油镜使用及革兰氏染色

显微镜的使用 教学目标掌握油浸镜的使用原理 二 染色原理和油镜的工作原理 1 油镜工作原理油镜的放大倍数最大 100 故镜头焦距短 直径小 但所需光照强度却最大 从标本片透过的光线是从玻片进入空气 再进入镜头 由于玻璃和空气的介质密度不同 有些光会因折射或反射而不能进入镜头 物象就显现不清 为了不使通过的光线有所损失 须在油镜与玻片之间加入折射率和玻璃 n 1 52 相仿的香柏油 n 1 515 故而称之为 油镜 转换器 其上装置各种不同放大倍数的物镜 用以转换物镜至使用位置上 聚光镜 位于载物台的下方 可以上下移动 以使光线集中于检查的标本上光圈 位于聚光镜之下 可以放大和缩小 用以调节进入聚光镜的光量 四 显微镜的使用1 取显微镜 右手握镜臂 左手托住镜座 2 打开电源 调节反光镜 使射入镜头光线最强 3 上提集光器 4 打开光圈 5 将标本片放在载物台上 用片夹固定 6 调节转换器 先使低倍镜对准中央 寻找适宜的视野 7 于标本片的欲检部位滴加香柏油 8 然后转换油镜镜头 使其对准中央 9 两眼对准目镜 向上转动粗调节器 直至见到模糊物像为止 10 转动细调节器 直至物像完全清晰为止 将载物台降至最低 取下标本片 将光量调至最小 关上电源 擦试镜头 先用干擦镜纸擦掉香柏油 再用滴加少量乙醚的擦镜纸擦试 最后再用干擦镜纸擦拭 4 低倍镜对准中央 5 将显微镜放入镜箱 还原 显微镜的维护 3 3 革兰氏染色法 革兰氏染色法将细菌分为G 和G 这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定 用结晶紫初染后 所有的细菌都染上蓝紫色 碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫 碘的复合物 增强了染料与菌体的结合力 用乙醇脱色处理时 两类细菌的脱色效果是不同的 G 细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成 且壁厚 类脂含量低 用乙醇脱色时使细胞壁脱水 网状结构孔径缩小 通透性降低 使得结晶紫 碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内 虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色 G 细菌则不同 由于其细胞壁肽聚糖层较薄 脂含量高 所以在脱色处理时 类脂被乙醇溶解 细胞壁的通透性增大 使结晶紫 碘的复合物比较容易被洗脱出来 用复染剂复染后 细胞被染上复染剂的颜色 3 4 实验器材1 显微镜 香柏油 接种环 酒精灯等 2 结晶紫染液 I 碘液 II 95 乙醇 III 稀释的石碳酸复红染液 IV 3 菌种 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 方法与步骤 涂片干燥固定染色洗涤干燥镜检 3 5 实验步骤 1 涂片取一块载玻片 用记号笔划分出两区域并做上记号 在两区域中央各滴半滴生理盐水 用接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴盐水中 和匀后涂成薄膜 2 干燥室温自然干燥或吹干 3 固定涂面朝上 通过火焰2 3次 4 染色在涂片薄膜上滴加结晶紫染液 使之覆盖2分钟 5 水洗傾倒去染液 斜置载玻片 用洗瓶小水流沿玻片边缘冲洗 直至水呈无色为止 3 6 6 媒染加媒染剂碘液使之覆盖1分钟 水洗 7 脱色滴加95 乙醇数滴 立即水洗 8 复染复红液复染30s 1分钟 水洗 吸干 注意事项 1 涂片不宜过厚 否则难以干燥 2 涂片时滴加无菌水不宜多 否则难以干燥 3 固定时 通过火焰速度宜适度 过快达不到固定目的 过慢易使菌体变形 绝不能在火焰上烤 招致原形毁坏 4 标本必须干燥 才能置于油镜下观察 3 7 实验结果观察两种细菌的形态和颜色 绘出油镜下细菌形态图 说明革兰氏染色的结果 思考题 1 通过实验 你认为革兰氏染色成功关键是那一步 为了避免假阳性或假阴性出