硫黄菌多糖的提取与红外谱测定毕业论文

目录摘要:41.真菌多糖的研究51.1 真菌多糖研究概况51.2 真菌多糖的生物活性61.2.1多糖的免疫调节作用61.2.2 抗氧化作用61.2.3 抗溃疡作用62.实验操作与方法62.1 硫黄菌粗多糖的提取62.1.1实验药品与仪器62.1.2 仪器的使用72.1.2.1 旋转蒸发器的使用72.1.2.1.1 工作原理72.1.2.1.2 操作方法72.1.2.2循环水真空泵的使用72.1.2.2.1水循环式真空泵工作原理72.1.2.2.2循环水真空泵的使用方法72.1.3 实验操作72.1.3.1 硫黄菌多糖的粗提取72.1.3.2 滤液浓缩72.1.3.3 粗多糖的制备82.2除蛋白质82.2.1 材料、药品与仪器82.2.1.1 实验材料82.2.1.2 药品与仪器82.2.2 实验操作82.3 硫黄菌多糖的纯化82.3.1 药品与仪器82.3.1.1 药品82.3.1.2 仪器82.3.2 药品的配制42.3.2.1 NaCl溶液的配制82.3.2.2 苯酚溶液的配制82.3.2.3 0.5molL NaOH溶液的配制92.3.2.4 HCl溶液的配制92.3.3 离子交换柱的分离原理92.3.4 分离柱的活化92.3.5 装柱92.3.6 多糖的纯化92.3.7 多糖的检测102.3.7.1 检测的原理102.3.7.2 实验操作102.3.8再浓缩102.3.9透析103.结果与讨论103.1硫黄菌粗多糖的制备103.2 硫酸-苯酚法检测硫黄菌多糖103.3 采用DEAE纤维素交换柱纯化硫黄菌多糖。103.4硫黄菌多糖的红外谱测定114 .结论125.参考文献12致谢13硫黄菌多糖的提取与红外谱测定生命科学学院生物技术专业2013级 指导教师： 摘 要:食药用真菌多糖在国际上被称为“ 生物反应调节剂”, 简称 BRM, 作为一种生物非特异性免疫促进剂,具有抗肿瘤、抗病毒、降血脂、促进核酸和蛋白质生物合成等多种生物功效。硫黄菌是一种常见的食用和药用价值都很高的真菌；随着药用真菌多糖研究的不断深入和发展,发现硫磺菌多糖具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性，是一种纯天然无毒副作用的成分。但关于硫黄菌多糖的提取和成分的检测却很少，本实验以硫黄菌为原料,系统地研究了硫黄菌多糖的分离纯化技术,对纯化后所得的多糖的理化性质和单糖组成进行了初步探讨。这段删掉，摘要主要写目的，方法，结果以硫黄菌子实体为材料，采用水浸提多糖，醇沉浸提浓缩液，乙醇除蛋白，DEAE-52离子交换纯化多糖，再浓缩、透析的方法，获得了硫黄菌多糖，并经硫酸-苯酚法检测，且与对照组比较，呈较明显的多糖阳性显色反应，其颜色的变化与含量呈正相关。硫黄菌多糖在扫描电镜下显示为针状结晶，晶体规整，透明度高。红外谱显示其在3416.00 cm-1、2928.00 cm-1这个照着我给你分析的那段写，在后面等处有明显多糖特征峰出现，且成分单一，无其他结构特征峰，表明该多糖为一种纯品多糖，该研究结果为其结构的进一步确定和活性的研究奠定了基础。关键词：硫黄菌；多糖；提取红外谱The extraction of Polysaccharide from sulfur and infrared spectroscopyCollege of Life Science Grade 2013 Instructor: Abstract: The polysaccharides from edible and medicinal fungi in the world known as the biological response modifiers, referred to as BRM, as a kind of biological nonspecific immune enhancer, anti-tumor, antiviral, hypolipidemic, promote the biosynthesis of nucleic acid and protein and other biological effects. Sulfur fungi is a kind of common edible and medicinal value is very high fungi; with the deepening of the study of medicinal fungi polysaccharides and development, found that sulfur