的迁移。EB见光易分解，应存棕色试剂瓶中于4下保存。由于 EB是一种强的诱变剂并有中度毒性，使用时必须戴手套操作。 凝胶制备：用上述缓冲液配制0.5-0.8琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5g/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。 样品制备与加样：溶解于TBE或TAE内的样品应含指示染料（0.025溴酚蓝或桔黄橙）、蔗糖（10-15）或甘油（5-10），也可使用2.5Fico 增加比重，使样品集中，每齿孔可加样5-10g。 电泳：一般电压为5-15V/cm。对大分子的分离可用电压5V/cm。电泳过程最好在低温条件下进行。 样品回收：电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况，对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收，如电泳洗脱法：在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶，将其装入透析袋（内含适量新鲜电泳缓冲液），扎紧透析袋后，平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中，100V电泳2-3小时，然后正负电极交换，反向电泳2分钟，使透析袋上的DNA释放出来。吸出含DNA的溶液，进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收。（6）技术流程1.用封边带封住塑料托盘开放的两边或清洁干燥的玻璃板的边缘形成一个模具，置一个水平支架上。2.配制足量的电泳缓冲液（1TAE或0.5TBE）用以灌满电泳槽和配制凝胶。 配胶和灌满电泳槽使用同一批缓冲液。3.根据欲分离DNA片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。缓冲液体积应小于烧瓶或玻璃瓶容积的50%。4.用Kimwipes松松地塞住三角烧瓶颈部，如用玻璃瓶一定松松盖住。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。5.用隔离手套或夹子转移三角烧瓶或玻璃瓶到55水浴。待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭，终浓度为0.5g/ml。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。6.琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置在托盘底面上0.51.0mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。7.浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。凝胶适宜厚度为35mm。8.让凝胶溶液完全凝结，室温下3045min。加少量电泳缓冲液于凝胶顶部，小心拔出梳子。倒出电泳缓冲液。轻轻撕去封边胶带，将凝胶安放到电泳槽内。9.向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm。10.混合DNA样品和0.2倍体积6载样缓冲液。11.用微量移液器及一次性吸头，或拉长的巴斯德吸管，或玻璃毛细管将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。分子质量标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。12.关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA应向阳极（红色插头）侧泳动。给予15V/cm的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。如电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡，并且几分钟内溴酚蓝从加样孔迁移进入胶体内。待溴酚蓝和二甲苯氰FF迁移到适当距离后再停止电泳。13当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔出电极插头和打开电泳槽盖。若凝胶和缓冲液有溴化乙锭（0.5g/ml）的水或电泳缓冲液中室温浸染3045min，或者用电泳缓冲液1：10 000稀释的SYBR Gold贮备液浸染。4.2中性聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理聚丙烯酰胺凝胶通过丙烯酰胺单体、链聚合催化剂N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵以及交联剂N，N-亚甲双丙烯酰胺之间的化学反应而形成。丙烯酰胺单体在催化剂作用下产生聚合反应形成长链，长链经交联剂作用交叉连接形成凝胶，其孔径由链长和交联度决定。链长取决于丙烯酰胺的浓度，调节丙烯酰胺和交联剂的浓度比例，可改变聚合物的交联度。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别达到分离目的，兼具分子筛和静电效应，分辨力高于琼脂糖凝胶电泳。可分离只相差1个核苷酸的DNA片段。 聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分析和制备长度小于1kb的DNA片段。根据所要分离的核酸片段大小，可制备不同浓度的凝胶。 凝胶的制备和电泳由于氧能抑制丙烯酰胺的聚合反应，灌制聚丙烯酰胺凝胶常在两块封闭的玻璃平板所形成的夹层间进行。在这种装置形式下，仅有顶层的凝胶与空气中的氧气相接触，从而大大减少了氧对聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝胶电泳一般采用垂直装置。 凝胶的制备和电泳操作如下：(1) 配制试剂溶液A：取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。溶液B：取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。电极缓冲液(pH8.3)：取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。溴酚蓝指示：取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90乙醇5ml,微热使溶解，加20乙醇制成250ml。染色液：取0.25(W/V)考马斯亮蓝G溶液2.5ml，加12.5(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。稀染色液：取上述染色液2ml，加12.5(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。脱色液 7醋酸溶液。30丙烯酰胺：100ml双蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N，N-亚甲双丙烯酰胺。5TBE：每升溶液含54g Tris.HCl，27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。10过硫酸铵：10ml双蒸水中含1g过硫酸铵。(2) 装置胶模：将玻璃板和垫条事先用去污剂刷洗，并经自来水和无离子水冲洗干净，晾干。装置时，将较大的玻璃板平放在工作台上，将两个垫条放在玻璃板两侧，涂上少量凡士林，并将上层玻璃板置于垫条上，用夹子将玻板连同垫条夹紧，底部用1琼脂糖密封。为防止漏胶，除放梳子一边外，其余三边应用防水胶带密封。(3) 根据玻璃板大小及夹层厚薄计算所需凝胶溶液量。聚丙烯酰胺凝胶电泳操作法(1)制胶：取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡， 加0.56过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(100.5cm)中,使胶层高度达67cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。(2)标准品溶液及供试品溶液的制备：照各药品项下的规定。(3)电泳：将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50100l，为防止扩散可加甘油或40蔗糖溶液12滴及0.04溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA，数分钟后，加大电流使每管为23mA，当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处，关闭电源。(4)染色和脱色：电泳完毕，用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部沿胶管壁将水压入，胶条即从管内滑出，将胶条浸入稀染色液过夜或用染色液浸泡1030分钟，以水漂洗干净，再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的底色透明为止。 (5)结果判断将胶条置灯下观察，根据供试品与标准品的色带位置和色泽深浅程度进行判断。相对迁移率供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率(R)进行比较。其计算式如下：进胶端到供试品或标准品区带的距离相对迁移率(R)进胶端到溴酚蓝区带的距离扫描将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并积分，由各组分的峰面积计算百分含量。第三章 分子生物学中常用的工具酶分子生物学中基因的重组与分离，涉及到一系列相互关连的酶促反应。已知有许多种酶在基因克隆实验中有着广泛的用途。1.限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，共有、 三类。类和类限制性内切酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖于ATP的限制性切割活性。类限制性内切酶结合于识别位点，随机切割DNA，类限制性内切酶在识别位点切割DNA。在分子克隆中和类限制性内切酶都不常用。类限制性内切酶是由两种酶分子组成的复合体系，一种具有限制性内切酶功能，切割某一特异的核苷酸序列，另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。绝大多数类限制性内切酶识别长度为47个核苷酸且呈二重对称的特异序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列。切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异：一些酶恰在对称轴处同时切割DNA的两条链，产生平端的DNA片段；而另一些酶则在对称轴两侧相类似的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端的DNA片段。在分子克隆中常使用类限制性内切酶见附录。影响限制性内切酶的因素很多。DNA制品中的污染(如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度盐等)均能抑制酶切活性。这种抑制可通过增加酶作用单位数(10-20UugDNA)，增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。应用：限制性内切酶切割位点提供了DNA物理图谱的特异性标记；酶切产生的特异性片段可用分子克隆的手段加以纯化；酶切产生的片段为各种各样的其他DNA酶学操作提供了基本底物。2.连接酶2.1 DNA连接酶 催化双链DNA分子中相邻碱基的5P和3OH间形成磷酸二酯键。2.1.1 T4 DNA连接酶 是从T4噬菌体感染过的大肠杆菌中分离出来的，既可催化粘性末端间的连接，也可催化平末端间的连接，需要ATP