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定量PCR技术 （Real-time PCR）(仅作教学参考)定量PCR的技术原理：定义：定量PCR指估算样本中的原始摸板数。它是通过一定循环次数的PCR的扩增后，PCR产物量来判断品质的原始摸板数。原理：定量PCR是以PCR扩增为基础的，而PCR扩增是有规律可循的。定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。如果用No代表PCR反应中的原始模块数，N为扩增次数，那么扩增产物的初期直线增长：而经过一定循环次数扩增后，进入平台期。定量PCR就是在指数增长期实现对原始摸板定量的（备注：在指数增长期内N=No(1+e)n， 如果知道扩增的产物量N及PCR扩增的效率e，便可知道原始模块No值。）荧光定量PCR(FQ-PCR)技术融汇PCR和DNA探针杂交技术的优点，直接PCR过程中荧光信号的变化，根据PCR反应酶动力学特点，获得DNA模板的准确定量结果。定量PCR（Real-time Polymerase Chain Reaction）是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。（1）Sybr Green I 检测模式。温度循环为945572C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。 （2）解探针模式（Taqman）Hydrolysis Probe 。温度循环为9460C二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶53外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶53外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶53外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（Tm）要求其高于60C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。 PCR可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过对光密度扫描来进半定量的分析。无论定性还是半定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一特定基因在特定组织中的表达量。早期定量PCR技术需要特别的训练，严格的测试和特别准确的加样。早期定量PCR技术的难点主要在于：如何确定PCR正处于线性扩增范围内（只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例），为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。所谓的实时荧光定量PCR，其反应体系中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线（如图1）。一般而言，荧光扩增曲线可以分三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期 。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量 与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值 ，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（threshold value）（如图2所示）。定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。对某一样品的C（t）值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数（如图3所示）。因些只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。SYBR Green 荧光染料目前荧光实时定量 PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：内嵌染料（SYBR Green ）、双标记探针、FRET探针、分子信标和Ampliflor。其中SYBR Green 染料法不需要设计合成序列特异性探针和新的引物对，是一种简便，性价比较高的实时监测方法，常常被用于进行RNA表达相对定量以及DNA定量研究中。SYBR Green 是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射强荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子仅有微弱荧光信号背景，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增。此外，由于一个PCR产物可以与多个分子的染料结合，因此SYBR Green的检测灵敏度很高。但是，由于SYBR Green与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBR Green Real-Time PCR定量结果。在PCR结束后，我们可以根据变性过程中的荧光值变化绘出每个样品的熔解曲线。绘制熔解曲线时，Real-Time PCR 仪连续监测每个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过和中荧光值的变化过程。不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而在不一样的温度下解链，当产物解链时，SYBR Green的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘制出荧光强度随温度变化的负一次倒数图。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为熔解峰值。熔解曲线是扩增反应的质控途径，当图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。荧光定量PCR技术的应用实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定是量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们不定期可以对PCR产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体。以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：4.1 病原体的定量监测及治疗药效评价 荧光PCR定量范围极宽，可以准确定量出103至108个拷贝数的病原体，具有重要的临床诊断价值23-24.以乙肝为例，表面抗原强阳性的患者血清中可测得高达每毫升105-108的病毒颗粒，随着治疗的进程，病毒拷贝数逐步降低，部分患者完全治愈后，血清中病毒数量便测不出.多数患者在抗原转阴后，血清PCR反应仍呈阳性，常规PCR无法得出治愈与否的判定，而采用荧光定量PCR则可以测到每微升血清含10-1 000个病毒颗粒.据此，可建立乙肝治愈的分子诊断标准.目前已广泛用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测.4.2 基因的点突变及单核苷酸多态性(SNP)分析 人的部分疾病是由基因的点突变引起的如人的地中海贫血病，因此对相关基因的检测具有重要意义.基因点突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变位点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交.两条探针用两种不同的发光基团标记.如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体的稳定性，从而降低其熔解温度.这样便可对基因的突变和多态性进行分析.4.3 肿瘤基因的检测和诊断 肿瘤基因的病理性扩增可产生过量的表达蛋白如乳腺癌组织C-erbB-2表达阳性率可达50%左右，p53阳性也在50%左右，还可表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加，这两种变化都可通过荧光PCR的方法进行检测.肿瘤基因的检测中主要检测以下几种常见癌基因C-erbB2、c-myc、N-myc、K-ras、int2、N-ras、Mdm2、C-fas、K-sam、Met.4.4 DNA指纹及个体识别 人的肌红蛋白小卫星基因，b-珠蛋白基因、apob等基因具有多态性而且在不同的个体中其重复次数也是有差异的.这种基因的多态性和重复次数的差异性已被应用于个体识别、亲子关系鉴定及法医物证.其灵敏度已达到可以从一根头发、一个细胞、一个精子取得具有个体特征的DNA指纹图谱，目前其应用领域已发展到骨髓、器官移植配型及动物遗传种系的研究中.4.5 转基因产品的检测 随着现代生物技术的发展，转基因食品已逐步进入普通百姓的生活.由于转基因食品所具有的潜在非安全性，食品的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视，基于转基因食品所含特异DNA片段的荧光PCR检测方法已广泛应用于食品的检测.目前主要检测转基因作物中特有的启动子35S、终止子NOS、耐除