fungi polysaccharides have antiviral, antitumor, immune regulation and other biological activity, is a kind of pure natural non-toxic ingredients. But rarely detected on the extraction and composition of polysaccharide of sulfur fungi in this experiment, sulfur fungi separation and purification of raw materials, systematically studied the sulfur fungi polysaccharide, purification of the polysaccharide physicochemical properties and monosaccharide composition werediscussed. Taking sulfur fruitbody as materials, by using water immersion extraction Sugar, alcohol extract of ethanol immersion, protein removal, DEAE-52 ion exchange purified polysaccharide, concentrate, dialysis method, the sulfur fungi polysaccharides, and the phenol sulfuric acid assay, and compared with the control group, a polysaccharide positive color reaction obviously, positive change and content of its color the sulfur fungi polysaccharides. Under the scanning electron microscope showed acicular crystal, crystal structured, high transparency. The infrared spectrum shows that it has a significant polysaccharide characteristic peak appeared at 3416 cm-12928.00 cm-1, and the single component, other structural characteristic peaks show that the polysaccharide is a pure product of polysaccharide, the study results laid the foundation for the research of the structure and to further determine the activityKey words: Sulfur fungus; polysaccharide;extraction;infrared spectrum前言迄今为止，人类对核酸和蛋白质的研究取得了重大进展，推动了生命科学及相关科学领域发展，多糖将成为最后一类有待攻破的生物活性大分子。多糖的来源大致分为植物来源多糖、动物来源多糖和微生物来源多糖，真菌多糖即真菌产生的多糖。多糖是由单糖组成的天然高分子化合物，广泛存在于植物、动物和微生物组织中。真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的,可以控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老的一类活性多糖。经研究表明，多糖具有生物反应调节物的特征，可作为免疫增强剂和免疫激活剂; 此外，它还具有抗细菌、抗病毒和抗凝聚的作用，提高肝功能和解毒力，提高动物耐缺氧能力和氧的利用率，降低血液的粘稠度，增加心肌收缩力，改善心律，降血糖、镇静、镇痛、平喘、止咳、化痰的功效。因此，对真菌多糖的成分进行进一步研究和测定具有重要的意义。1 真菌多糖的研究1.1 真菌多糖研究概况糖类的生命科学几乎与蛋白质的生命科学同时诞生；但是糖类研究远远落后于蛋白质和核酸的研究。多糖广泛存在于动物细胞膜，植物和微生物细胞壁中,是一类天然高分子化合物。它是由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物，是构成生命的四大基本物质之一。真菌多糖的科学研究始于20世纪50年代末对真菌多糖抗癌效果的发现；随着对多糖结构的逐步深入了解，多糖化合物的生物活性研究得以迅速发展；研究对象包括真菌类、地衣类和植物花粉研究，范围涉及多糖的分离纯化、结构分析、理化性质以及临床应用等1。尤其对多糖免疫增强作用机制的研究已深入到分子和受体水平。真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的可以控制细胞分裂分化和调节细胞生长衰老的一类活性多糖。真菌多糖具有很强烈的抗肿瘤活性，对癌细胞有很强的抑制力。当前，对真菌多糖的研究主要包括两方面；一是真菌多糖的提取纯化及结构分析；二是利用一些免疫指标分析其生物活性及免疫机理。1.2 真菌多糖的生物活性近年来在多糖化合物的研究中发现来自真菌的多糖化合物具有很强的生物活性；如具有调节免疫功能及抗肿瘤作用。近50年来已有大量关于真菌多糖生物活性的研究报道，主要集中在免疫调节、抗氧化、抗溃疡等方面。1.2.1 多糖的免疫调节作用多糖不仅能激活巨噬细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞和杀伤细胞等免疫细胞。还能促进细胞因子生成活化补体，从而在抗肿瘤、抗病毒、抗感染以及抗衰老等的防治上具有独特的功效。龚晓健等插入文献研究了人工虫草胞内与胞外多糖对非特异性免役功能的影响，结果表明人工虫草胞查文献内与胞外多糖能显著地增加细胞的吞噬指数并增强单核巨噬细胞的吞噬功能；此外，胞内多糖能显著地增加小鼠耳朵的肿胀度并且提高提高溶血水平。1.2.2 抗氧化作用已发现许多真菌多糖具有清除自由基，提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的活性，起到保护生物膜和延缓衰老的作用2。实验证明实验证明？什么实验，找文献填在这,从长白山野生云芝中提取的彩云多糖给受射线全身照射的小鼠能使多种脏器和细胞内SOD活力升高，并使脂质过氧化物水平下降。1.2.3 抗溃疡作用通过实验证明同上:人参果胶、糊精等都有利于不同程度的降低胃酸和抑制胃蛋白酶活性的作用。从制备鹿茸精废渣里获得的多糖中发现其有降低胃酸，抑制胃蛋白酶活性和升高胃液PGE2水平的作用。2 实验操作与方法2.1 硫黄菌粗多糖的提取2.1.1 实验药品与仪器超净水、无水乙醇、漏斗、玻璃棒、烧杯、纱布、中兴牌FZ102粉碎机、上海亚荣RE6000旋转蒸发器、亚荣SHZ-循环水真空泵、JA1003电子天平、YaRong RE-86水浴锅、透析袋，恒温烘箱、酶标仪。2.1.2 仪器的使用2.1.2.1 旋转蒸发器的使用2.1.2.1.1 工作原理在真空条件下，恒温加热，使旋转瓶恒速旋转，样品在瓶壁形成大面积薄膜，高效蒸发。蒸气经高效玻璃冷凝器冷却，回收于收集瓶中，大大提高蒸发效率。特别适用于对高温容易分解变性的生物制品的浓缩提纯。2.1.2.1.2操作方法将上好样的玻璃球与仪器连接好，向不锈钢锅里加入适量的水，调节升降按钮将不锈钢锅调到合适高度；打开旋转按钮，检查仪器是否连接完好，将锅升打开电源开关，调节转数为40rpm,温度设置为90。使用完毕，先将转数调节到“0”，再关闭电源。2.1.2.2 循环水真空泵的使用2.1.2.2.1 水循环式真空泵工作原理在泵体中装有适量的水作为工作液。当叶轮顺时针方向旋转时，水被叶轮抛向四周，由于离心力的作用，水形成了一个决定于泵腔形状的近似于等厚度的封闭圆环。水环的下部分内表面恰好与叶轮轮毂相切，水环的上部内表面刚好与叶片顶端接触。此时叶轮轮毂与水环之间形成一个月牙形空间，而这一空间又被叶轮分成和叶片数目相等的若干个小腔。如果以叶轮的下部0为起点，那么叶轮在旋转前180时小腔的容积由小变大，且与端面上的吸气口相通，此时气体被吸入，当吸气终了时小腔则与吸气口隔绝；当叶轮继续旋转时，小腔由大变小，使气体被压缩；当小腔与排气口相通时，气体便被排出泵外。2.1.2.2.2 循环水真空泵的使用方法使用之前应先检查电压正常、不超过额定电压（380V）5%、电气开关和设备接地线正常、泵各部件连结是否可靠、各部位润滑油是否足够、真空度调节阀应调整至合适的开度。使用时，先打开冷凝水，关闭旋转蒸发器排气阀，打开真空泵开关，打开旋转蒸发器电源，调节转数。关闭时，先打开排气阀，直至气压回归为零，再关闭真空泵电源开关。2.1.3 实验操作2.1.3.1 硫黄菌多糖的粗提取将经过粉碎的硫黄菌粉料投入旋转蒸发器的浸提器中，加20倍量的超净水，搅拌，混合均匀，将仪器温度设置为90，蒸煮6h。蒸煮完毕，将料液离心，以4000rmin离心5min，收集残渣另行综合利用，按上述操作循环两次，将三次蒸煮离心后的上清液合并收集；待用。2.1.3.2 滤液浓缩第一次蒸煮的上清液大概有3000ml,为了节约试剂的用量，我们需将上清液进行浓缩，将上清液添加到旋转蒸发器的圆瓶内，将上清液进行浓缩。温度不超过60，转数40rpm左右，浓缩直至黏稠的程度即可，静置过夜；待用。2.1.3.3 粗多糖的制备采用醇沉法，用无水乙醇沉淀，主要成分是蛋白质和多糖。以4:1的比例加入无水乙醇和浓缩液，用玻璃棒轻轻搅拌，直至料液中乙醇浓度达到70%80%（V/V）位置，静置；让醇沉完全。将料液分装后放入离心机，以10000rmin离心5min。回收乙醇，得到的醇沉物为硫黄菌多糖，待用。将上清液和醇沉物分别收集好，以备后续工作使用。虽然大多数多糖都以糖蛋白的形式存在于沉淀物中，但还有少量的糖游离存在于乙醇中。将乙醇液体进行浓缩可以得到比较纯的硫黄菌多糖。将浓缩后的粗多糖液静置过夜。2.2 除蛋白质2.2.1 材料、药品与仪器2.2.1.1 实验材料沉淀的水溶物2.2.1.2 药品与仪器乙醇、正丁醇、铁架台、萃取瓶、玻璃棒、烧杯等。2.2.2 实验操作经典的除蛋白质的方法是用乙醇处理，按三分之一体积加入乙醇，混合振荡均匀，同时用玻璃棒搅拌，在搅拌的过程中会有絮状沉淀析出，把这些絮状沉淀收集，置于烘箱中烘干。乙醇液冷冻处理，把烘干的样品溶解于蒸馏水，离心后弃沉淀，将剩余的上清液浓缩，得到粗多糖。2.3 硫黄菌多糖的纯化2.3.1 药品与仪器2.3.1.1 药品需配制浓度为0.1-0.5mol/L梯度浓度的NaCl溶液、苯酚、DEAE纤维素、浓硫酸、NaOH颗粒、HCl溶液。2.3.1.2 仪器铁架台、10ml量程的移液枪、柱子、玻璃棒、漏斗、纱布、试管、烧杯、称量纸、勺子、三角瓶、PH试纸、滴管。2.3.2 药品的配制2.3.2.1 NaCl溶液的配制0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/LNaCl溶液的配制:分别准确称取5.85g、11.7g、17.55g、23.4g、29.25g的NaCl固体，加1000ml的超净水溶解即可。2.3.2.2 苯酚溶液的配制我们所用的苯酚浓度为1.0mol/L的浓度，准确称取苯酚固体9.4g,加100ml的超净水溶解。注意：一般苯酚我们是现配现用，因为苯酚极易被氧化。2.3.2.3 0.5molL NaOH溶液的配制准确称量NaOH固体20g，用1000ml的超净水溶解NaOH溶液，很容易与空气中的CO2反应，所用也是现配现用。2.3.2.4 HCl溶液的配制所用母液为浓HCl溶液，需将其稀释为浓度为0.5mol/L的HCl溶液，具体操作如下：配制1L的HCl溶液所需浓HCl的体积为41.5ml，然后加纯净水稀释就得到1L的0.5mol/L的HCl溶液。2.3.3 离子交换柱的分离原理离子交换层析根据分子量的不同、电荷的性质及电荷量的不同；常用的交换剂有DEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖和 DEAE-琼脂糖等，此法适合于分离各种酸性多糖、中性多糖和黏多糖。本次试验采用DEAE纤维素交换剂，其分离原理是：多糖在一般情况下带负电，DEAE纤维素所装的柱子是属于阴离子交换柱，在使用交换柱的时候应先将其活化，使柱子结合上氢氧根离子，在上样后，多糖离子会将氢氧根离子置换下来，这样多糖就被吸附上去，然后我们用不同浓度梯度的NaCl溶液将其洗脱下来，即得到我们想要的多糖，而蛋白质及其他的成分不能出柱。2.3.4 分离柱的活化先用所配制的NaOH(0.5mol/L)溶液浸泡纤维素，大约三小时；然后再用配HCl(0.5mol/L)溶液浸泡，时间一样；最后再用NaOH(0.5mol/L)溶液浸泡三时。活化后，我们应将纤维素调至中性，即用超净水浸泡，用PH试纸检测PH，反复如此直至PH试纸显示成中性即可。2.3.5 装柱用铁架台将柱子固定好，保持竖直，不能倾斜。将活化好的柱填料，轻轻地倒入柱内。柱子不宜过高，一般5cm即能满足实验要求。如果柱子太高，会造成扩散误差，使分离效果不好。装好柱子后，加满超净水，压柱。用玻璃棒将纤维素搅拌均匀，力度不能过大，直至柱内无气泡，而且柱面要平。如果柱内有气泡，会直接影响分离。2.3.6 多糖的纯化在加样之前，准备好数个干净的三角瓶。用移液枪准确吸取醇沉浓缩后粗多糖溶液5ml，然后沿着管壁轻轻地旋转加入，速度不能太快，否则会使柱平面产生凹陷，影响分离效果3。加样完毕之后，由于糖的黏度太大，走柱子走的很慢，可以加纯净水，使之产生压力，使柱子走的更快些。当加的超净水走完之后，用不同的浓度梯度的NaCl溶液洗脱，每次都加一柱子的量。在柱子下面用三角瓶接，每50ml换一次三角瓶。2.3.7 多糖的检测2.3.7.1 检测的原理常用的多糖的检测方法有：硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、碘量法、高效液相色谱法4。本次实验采用的是硫酸苯酚法，其原理是：多糖在强酸条件下水解为单糖分子， 再在沸水浴中脱水生成羟甲基糖醛，然后与苯酚缩合成砖红色化合物，在一定范围内颜色深浅与糖含量成正比5。2.3.7.2 实验操作设一个对照，对照组用超净水代替多糖溶液。用移液枪取多糖溶液2ml于试管中，向试管内轻轻地加大概一滴管的浓硫酸，最后加数滴配好的苯酚溶液，轻轻振荡。将过柱的液体每管取200uL加入到酶标仪的上样板中，调节紫外光的波长，将其设置为490nm。测定其中多糖的含量。 2.3.8 再浓缩将分离后检测有多糖的同一浓度梯度洗脱液洗脱出多糖的锥形瓶收集在一起进行浓缩，以备后用。2.3.9 透析为除低聚糖、氨基酸等小分子物质，把硫黄菌粗多糖浓缩液装入透析设备的透析袋中，用去离子水透析两天，用半透膜逆向流水透析可除去低聚糖、单糖、氨基酸、盐类离子等小分子杂质。透析处理完毕后，取出透析内液，待用。2.3.10 红外光谱测定取硫黄菌多糖样品2mg左右，KBr压片，红外分光光度计调至4000cm-1-400cm-1来对其进行测定。3 结果与讨论3.1 硫黄菌粗多糖的制备采用醇沉法，用无水乙醇沉淀蛋白质和多糖，乙醇溶液中仍有少量游离多糖，将乙醇液体进行浓缩可以得到比较纯的硫黄菌多糖，将浓缩后的粗多糖液静置过夜，出现块状晶体。3.2 硫酸-苯酚法检测硫黄菌多糖用硫酸-苯酚法检测硫黄菌多糖，并与对照组比较，呈较明显的阳性显色反应，证明确实为多糖成分。其颜色的变化与含量呈正相关，一般颜色越深表明其浓度越大。 3.3 采用DEAE纤维素交换柱纯化硫黄菌多糖将过柱的液体每管取200uL加入到酶标仪的上样板中，调节紫外光的波长，将其设置为490nm；测定其中多糖的含量。结果如图1所示，在多糖的柱层析纯化过程中，可以清楚地看到：不同浓度梯度的NaCl溶液洗脱后的溶液颜色对比相当强，由此可以看出不同浓度洗脱后的硫黄菌多糖浓度不同。同时；图4亦显示硫黄菌多糖的含量主要集中在前9管中，后面几乎没有多糖洗脱下来，说明多糖采用低离子浓度的洗脱剂时即可分离洗脱下来，不宜采用高离子浓度的洗脱剂，需控制洗脱剂的离子浓度，以免离子浓度太大，达不到分离的目的。图1 多糖的含量变化曲线3.4硫黄菌多糖的红外谱测定称取5mg硫黄菌多糖后，研磨成粉末，在与先前准备好的KBr粉末充分研磨混合，得到KBr的薄板。在傅里叶交换红外色谱仪中4000cm-1至400cm-1的范围内扫描测定。如图2所示，硫黄菌多糖在红外谱中显示3440.44cm-1和3213.30cm-1的宽吸收峰指定为O-H、N-H伸缩振动峰；3213.30cm-1的吸收峰为不饱和的C-H的伸缩振动区；1724.23 cm-1，1635.37 cm-1处的吸收峰为C=O的伸缩振动峰；1401.14 cm-1的吸收峰为C-H的弯曲振动峰；1310.84 cm-1,1189.84 cm-1,1109.81 cm-1的三处吸收峰表明为吡喃糖环；这一系列的吸收峰都为多糖的特征吸收峰。这段我已经改了图2.硫黄菌多糖的红外谱测定4 结论本研究以硫黄菌子实体为材料，采用水浸提多糖，醇沉浸提浓缩液，乙醇除蛋白，DEAE-52离子交换纯化多糖，再浓缩、透析的方法，获得了硫黄菌多糖，并经硫酸-苯酚法检测，且与对照组比较，呈较明显的多糖阳性显色反应，其颜色的变化与含量呈正相关。硫黄菌多糖在扫描电镜下显示为针状结晶，晶体规整，透明度高。红外谱显示其在3416.00 cm-1、2928.00 cm-1等处有明显多糖特征峰出现，且成分单一，无其他结构特征峰，表明该多糖为一种纯品多糖，该研究结果为其结构的进一步确定和活性的研究奠定了基础。参考文献：1 陈书明，郑卫红 赵保东，花菇成因的机理和发生过程.河南农业,2003（11）.2 杨德，周明，程薇，李露，高虹，史德芳，杜欣，陈明利，灵芝多糖提取纯化及抗氧化研究.湖北农业科学，Vol.49 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